李琦　魏亞梅　韓旭　韓占英　張艷波　許永剛　齊順祥

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·技術(shù)方法·

漢坦病毒熒光抗體中和試驗(yàn)方法的建立

李琦魏亞梅韓旭韓占英張艷波許永剛齊順祥

050021 石家莊，河北省疾病預(yù)防控制中心

【摘要】目的熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)技術(shù)應(yīng)用于漢坦病毒中和抗體的檢測(cè)的探索與改進(jìn)。方法采用固定病毒稀釋血清的方法，將不同稀釋度的血清和固定濃度的病毒經(jīng)37 ℃中和1 h，然后加入到Vero-E6細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔板上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d，經(jīng)固定和熒光染色, 即可在熒光顯微鏡下判定結(jié)果，根據(jù)公式計(jì)算血清的中和滴度。結(jié)果最合適的細(xì)胞濃度為4×104～4.5×104/孔，病毒血清混合液在37 ℃中和較好。用此方法檢測(cè)雙價(jià)滅活疫苗免疫后30份人血清標(biāo)本的中和抗體，與空斑減少中和試驗(yàn)結(jié)果比較，該方法較敏感、穩(wěn)定。結(jié)論熒光抗體病毒中和試驗(yàn)法具有快速、簡(jiǎn)便、敏感、穩(wěn)定的特點(diǎn)。

【主題詞】腎綜合征出血熱；漢坦病毒；熒光抗體病毒中和試驗(yàn)

Fund programs: Hebei Province Science and Technology and Development Plan Program (13277719D)

漢坦病毒(Hantaviruses, HV)是腎綜合征出血熱(Hemorrhagic Fever with Renal Syndromes，HFRS)的主要病原體，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出血和腎臟損害，病死率高，危害嚴(yán)重。目前，HV中和抗體的檢測(cè)方法主要是細(xì)胞微量中和試驗(yàn)和空斑減少中和試驗(yàn)(Plaque Reduction Neutralization Tests，PRNT)。PRNT具有實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、技術(shù)難度大、實(shí)驗(yàn)條件要求高等缺點(diǎn)，一般難以開(kāi)展。細(xì)胞微量中和試驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，更適用于國(guó)內(nèi)應(yīng)用和推廣[1]。作為狂犬病病毒中和抗體水平測(cè)定的最佳方法之一的熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(Fluorescent Antibody Virus Neutralization，F(xiàn)AVN) 技術(shù)，具有結(jié)果判定受主觀因素影響小、可靠性高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果一致性好，適合大規(guī)模樣本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，此方法在HV中和抗體檢測(cè)中較少報(bào)道。因此，我們參考檢測(cè)狂犬病病毒血清中和抗體的方法[2-3]，建立起了HV熒光抗體中和試驗(yàn)技術(shù)，用于HV中和抗體檢測(cè)，現(xiàn)介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒來(lái)源:本實(shí)驗(yàn)室保存的分離自HFRS病人血清的HV毒株(SEOV，Ⅱ型)。

1.1.2Vero-E6細(xì)胞:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所惠贈(zèng)，按常規(guī)方法傳代。

1.1.3血清標(biāo)本:本室保存于-80 ℃冰箱的經(jīng)雙價(jià)HFRS沙鼠腎滅活疫苗免疫后的第28天采集血清標(biāo)本[4]。

1.1.4抗體的熒光標(biāo)記:研究中所用HV單克隆抗體滴度為1∶10，由解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)生產(chǎn)。熒光標(biāo)記的具體操作參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。

1.2熒光抗體病毒中和試驗(yàn)

1.2.1病毒TCID50的測(cè)定: 將HV病毒在96孔板中進(jìn)行10倍系列稀釋, 每個(gè)稀釋度4孔，每孔0.1 ml，37 ℃溫育1 h，然后加入到Vero-E6細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d。棄去液體，80%的冷丙酮固定15 min，加入熒光標(biāo)記的抗體滴度為1:10的HFRS單克隆抗體37 ℃溫育30 min，冷風(fēng)吹干，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凡有不少于1個(gè)熒光顆粒的孔，即記為陽(yáng)性，否則記為陰性。細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)的計(jì)算參考Karber公式推導(dǎo)得出[6]，IgTCID50=L-d(s-0.5)，其中L=最高稀釋度的對(duì)數(shù)；d=稀釋對(duì)數(shù)之間的差；s=陽(yáng)性孔比率總和。

1.2.2熒光抗體病毒中和試驗(yàn):采用固定病毒稀釋血清的方法進(jìn)行[2，7]。對(duì)照血清和待檢血清56 ℃ 30 min預(yù)先滅活，然后在96孔板上進(jìn)行2倍系列稀釋(允許檢測(cè)前以一定比例稀釋)，每稀釋度4孔，每孔50 μl，與100TCID500.1 ml的病毒液50 μl等量混合，37 ℃中和1 h，將血清病毒混合液加入到Vero-E6細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔板上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d，80%的冷丙酮固定15 min，0.1%的伊文斯蘭染色，應(yīng)用間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凡有至1個(gè)熒光顆粒的孔，即記為陽(yáng)性，否則記為陰性。中和滴度的計(jì)算公式參考Karber公式推導(dǎo)得出：即對(duì)照血清的半數(shù)中和稀釋倍數(shù)N50c=1.414Xc×2Yc/4，待測(cè)血清半數(shù)中和稀釋倍數(shù)為N50t=1.414Xt×2Yt/4。X(表示完全中和，即最大稀釋倍數(shù)的4個(gè)重復(fù)孔全部無(wú)熒光顆粒)，Y(表示完全中和后無(wú)熒光顆粒的孔數(shù))。Z=10×N50t/N50c，即為待測(cè)血清的HV中和滴度。對(duì)照血清的中和抗體滴度為10，利用Microsoft Excel軟件按前述公式設(shè)定的X、Y變量計(jì)算中和滴度的最終值Z。

1.3空斑減少中和試驗(yàn)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[1]，簡(jiǎn)述如下：在24孔培養(yǎng)板中將Vero-E6細(xì)胞按每孔細(xì)胞數(shù)4.0×103進(jìn)行培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入在冰浴中以細(xì)胞維持液10倍系列稀釋的待測(cè)HV病毒液，每孔0.1 ml，每稀釋度2孔，37 ℃吸附1.5 h后直接加入含0.6%瓊脂糖的細(xì)胞生長(zhǎng)液，每孔1.5 ml，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，先正置30 min待瓊脂糖凝固后再倒置培養(yǎng)，7 d后加入第二層覆蓋物(含0.01%中性紅的0.6%瓊脂糖的細(xì)胞生長(zhǎng)液)，空斑于2 d左右產(chǎn)生并觀察計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞密度對(duì)觀察結(jié)果的影響將細(xì)胞密度不同的單層細(xì)胞接種病毒培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)成單層的Vero-E6細(xì)胞最合適密度為4×104～4.5×104/孔，這種密度的細(xì)胞接種病毒培養(yǎng)7 d后易產(chǎn)生清晰有特異性熒光顆粒的熒光灶(見(jiàn)表1)。

表1　細(xì)胞密度對(duì)觀察結(jié)果的影響

2.2溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響血清病毒混合液分別經(jīng)37 ℃中和1 h和4 ℃中和過(guò)夜，然后接種細(xì)胞37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d，觀察形成的熒光灶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)37 ℃中和1 h的混合液最終產(chǎn)生的熒光灶較少，而4 ℃中和后產(chǎn)生的熒光灶較多。說(shuō)明血清病毒混合液的中和作用選擇在37 ℃中和較好。

2.3FAVN法和PRNT法敏感度比較FAVN法和PRNT法敏感度比較 分別利用FAVN法和PRNT法對(duì)HFRS雙價(jià)滅活疫苗免疫后人血清標(biāo)本30份進(jìn)行中和抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果中和抗體滴度≥10的標(biāo)本判為陽(yáng)性。如表2所示，兩種方法檢測(cè)中和抗體滴度均≥10的標(biāo)本18份，均<10的5份，F(xiàn)AVN法檢測(cè)≥10而PRNT法檢測(cè)<10的有7份。經(jīng)配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)，χ2=5.143，P<0.05，可以認(rèn)為兩種方法的檢測(cè)結(jié)果不同，F(xiàn)AVN法的陽(yáng)性檢測(cè)率較高。為消除病毒量的不同對(duì)PRNT測(cè)定結(jié)果的影響，兩種方法均采用100TCID500.1 ml病毒量進(jìn)行試驗(yàn)。在操作過(guò)程中兩種方法均分別設(shè)立了陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。表3所示，同一標(biāo)本用FAVN法測(cè)定的中和抗體陽(yáng)性滴度高于PRNT法測(cè)得的滴度，經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)，r=0.692，表明兩種方法成正相關(guān)，可以認(rèn)為FAVN法的敏感度高于PRNT法。

表2　FAVN與PRNT兩種方法對(duì)血清HV中和抗體滴度的檢測(cè)結(jié)果

2.4FAVN法的重復(fù)性將FAVN法和PRNT法檢測(cè)均陽(yáng)性的18份血清標(biāo)本進(jìn)行3次FAVN法檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。經(jīng)方差分析F=0.097，P>0.05，3次的檢測(cè)結(jié)果差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明FAVN法具有較好的重復(fù)性。

3討論

中和抗體的型特異性最強(qiáng)，是估價(jià)是否具有免疫保護(hù)力最重要的指標(biāo)之一[8]。PRNT是血清學(xué)檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn), 是最早應(yīng)用的經(jīng)典的HV分型方法。但該方法的要求高、操作難度大，所需時(shí)間長(zhǎng)大大限制了它的應(yīng)用。FAVN法用于檢測(cè)狂犬病毒血清標(biāo)本的中和抗體已在國(guó)外廣泛應(yīng)用[9-10]，但用于血清標(biāo)本HV中和抗體的檢測(cè)在國(guó)內(nèi)外較少報(bào)道。本研究通過(guò)摸索和改進(jìn)將FAVN法應(yīng)用于HV中和抗體的檢測(cè)。本研究中FAVN法檢測(cè)約需7～8 d，而PRNT法約需2周，縮短了試驗(yàn)周期；FAVN法利用的是抗原抗體特異性熒光染色在顯微鏡下直接觀查結(jié)果，中和抗體滴度的得出依據(jù)公式進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便；而PRNT法對(duì)操作手法要求較高，判定結(jié)果時(shí)易受主觀因素影響，要求觀察者具有很好的經(jīng)驗(yàn)因而誤差偏大。

研究發(fā)現(xiàn)FAVN法和PRNT法均對(duì)細(xì)胞密度有一定要求，細(xì)胞密度適當(dāng)才能觀察到清晰明顯的特異性熒光顆粒和形狀規(guī)則、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的噬斑。FAVN法在37 ℃中和1 h和4 ℃中和過(guò)夜產(chǎn)生的中和抗體滴度沒(méi)有顯著性差異，但血清病毒混合液在37 ℃中和1 h測(cè)得的熒光顆粒較易觀察且用時(shí)較短，故本研究將37 ℃中和1 h作為中和的條件。FAVN能夠準(zhǔn)確計(jì)算中和抗體的滴度，屬于定量實(shí)驗(yàn)，對(duì)毒株的要求較高，應(yīng)每隔一段時(shí)間對(duì)毒株的TCID50重新測(cè)定，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

表3　FAVN法和PRNT法檢測(cè)免疫后人血清HV中和抗體滴度比較

本研究建立的HV熒光抗體中和試驗(yàn)技術(shù)，不僅適用于常規(guī)樣本的檢測(cè)，同時(shí)適用于疫苗免疫后樣本的檢測(cè)，為HFRS疫苗的評(píng)價(jià)提供有力的技術(shù)手段。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：李琦，Email：liqinew@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.017

基金項(xiàng)目：河北省科技研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(13277719D)

(收稿日期：2016-04-08)

Establishment and application of fluorescent antibody virus neutralization test for Hantavirus

LiQi,WeiYamei,HanXu,HanZhanying,ZhangYanbo,XuYonggang,QiShunxiang

HebeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050021,ChinaCorrespondingauthor:LiQi,Email：liqinew@126.com

【Abstract】ObjectiveTo establish a fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test for hantavirus (HV). MethodsWith the method of dilution serum and fixed virus, the serum samples were diluted with different concentration, and with virus-liquid were mixed in 96 culture plate hole, 37 ℃ for 1 hour. Then the mixture of serum and virus was added to Vero-E6 cells which had grown into a monolayer, and cultivated in the 37 ℃, 5% CO2 incubator for 7 days; the 96-well plate was fixed and stained. The results were observed under a fluorescence microscope. The neutralization titer was calculated according to the formula. ResultsThe suitable cell concentrations is 4×104～4.5×104/hole, and the proper temperature for neutralize is 37 ℃. 30 serum specimens of HFRS were tested by FAVN and PRNT, the FAVN is more sensitive and stable. ConclusionFAVN is easier, faster and more sensitive than the others.

【Key words】Hemorrhagic fever with renal syndromes; Hantavirus; Fluorescent antibody virus neutralization