石瑩　陳肖瀟　樊學(xué)軍　田綠波　楊雨　張薇薇

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·技術(shù)方法·

GeXP聯(lián)合多重PCR系統(tǒng)在腹瀉病毒檢測中的應(yīng)用

石瑩陳肖瀟樊學(xué)軍田綠波楊雨張薇薇

610041 成都，四川出入境檢驗(yàn)檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心(石瑩、陳肖瀟、樊學(xué)軍、田綠波、楊雨)；610500 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系(張薇薇)

【摘要】目的利用GeXP系統(tǒng)結(jié)合多重PCR技術(shù)，建立諾如病毒(GI和GII組)、輪狀病毒、星狀病毒的方法。方法根據(jù)4種病毒的序列特征，制備病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，收集病原體樣本，利用GenBank下載4種病毒的核苷酸序列，根據(jù)4種病毒的序列特征，利用GeXP express Profiler設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化條件使GeXP系統(tǒng)能夠特異性、快速的檢測對應(yīng)病毒。評價(jià)其靈敏度、特異性及功效，并應(yīng)用于120份臨床標(biāo)本檢測。結(jié)果優(yōu)化后的引物能特異性的檢測各病毒，無交叉反應(yīng)；靈敏度為100%，特異性為99.53%，功效為99.62%，與熒光定量PCR檢測結(jié)果一致性為99.51%，檢測濃度最低至5×103/μl拷貝，在已知臨床樣本靈敏度高、特異性好。結(jié)論GeXP方法的建立為快速、準(zhǔn)確的檢測這4種腹瀉病毒提供了便利，對口岸突發(fā)群體性腹瀉的病原體檢出有重要意義。

【主題詞】腹瀉病毒；GeXP；多重PCR

Fund programs: General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine Public Benefit Research Foundation of China (201210046)；General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine Research Foundation of China (2014IK064)；Sichuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Research Foundation (SK201402)

病毒性腹瀉因其傳播速度快，臨床上難區(qū)分，給診斷及治療帶來了極大的困難。引起病毒性腹瀉的主要病原體有輪狀病毒、諾如病毒、腸道腺病毒和星狀病毒等[1]。諾如病毒是成人病毒性腹瀉最主要的原因，其次依次為輪狀病毒、星狀病毒和腺病毒[2-3]。諾如病毒根據(jù)其基因特征，主要分為6個(gè)基因型，GI、GII 和GIV基因型主要感染人類，而GIII 和GV可感染豬、牛和鼠[4]。我國主要流行的諾如病毒基因型為GI、GII。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心2009-2013年對全國27個(gè)省份173家哨點(diǎn)醫(yī)院開展諾如病毒監(jiān)測，其中89.8%為GⅡ組病毒，10.2%為GI 組[5]。對這些病毒的鑒定，傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)及血清學(xué)檢測方法過程較繁雜，且耗時(shí)耗力，因此不利于口岸突發(fā)群體性腹瀉的快速制定疫情應(yīng)對措施[6-7]。

近年來，基于Multiplex-PCR及毛細(xì)管電泳開發(fā)出多重基因表達(dá)系統(tǒng)(GeXP)技術(shù)，使用通用引物實(shí)現(xiàn)多重PCR，最后用毛細(xì)管電泳分析PCR產(chǎn)物大小，使病原體檢測省去瓊脂糖凝膠電泳，并能同時(shí)檢測多達(dá)35種病原體，滿足實(shí)驗(yàn)室及臨床快速、準(zhǔn)確檢測的需求[8-10]。蘆春斌等[11]利用GeXP系統(tǒng)檢測人乳頭狀瘤病毒并分型；Fang等[12]利用GeXP系統(tǒng)同時(shí)檢測到乙型流感、甲型H1N1、H3N2和H5N1流感病毒，且靈敏度高，表明GeXP系統(tǒng)在病毒檢測方面具有巨大潛力。

目前，GeXP系統(tǒng)在腹瀉病毒檢測方面還未見報(bào)道。由于腸道腺病毒是DNA病毒，因混有DNA會(huì)干擾RNA檢測，DNA會(huì)被消化，無法檢測。因此本研究將探究建立一種GeXP系統(tǒng)用于檢測諾如I型病毒、諾如II型病毒、輪狀病毒、星狀病毒的方法。

1材料與方法

1.1材料諾如I型病毒、諾如II型病毒、輪狀病毒、星狀病毒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒由Invitrogen公司完成，并通過酶切線性化。病原體臨床樣本由四川省疾病預(yù)防控制中心提供(諾如I型病毒14份、諾如II型病毒37份、輪狀病毒35份和星狀病毒16份)。MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒、PrimeScript RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物科技有限公司。諾如病毒GI組用于引物設(shè)計(jì)，涉及到4種基因型，7個(gè)毒株，分別是：GenBank: KP407450.1、KF039737.1、KF039735.1、KF039734.1、KF039733.1、KF039732.1以及 KF039730.1。諾如病毒GII組用于引物設(shè)計(jì)，涉及到6種基因型，10個(gè)毒株，分別是：GenBank: KJ407074.2、KJ407072.2、KJ407073.1、JQ911595.1、JQ911596.1、JQ911597.1、 JQ911598.1、 KC409301.1、KC409302.1以及KC409301.1。

1.2引物的設(shè)計(jì)與合成利用GenBank下載各病毒的核苷酸序列，使用ClustalX軟件進(jìn)行多序列同源性比對分析，將結(jié)果輸入GeXP eXpress Profiler工具設(shè)計(jì)多重PCR特異性引物，并使用NCBI Primer-Blast和Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行分析篩選。分別在各特異性引物上、下游5′端加上一段非同源通用引物序列Un-F(上游帶有熒光標(biāo)記)和Un-R，構(gòu)成特異嵌合引物。各引物均由上海Invitrogen公司合成(表1)。

本研究設(shè)計(jì)的諾如病毒特異性引物的引物區(qū)域是在諾如病毒的Pol(RNA依賴的RNA聚合酶)基因區(qū)域。

表1　引物信息

1.3總RNA提取及cDNA合成提取120個(gè)臨床樣本血清中的病毒RNA，NanoDrop測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT-PCR Kit進(jìn)行cDNA的第一條鏈的合成。反應(yīng)體系：各特異性嵌合引物下游1 μl(10 pmol/L)，dNTPs 1 μl(10 mmol/L)，RNA模板2 μl，5×PrimeScript 緩沖液4 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl(40 U/ μl)，PrimeScript RTase 1 μl(200 U/μl)，RNase Free dH2O 10.5 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，冰上放置或-20 ℃保存。

1.4引物特異性驗(yàn)證利用GeXP系統(tǒng)進(jìn)行引物單一特異性驗(yàn)證。PCR體系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，單一病毒質(zhì)粒(5×102拷貝)2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測分析。

利用GeXP系統(tǒng)進(jìn)行引物多重特異性驗(yàn)證，PCR體系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，各病毒混合質(zhì)粒(4×102ng / μl)2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測分析。

1.5靈敏度檢測將標(biāo)準(zhǔn)品5×106拷貝/ μl，做10倍濃度稀釋，每個(gè)梯度濃度的樣品重復(fù)3份，用于PCR反應(yīng)及GeXP檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低病毒水平作為最低檢測限。

1.6穩(wěn)定性檢測利用人DNA與RNA作為干擾物。人DNA干擾組：GD1組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和5 ng人全基因組DNA；GD2組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和50 ng人全基因組DNA；GD3組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和500 ng人全基因組DNA，每組做18個(gè)重復(fù)。人RNA干擾組：GR1組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和500 ng人RNA；GR2組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和50 ng人RNA；GR3組，在20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中，加入5×103拷貝病毒和5 ng人RNA，每組做18個(gè)重復(fù)。PCR體系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特異嵌合引物(各引物濃度均為0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，各組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次；72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過GeXP毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測分析。

1.7臨床樣本檢測收集120份腹瀉患者糞便標(biāo)本，連續(xù)檢測20 d，計(jì)算檢測方法的靈敏度、特異性及功效。

2結(jié)果

2.1引物特異性驗(yàn)證諾如I型、諾如II型、輪狀病毒、星狀病毒病原體質(zhì)粒的GeXP結(jié)果。四組實(shí)驗(yàn)所檢測出的峰值條帶大小均與本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的各病毒質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物大小相符(圖1A-D)。混合質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物為4條目的條帶，設(shè)計(jì)的特異嵌合引物在混合實(shí)驗(yàn)中可以排除干擾，特異性擴(kuò)增(圖1E)，四個(gè)峰值位于為163.67 bp、210.33 bp、279.51 bp、326.70 bp，符合本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的諾如I型、輪狀病毒、諾如II型、星狀病毒病原體質(zhì)粒PCR產(chǎn)物條帶大小。

2.2靈敏度檢測將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后經(jīng)PCR及GeXP檢測，最低檢出限為5×103拷貝(表2)。

2.3穩(wěn)定性檢測GD1和GR1組均能全部檢出目標(biāo)病毒，不影響對病毒的檢測結(jié)果；GD2、3組和GR2、3組部分檢出目標(biāo)病毒，存在假陰性結(jié)果(表3)。

2.4臨床樣本檢測結(jié)果對120個(gè)病原體臨床樣本進(jìn)行檢測，以實(shí)時(shí)熒光PCR檢測4種病原體為標(biāo)準(zhǔn)，腹瀉病毒檢測方法的靈敏度為100%，特異性為99.53%，功效為99.62%，與熒光定量PCR檢測結(jié)果一致性為99.51%。結(jié)果顯示本研究的方法可以用于臨床檢測這4種病原體(表4)。

3討論

腹瀉一直是危害人類健康的常見病和多發(fā)病，傳播速度快，臨床上難以區(qū)分，傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)及血清學(xué)檢測方法過程較繁雜，且耗時(shí)耗力，因此不利于快速制定疫情應(yīng)對措施。

國境口岸腹瀉病毒的病原體篩查傳統(tǒng)多運(yùn)用多重PCR法。但在運(yùn)用過程中，我們發(fā)現(xiàn)多重PCR法存在一些不可避免的問題，如特異性和靈敏度不高；同時(shí)在反應(yīng)體系中存在幾對引物，常常出現(xiàn)擴(kuò)增中某些特定片段優(yōu)勢擴(kuò)增，其他片段不能擴(kuò)增出，很難達(dá)到5重以上檢測，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到高通量快速檢測和分析的目標(biāo)。本研究初步建立了一種GeXP遺傳分析系統(tǒng)與多重PCR技術(shù)聯(lián)用的方法，采用了通用引物與特異性引物相結(jié)合的策略，有效解決多重PCR過程中的擴(kuò)增偏愛性，結(jié)合毛細(xì)管電泳提高了檢測的功效。

A為諾如I型，峰值163.56 bp; B為諾如II型，峰值279.58 bp; C為輪狀病毒，峰值211.31 bp; D為星狀病毒，峰值327.58 bp; E 多重引物特異性驗(yàn)證圖1　單一和多重引物特異性驗(yàn)證結(jié)果A:Norovirus GI,peak 163.56 bp；B:Norovirus GII,peak 279.58 bp；C:Rotavirus, peak 211.31 bp；D:Astrovirus, peak 327.58 bp；E: Sepecificity analysis of Multi-primers Fig.1　Specificity of single and multiple primers amplification

表2　各濃度檢測限

表3　穩(wěn)定性檢測

表4　GeXP與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果的比較

表5　GeXP的診斷效能評價(jià)

GeXP法對病毒檢測的靈敏度和特異性很大程度上取決于引物和探針的設(shè)計(jì)，既要求引物和探針選取的序列為目標(biāo)生物的高度保守性片段，又要求此序列與其他生物保持較好的特異性。本研究各病原體的引物設(shè)計(jì)所用的核苷酸序列來自GenBank，用Clustalx軟件進(jìn)行多序列同源性比對分析后，將結(jié)果輸入GeXP express Profiler 工具設(shè)計(jì)多重特異性引物，最后用NCBI Primer-Blast和Primer Premier 5.0軟件分析篩選設(shè)計(jì)好的引物，最后得到4對特異性引物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，單一性檢測和多重檢測中，4對引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物均表現(xiàn)出了高特異性，說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是合理有效的；在臨床樣本的檢測中，與實(shí)時(shí)熒光PCR法比較，也均能得到高特異性結(jié)果。但本研究因?yàn)闊o法得到其他腹瀉病毒的陽性臨床樣本，只進(jìn)行了最常見的4種病原體的方法研究，今后還需進(jìn)一步加大腹瀉病毒種類，完善GeXP在腹瀉病毒檢測中的應(yīng)用。

GeXP遺傳分析系統(tǒng)與多重PCR技術(shù)聯(lián)用的方法對4種腹瀉病毒進(jìn)行檢測，比一代測序更加省時(shí)、比二代測序更加經(jīng)濟(jì)，實(shí)現(xiàn)了快、準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)的三大突破，與實(shí)時(shí)熒光PCR法比較，可以取得相同的靈敏度、特異性，但更滿足口岸應(yīng)急檢測高通量的需求，為口岸爆發(fā)性疫情的快速控制提供了可能性。

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通信作者：張薇薇，Emai:363002530@qq.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.016

基金項(xiàng)目：s國家質(zhì)檢公益性科研專項(xiàng)(201210046)；國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2014IK064)；四川出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(SK201402)

(收稿日期：2016-02-23)

GeXP system combined with multiplex PCR technology for detection of diarrhea viruses

ShiYing,ChenXiaoxiao,FanXunjun,TianLyubo,YangYu,ZhangWeiwei

SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureauInternationalTravelHealthcareCenter,Chengdu610041,China(ShiY,ChenXX,FanXJ,TianLB,YangY);DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China(ZhangWW)Correspondingauthor:ZhangWeiwei,Email:363002530@qq.com

【Abstract】ObjectiveGenomeLab Genetic Analysis System (GeXP) and multiplex-PCR were combined to detect Noroviruse I、II, Astrovirus and Rotavirus. MethodsThe sequences of these viruses were obtained from Genbank of NCBI, and specific primer pairs were designed by GeXP eXpress Profiler. After optimization, the GeXP system could amplify specific fragments of each virus. The sensitivity and specificity of multiple PCR assay was also evaluated.Optimized assay was further validated with 120 clinical specimens collected from the CDC.ResultsThese primer pairs were successfully used for detecting these viruses at the level of 5×103copies/ μl without cross reaction. The sensitivity, specificity and efficiency of GeXP assay was 100%, 99.53% and 99.62%, respectively. Comparing to Real-time PCR, the consistence rate reached 99.51% in 120 clinical samples.ConclusionsThe combined detection of GeXP and multiplex PCR assay could be a high-throughput, rapid and highly specific and sensitive method used in the screening of the diarrhea viruses.

【Key words】Diarrhea viruses; GeXP; Multiplex-PCR