荊泳瑋,胡訪溪,閻　琦,夏夢琪,王東月,劉　新

(沈陽醫(yī)學院，沈陽 110034)

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·論著·

Carba NP法快速檢測鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶的研究*

荊泳瑋,胡訪溪,閻琦,夏夢琪,王東月,劉新△

(沈陽醫(yī)學院，沈陽 110034)

目的了解泛耐藥鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶表型及酶基因型，為臨床合理使用抗生素，監(jiān)控醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法收集117株鮑曼不動桿菌臨床分離株進行常規(guī)微生物學檢測，K-B紙片法篩選多重耐藥鮑曼不動桿菌，通過Carba NP試驗及改良Hodge試驗進行產(chǎn)碳青霉烯酶表型檢測，利用PCR對多重耐藥不動桿菌耐藥基因型進行確證。結(jié)果臨床分離的117株鮑曼不動桿菌株有64株屬多重耐藥鮑曼不動桿菌，其中33株碳青霉烯酶陽性，檢出碳青霉烯酶OXA-23耐藥基因型，未檢出IMP、VIM、NDM-1耐藥基因。結(jié)論Carba NP法可以快速檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，且敏感性強，操作簡單，有助于提高產(chǎn)碳青霉烯酶菌株檢出率，利于監(jiān)控醫(yī)院感染。

鮑曼不動桿菌；耐藥基因；碳青霉烯酶

鮑曼不動桿菌為廣泛存在于自然界的非發(fā)酵機會致病菌之一，可定植于醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚表面，自然環(huán)境中水和土壤等處大量存在。主要引起呼吸道、泌尿道、傷口等處感染[1]。據(jù)2015 年12月全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CARSS)根據(jù)1 427所醫(yī)院數(shù)據(jù)報告：2014年10月至2015年9月鮑曼不動桿菌共分離183 178 株(10.7%)，位居分離的革蘭陰性菌第4位，某些醫(yī)院不動桿菌引起的醫(yī)院感染數(shù)量已超過銅綠假單胞菌，日益增高的鮑曼不動桿菌檢出率提示鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院感染中的常見機會致病菌，使臨床抗感染治療及控制醫(yī)院感染面臨嚴峻挑戰(zhàn)。鮑曼不動桿菌具有較強耐藥性，特別是因產(chǎn)碳青霉烯酶導(dǎo)致的耐藥，使臨床抗感染困難重重，因此監(jiān)控鮑曼不動桿菌及快速檢測不動桿菌并鑒定其耐藥性成為醫(yī)院感染控制的重要任務(wù)。目前檢測的方法主要是改良的Hodge試驗及商品化Etest試條等，但這些方法操作步驟多，耗時長且材料昂貴，因此臨床迫切需要簡單、快速的檢測方法用于鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株。Carba NP法由Patrice Nordmann 于2012年首次報告[2]，此后該方法陸續(xù)優(yōu)化和拓展用于檢測碳青霉烯酶[3]，但目前用于流行病學尚未在臨床推廣應(yīng)用。2015年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)藥敏試驗標準(M100-S25)引入了Carba NP試驗[4]，提示臨床微生物實驗室、醫(yī)院感染控制室、疾病控制等相關(guān)機構(gòu)將廣泛應(yīng)用Carba NP試驗方法。本研究根據(jù)目前多重耐藥鮑曼不動桿菌流行情況，選擇亞胺培南、酚紅等試劑，通過Carba NP法對鮑曼不動桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶檢測，并經(jīng)過改良Hodge實驗及分子生物學技術(shù)確證并分析耐藥基因型，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源收集沈陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院2013～2015年臨床分離鮑曼不動桿菌117株，分別來自呼吸科、ICU、消化外科、急診室等科室。

1.2主要試劑與儀器氨芐西林、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦藥敏紙片均購自O(shè)xoid公司；Carba NP 檢測法試劑按文獻[2]配制：0.5%酚紅溶液，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，ZnSO4·7H2O亞胺培南/培他司丁(Merck & Dohme Corp.U.S.A.)，0.1 mol/L NaOH。ATB試劑(REF 32100，批號1003844720)。A液：2 mL 0.5%酚紅溶液加入16.6 mL臨床實驗室試劑用水中，加入180 μL 0.1 mmol/L ZnSO4水溶液，0.1 mol/L NaOH及10%HCl調(diào)pH 為7.8±0.1。B液：每毫升A液中含有終濃度為6 mg/mL的亞胺培南/西司他丁。細菌DNA提取試劑盒、Taq酶，Marker DL2000，TAE緩沖液，瓊脂糖均購自大連寶生物公司。PCR擴增儀為Eppendof公司產(chǎn)品，電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒由康為世紀公司提供。

1.3菌株篩查將臨床標本首先進行涂片、革蘭染色、顯微鏡觀察：選擇成對排列，且較難脫色的球桿菌標本，分區(qū)劃線接種于中國藍培養(yǎng)基中，44 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個無色的可疑菌落再次革蘭染色鏡檢，符合之前的檢測，進一步氧化酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗，初步確定為不動桿菌后通過ATB生化鑒定，經(jīng)鑒定為鮑曼不動桿菌的菌株117株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測采用K-B法檢測鮑曼不動桿菌藥物敏感性：接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的鮑曼不動桿菌菌苔，配制為0.5麥氏濃度菌懸液，涂布于整個M-H平板，通過紙片分散器將藥敏紙片均勻貼于平板上，37 ℃溫箱孵育18～24 h。藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。按CLSI 2015標準選擇多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株標記備用。

1.5不動桿菌碳青霉烯酶表型篩查

1.5.1Carba NP法快速檢測碳青霉烯酶96孔細胞培養(yǎng)板，每一菌株做3個復(fù)孔，每孔加樣量如表1，置于37 ℃溫箱30 min后，觀察各孔顏色變化[5]。

表1　Carba NP法快速檢測碳青霉烯酶

注：若A液顏色為紅色或橙紅色，B液顏色為紅色或橙紅色即為Carba NP試驗陰性；若A液顏色為紅色或橙紅色，B液為深黃色，黃色或淺橙色提示Carba NP試驗陽性；如果A液顏色為紅色、橙紅色以外顏色，B液為橙色提示結(jié)果無效;-為該項無數(shù)據(jù)。

1.5.2改良Hodge試驗進行碳青霉烯酶表型確證用無菌生理鹽水將過夜培養(yǎng)的大腸埃希菌ATCC 25922調(diào)制成0.5麥氏菌懸液，然后進行1︰10稀釋備用，將稀釋的菌液均勻涂布于M-H平板，靜置3～10 min，將10 μg的亞胺培南紙片貼于M-H平板中央，1 μL接種環(huán)挑取3～5個過夜培養(yǎng)的待測鮑曼不動桿菌菌落分別接種于平板上，接種時從紙片邊緣向平板邊緣劃線，長度至少20～25 mm，于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后，觀察結(jié)果。若在被測菌株與大腸埃希菌AT25922抑菌環(huán)交匯處，大腸埃希菌生長增強即可判定為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株[6]。

1.5.3耐藥基因型確證受試菌株的基因組及質(zhì)粒分別通過試劑盒提取，按參考文獻[7]合成引物(表2)。擴增基因主要為B類碳青霉烯酶中IMP、VIM、NDM-1，以及D類碳青霉烯酶中OXA-23、OXA-24等基因。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，其中Taq酶0.25 μL，引物1與引物2各1 μL，PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，無菌雙蒸水定容至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。配置1%瓊脂糖凝膠，將擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中100 v電泳30 min，在紫外凝膠成像儀下觀察拍照。

2　結(jié)　果

2.1臨床分離的不動桿菌初步微生物學鑒定標本涂片、染色、鏡檢為革蘭陰性球桿菌，較難脫色，多成對排列；氧化酶陰性，動力陰性，硝酸還原實驗陰性，觸酶試驗陽性。經(jīng)ATB生化鑒定為不動桿菌。

2.2多重耐藥不動桿菌篩選(K-B法)臨床收集的117株不動桿菌中，多重耐藥菌株64株，多重耐藥率達51.2%(圖1)。

表2　擴增耐藥基因及測序引物

2.3不動桿菌碳青霉烯酶檢測按CLSI(M100-S25)引入的Carba NP試驗方法比對試驗孔顏色變化，本研究中64株多重耐藥不動桿菌中33株 Carba NP試驗陽性，陽性率達55%。

圖1　鮑曼不動桿菌藥敏試驗(K-B法)

注：M為Marker；s1～s3均為鮑曼不動桿菌。

圖2部分菌株OXA-23基因PCR電泳圖

2.4改良Hodge試驗進行碳青霉烯酶表型確證64株多重耐藥不動桿菌中33株提示改良Hodge陽性，陽性率達55%，Carba NP法檢測碳青霉烯酶陽性率與改良Hodge法檢測結(jié)果一致。

2.5PCR擴增耐藥基因結(jié)果64株多重耐藥菌中，33株檢出OXA-23、OXA-24等酶基因，未檢測到IMP、VIM、NDM-1基因(圖2)，驗證了Carba NP試驗結(jié)果的準確性、一致性。

3　討　論

近年來，鮑曼不動桿菌分離率呈上升趨勢[8]，隨著廣譜抗生素的廣泛使用，鮑曼不動桿菌對抗生素的耐藥性逐年增強，多重耐藥不動桿菌、泛耐藥不動桿菌檢出率日益增高。鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥機制主要為產(chǎn)生碳青霉烯酶，水解碳青霉烯酶類抗生素。碳青霉烯酶包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類的A、B、D 3類酶。A類和D類為絲氨酸酶，D類酶中主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等4型，最主要的是OXA-23、24酶等[9]；B類為金屬酶，包括SIM、VIM、IMP等多型，可被EDTA抑制。部分菌株還攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、頭孢菌素酶(AmpC)和氨基糖苷類修飾酶，可導(dǎo)致一種和幾種氨基糖苷類抗生素耐藥。2015年數(shù)據(jù)顯示鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類的耐藥率全國為59.0%，對碳青霉烯類耐藥是指對亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥，這給臨床治療帶來極大困難，也對醫(yī)院感染的控制提出了新要求。因此，提高產(chǎn)碳青霉烯酶不動桿菌檢出能力，加強醫(yī)院感染控制，阻斷其傳播已至關(guān)重要。

本研究中采用Carba NP試驗，利用菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶水解亞胺培南/西司他丁鈉藥物，從而引起酸堿度的改變，使檢測液中的酚紅產(chǎn)生肉眼可見顏色變化，進行多重耐藥不動桿菌碳青霉烯酶的檢測，具有良好的時效性、特異性、準確性，從而達到快速檢測不動桿菌碳青霉烯酶的目的。本實驗方法適合在微生物實驗室、疾病控制機構(gòu)、醫(yī)院檢驗科臨床微生物室等相關(guān)單位廣泛推廣應(yīng)用，有助于提高產(chǎn)酶菌株檢出的時效性及準確性，為臨床治療及醫(yī)院感染控制更加有效進行爭取寶貴時間。本研究在對33株產(chǎn)碳青霉烯酶不動桿菌耐藥基因型分析中，細菌染色體中OXA-23基因型檢出率達80%以上，OXA-24基因型檢出率達47%，未檢出SIM、VIM、IMP等基因型，質(zhì)粒中未檢出OXA-23、OXA-24等基因型，由此提示產(chǎn)D類碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌其耐藥性為菌體本身固有存在而非通過質(zhì)粒傳播。產(chǎn)B類碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌耐藥基因型檢測及其耐藥性傳播方式仍有待研究。本研究表明本院產(chǎn)碳青霉烯酶多重耐藥不動桿菌主要以O(shè)XA-23型、OXA-24型產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌為主，攜帶VIM、IMP等耐藥基因型的鮑曼不動桿菌未在本院流行傳播。

[1]Senok A,Garaween G,Raji A,et al.Genetic relatedness of clinical and environmental Acinetobacter baumanii isolates from an intensive care unit outbreak[J].J Infect Dev Ctries,2015,9(6):665-669.

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[3]朱雄，袁敏，劉佳，等．Carba NP碳青霉烯酶檢測方法在醫(yī)院感染監(jiān)測中的應(yīng)用[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(23)：5721-5724．

[4]張雅薇，王輝．2015年CLSI M100-S25主要更新內(nèi)容介紹[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2015，38(4)：229-232．

[5]CLSI.M100-S25 performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-fifth informational supplement[M].Wayne,PA:CLSI,2015.

[6]劉運德，樓永良．臨床微生物學檢驗技術(shù)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：56．

[7]俞剛，陸峰泉，陳瑜，等．耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌OXA和NDM-1耐藥基因的研究[J]．中國微生態(tài)學雜志，2014，26(11)：1275-1278．

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Research on rapid detection of Acinetobacter baumannii produced carbapenemase by CarbaNP method*

JING Yongwei,HU Fangxi,YAN Qi,XIA Mengqi,WANG Dongyue,LIU Xin△

(ShenyangMedicalCollege,Shenyang,Liaoning110034,China)

ObjectiveTo understand the phenotype and enzyme genotype of pan-drug resistant carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii to provide the evidence for clinical rational use of antibiotics and monitoring hospital infection.MethodsA total of 117 clinically isolated strains of Acinetobacter baumannii were collected and performed the routine microbiological detection.Multi-drug resistant Acinetobacter baumannii was screened by K-B disk diffusion method.The phenotype of carbapenemase-producing strains was detected by using the Carba NP colorimetry and modified Hodge test.The drug resistant genotype of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii was verified by PCR.ResultsAmong clinically isolated 117 strains of Acinetobacter baumannii,64 strains were multi-drug resistant Acinetobacter baumannii,in which 33 strains were carbapenemase positive.OXA-23 drug-resistant genotype of carbapenemase was detected by PCR,while IMP,VIM and NDM-1 drug resistant genes were not detected.ConclusionThe CarbaNP method can rapidly detect carbapenemase-producing strains with the advantages of strong sensitivity and simple operation,which conduces to improve the detection rate of carbapenemase-producing strains and monitor the nosocomial infection.

Acinetobacter baumannii;drug-resistant gene;carbapenemase

2016-03-28修回日期：2016-05-23)

遼寧省科學事業(yè)公益研究基金項目(GY2013-A-014)；遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(20150810)。

荊泳瑋，男，沈陽醫(yī)學院2012級本科學生,臨床醫(yī)學專業(yè)?！?/p>

，E-mail:syliuxin141236@sina.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.010

A

1673-4130(2016)15-2076-03