盧學新　伊瑤　蘇秋東　畢勝利

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1例HDV抗體 IgM陽性HBV S抗原陰性的肝炎患者分子診斷分析

盧學新伊瑤蘇秋東畢勝利

102206 北京,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

【摘要】目的為了進一步對臨床中可能出現(xiàn)HDV抗體IgM陽性，常規(guī)HBV 五項檢測陰性的特殊患者進行診斷，從而對HDV的感染進行準確的判定。方法設計HBV和HDV的特異引物，通過提取血清中病毒的核酸，擴增出病毒的基因組序列，使用BLAST在Genebank中進行比對。結果本實驗在這例血清中擴增到了HDV和HBV的基因序列，通過BLAST后發(fā)現(xiàn)擴增序列與HBV和HDV基因序列存在較高的一致性。結論在臨床診斷中，HDV感染者會出現(xiàn)血清中HDV抗體IgM陽性HBV S抗原陰性的特殊情況，應當引起臨床的重視。

【主題詞】HDV；共感染；丁肝抗體；分子診斷

丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷性病毒，必須在乙肝病毒存在的條件下才能進行傳播[1]。據(jù)估算，丁肝病毒感染者的數(shù)量約占乙型肝炎患者的5%，全球約有1700萬人發(fā)病[2]，在我國的流行病學調查中，丁肝患者在乙肝陽性的人群中的流行率約為2%～5%[3]。丁型病毒性肝炎通常與更嚴重的肝損傷和重度慢性肝炎相關，如果出現(xiàn)誤診會對患者的生命帶來嚴重的影響[4]。現(xiàn)在臨床上一般采用血清學方法對患者進行檢測，當血清中出現(xiàn)丁肝病毒特異性的抗體時，判定感染了丁肝病毒[5-9]。但其中少數(shù)患者乙肝常規(guī)五項檢測結果為陰性，這與丁肝病毒的生物學特性相悖，給臨床上對丁肝的診斷和治療帶來了困難。

本實驗收集了1例來自浙江某醫(yī)院的丁肝IgM陽性但乙肝S抗原陰性的血清標本，采用核酸檢測的方法，對標本進行進一步檢測。提取血清總核酸后，通過對丁肝RNA進行逆轉錄后，設計巣式PCR引物，擴增出丁肝基因組核酸的序列。同時對乙肝病毒進行Nest-PCR，擴增乙肝病毒的保守區(qū)。實驗證明臨床中存在丁肝病毒抗體IgM陽性但乙肝五項檢測均為陰性的特殊患者。

1材料與方法

1.1材料來自浙江省某醫(yī)院的血清一份，對血清進行了丁肝病毒IgG抗體，丁肝病毒 IgM 抗體，常規(guī)乙肝五項(HbsAg，抗-HBs，HbeAg，抗-HBe抗-HBc-IgG)檢測復核，結果分別為HDV IgM 陽性,HDV IgG陰性，常規(guī)乙肝五項檢查均為陰性。丁肝IgG和IgM檢測試劑盒購買自北京貝爾生物工程有限公司，乙肝五項檢測試劑盒購買自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，實驗中血清RNA/DNA提取試劑盒購買自德國Qiagen公司，膠回收試劑盒購買自六合通公司，引物合成和測序均由六合華大基因公司完成。

1.2血清中病毒核酸的提取血清中病毒DNA和RNA通過QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑盒提取，使用的血清為0.2 ml，最終使用20 μl的DEPC處理的高純水洗脫。所有操作按照說明書，通過德國Qiagen公司的自動核酸提取儀進行。提取的病毒RNA/DNA儲存于-80℃。

1.3丁肝病毒核酸的逆轉錄和Nest-PCR反轉錄試劑盒使用的是Thermo fisher公司的Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，丁肝病毒的RT-PCR反應體系1為10 μl，體系1的組成為1 μl的6 bp的random primer，1 μl的dNTP, 8 μl的血清核酸提取產物。體系2 的組成為1 μl的逆轉錄酶，4 μl 5X的buffer，0.5 μl的Ranse inhibitor 加水至10 μl。反應過程為體系1 先65℃水浴5 min后，立即冰浴3 min，然后加10 μl的體系2，整個RT-PCR的反應體系為20 μl。反應條件為30℃10 min，42℃ 1 h，70℃15 min，4℃，30 min。 反應后液體儲存于-20℃。

隨后進行丁肝的Nest-PCR，外側引物為上游引物wf-DM：5′-TTTCAAAGTGACCGAGGGGGGTGAC-3′; 下游引物wr-DM：5′-GGGGGTGTGAACCCCCTCGAAGGTG-3′.內測引物為: 上游nf—Dm: 5′- GCGTTCCATCCTTTCTTACCTGATG-3′；下游nr-Dm：5′- GACGAGAGAAGGGAAAGAAGAATAG-3′. 反應體系為50 μl，PCR的反應條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min。 30個循環(huán)后取1 μl作為模板進行第二輪PCR，反應條件和第一輪相同。反應結束后，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。隨后切取目標條帶。16℃反應連接至pUC18-T載體。轉化至DH5а菌株，挑取單克隆送往公司測序。

1.4乙肝病毒的Nest-PCR乙肝病毒的反應體系為50 μl，反應體系為2 μl的模板，上下引物各1 μl，25 μl的PCR mix，加去離子水補齊至50 μl。第一輪外側PCR的上游引物為:5′-AGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCG-3′，下游引物為：5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTC-3′。反應條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，4℃ 30 min，反應進行30個循環(huán)。第二輪內測PCR的上游引物是：5′-CCCGCAAATATACATCGTTTCCATG-3′，下游引物是：5′-ACAGTCTTTGAAGTATGCCTCAAGG-3′，PCR 反應條件同上。35個循環(huán)后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。切取目標條帶連接至TaKaRa公司的pMD18-T載體。轉化E.coliDH5а菌株，挑取單克隆送往公司測序。

1.5序列比對分析將測序結果使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的在線Standard Nucleotide BLAST工具進行比對，比對時的參數(shù)選擇默認選項，得到結果進行評價。

2結果

2.1丁肝病毒和乙肝病毒的PCR 結果通過對丁肝病毒特異性的巣式PCR后，丁肝病毒保守區(qū)擴增片段長度為381 bp，乙肝病毒的特異性序列的擴增是長度為320 bp，與預期大小相符。如圖1所示。

2.2測序后進行BLAST比對測序片段經過膠回收純化后，連接在pUCMD-18T載體上，進行測序。測序后的結果與Genebank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。

2.3丁肝病毒克隆序列BLAST比對結果對測序得到的381 bp的序列進行BLAST序列進行比對，比對的為Program BLASTN 2.3.1+，全部的381 bp均在數(shù)據(jù)庫中有匹配，與數(shù)據(jù)庫中有多條一致性達到99%的序列，在圖2中，顯示一致性較高的6條序列。這六條序列全部來自于HDV已有的測序結果，屬于HDV基因型Ⅰ型。因此可以推斷，從實驗樣本中PCR獲取到的序列是來自于丁肝病毒特異性擴增的序列，也證明了患者體內是存在丁型肝炎病毒。

表1　HDV克隆測序的blast比對結果

2.4乙肝病毒克隆序列Blast比對結果采用和HDV同樣的對比條件，經過序列比對后，目的序列與Genebank中存在一致性高達98%的序列，所有一致性較高的序列來自于HBV的分離株，分離株屬于基因型B型。由此證明，患者血清中分離到了HBV病毒，患者體內存在乙型肝炎病毒。

表2　HBV克隆測序的blast比對結果

通過Blast比對，擴增的丁肝病毒序列和乙肝病毒序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中的序列一致性在99%和98%以上，結果表明此例患者同時感染了乙肝病毒和丁肝病毒。在非肝移植的患者中，HDV的感染和HBV的感染時同時存在的，這是符合HDV生物學特性的，但血清學中會出現(xiàn)HDV IgM陽性而常規(guī)HBV 五項檢測陰性的結果，在臨床診療中也是實際存在的，應引起關注。

3討論

丁型肝炎病毒的病毒顆粒外層是乙肝病毒的表面抗原構成的雙層膜結構，在臨床采用的血清學檢測方法中，由于抗體不能識別被膜包裹的HDV抗原，所以臨床中多采用檢測血清中針對丁肝病毒抗原的抗體存在與否進行判斷是否被丁肝病毒感染[10]?，F(xiàn)在已經有了依賴丁型肝炎病毒核酸的檢測試劑盒，但由于丁肝病毒是RNA病毒，對血清的處理會導致臨床應用中不確定的因素增加，干擾對結果的判定?，F(xiàn)在臨床多數(shù)還是采用血清學方法對丁肝感染進行判定。血清學檢測中很多特殊的結果會影響對疾病的診斷，進而影響患者的治療，本實驗解釋了一種特殊型結果存在的可能。當前臨床診斷中采用的ElISA方法只能檢測到ng級別的抗體水平，這可能帶來假陰性的結果。不同廠家的試劑存在敏感性和特異性的差異，造成檢測結果的不同，也會影響檢測的可靠性。

丁型肝炎病毒可以通過共感染或是超感染兩種方式感染患者[11]，在超感染者中，患者已經是乙肝病毒的攜帶者或是處于乙肝病毒的復制期。此時丁肝病毒的復制會導致患者嚴重的肝損傷，加重病情的發(fā)展。由于患者體內預先存在針對乙肝患者的免疫反應，血清中的乙肝表面抗體檢測呈陽性反應。但在共感染的群體中，乙肝病毒和丁肝病毒同時感染機體，丁肝病毒在復制的過程中，會抑制乙肝病毒的復制。共感染的患者約90%～95%會恢復，并不能發(fā)展為慢性丁型病毒性肝炎，與超感染中僅僅5%～10%的恢復患者形成顯著性的對比[12]。這是丁肝病毒本身的生物學特征決定的。丁肝病毒抑制了乙肝病毒的復制，少量的乙肝病毒并沒有激發(fā)機體針對表面抗原特異的抗體出現(xiàn)，乙肝病毒的復制受到抑制，血清中的S抗原并沒有達到ELISA方法檢測的限度，這是本實驗中血清檢測結果出現(xiàn)的可能原因。應該進行更多的檢測，通過對大量臨床樣本的進一步檢測，對得到的病毒核酸序列進一步分析，對該病人進一步觀察，對實驗結果進一步驗證。有文獻報道可以在這類病人的血清中檢測到乙肝核心抗體的IgM為陽性，這可以說明HDV的感染時通過和HBV的共感染產生的。本例患者也應進行核心抗體IgM的檢測，可以對患者的感染情況進行更準確的判斷。

根據(jù)當前對HDV生命周期的研究，一旦機體被HDV感染，雖然沒有HDV病毒產物的出現(xiàn)，但是HDV可以在肝細胞內進行復制及產生抗原，這種不成熟的病毒缺少HBV的表面抗原不能排出細胞外。當機體再次被HBV感染時，表面抗原可以幫助HDV形成完整的顆粒，就會引起丁型病毒性肝炎，并且引起的肝損傷會較普通的病毒性肝炎更加嚴重?，F(xiàn)在已有土撥鼠模型證明了這種現(xiàn)象的存在，土撥鼠可表達丁肝抗原，當注射高滴度的WHBV血清時，血中出現(xiàn)了HDV的感染性的完整病毒顆粒。在臨床檢查中，如果出現(xiàn)HDV IgM陽性而HBV為陰性的患者，必須要對患者給予適當?shù)闹笇?，避免因為再次接觸HBV而引起更嚴重的肝臟疾病。

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.012

(收稿日期：2016-03-12)

Molecular diagnostic analysis of hepatitis patients with HDV IgM antibody positive and the HBV surface Antigen-negative

LuXuexin，YiYao,SuQiudong,BiShengli

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,ChangbaiRoad155,Beijing102206,China

【Abstract】ObjectiveIn order to further accurate diagnosis of the special serum with HDV IgM antibody positive but conventional HBV five detection negative. Methods designing the specific primers，by extracting the nucleic acid of the virus in the serum , amplifying the virus genome conservative region, and then blast the sequences in Genebak. ResultsIn this study, the HDV and HBV conserved regions were amplified in the serum, after blast, the amplified sequences were found to be consistent with the conserved regions of HBV and HDV. ConclusionIn clinical, HDV infection will appears in the serum of HDV antibody IgM positive but HBV S antigen negative, it should cause more attention in clinic for HDV infected.

【Key words】HDV；co-infection；antibody for HDV；Nucleic Diagnostics

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