李景云, 秦嗣軍, 葛 鵬, 呂德國(guó), 劉靈芝*
(1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866;2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省果樹(shù)品質(zhì)發(fā)育與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110866)
?
不同生育期蘋(píng)果園土壤氨氧化微生物豐度研究
李景云1, 秦嗣軍2, 葛 鵬1, 呂德國(guó)2, 劉靈芝1*
(1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院, 沈陽(yáng) 110866;2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省果樹(shù)品質(zhì)發(fā)育與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110866)
氨氧化微生物; 豐度; 果園酸性土壤; 環(huán)境因子; 熒光定量PCR
果園土壤長(zhǎng)期過(guò)量施入氮肥導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮過(guò)量累積問(wèn)題突出,土壤氮素淋失程度顯著高于一般農(nóng)田土壤[1]。遼寧省丹東東港地區(qū)自上個(gè)世紀(jì)90年代初最先開(kāi)始種植寒富蘋(píng)果,近年來(lái)果園土壤逐漸呈酸化趨勢(shì),蘋(píng)果錳中毒引起的粗皮病[2]、 果實(shí)鈣失調(diào)等生理障礙發(fā)生較重,制約著寒富蘋(píng)果的優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)。
硝化作用是土壤氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié),由氨氧化微生物 (氨氧化細(xì)菌, ammonia-oxidizing bacteria, AOB; 氨氧化古菌, ammonia-oxidizing archaea, AOA)參與完成的氨氧化過(guò)程是硝化作用的限速步驟,在土壤氮庫(kù)調(diào)節(jié)方面起著不可替代的作用[3]。氨氧化微生物參與的土壤硝化作用不僅影響果園土壤的進(jìn)一步酸化,對(duì)果園土壤中無(wú)機(jī)氮素的有效性也具有重要影響。編碼參與氨氧化過(guò)程主要酶類(lèi)的氨單加氧酶(AMO)基因amoA具有較強(qiáng)的保守性,常作為氨氧化微生物的分子標(biāo)記在許多研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4]。研究表明,不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中AOA與AOB的種群多樣性和amoA基因豐度存在明顯差異[5-6]。AOA多主導(dǎo)酸性土壤中的硝化作用,而AOB則主導(dǎo)中性和堿性土壤中的硝化作用[7]。由于AOA和AOBamoA基因豐度及比值與環(huán)境因子密切相關(guān)[8-10],Wessén等[11]提出氨氧化古菌和細(xì)菌的amoA基因豐度可作為生物指標(biāo),在一定程度上反映土壤理化因子(氮肥、 pH等)的變化[12-14]。與傳統(tǒng)清耕制果園土壤環(huán)境日趨惡化相比,實(shí)行生草制、 提倡施加有機(jī)肥等對(duì)于重建果園土壤健康具有重要意義。本試驗(yàn)針對(duì)該區(qū)域多年清耕和生草且不同施肥管理的兩種土壤管理方式蘋(píng)果園,在不同生育時(shí)期(萌芽期、 新梢停長(zhǎng)期和落葉期),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),研究果園土壤中氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌豐度,結(jié)合環(huán)境因子與硝化強(qiáng)度分析,以期為預(yù)警土壤質(zhì)量變化,科學(xué)調(diào)控蘋(píng)果園土壤環(huán)境,促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育等提供理論依據(jù)。
1.1土壤樣品采集及處理
采樣地點(diǎn)位于遼寧省丹東地區(qū)東港市長(zhǎng)山鎮(zhèn)七股頂村兩個(gè)相鄰果園,編號(hào)分別為D1和D2。果園為淺緩丘陵地,海拔7至20 m,土壤為棕壤。其中,D1果園自2001年栽植寒富蘋(píng)果,果園土壤采用清耕管理; D2果園自1995年栽植寒富蘋(píng)果,果園土壤采用自然生草、 人工刈割管理。兩園施用化肥的時(shí)間、 種類(lèi)基本相同,均為每年4月上旬以尿素和磷酸二銨為主配施少量復(fù)合肥、 6月下旬施復(fù)合肥、 9月上旬施復(fù)合肥和硫酸鉀,個(gè)別年限還少量施用鈣鎂硼等肥料。全年氮磷鉀施肥量折合: D1果園N、 P2O5、 K2O分別為485、 85、 443 kg/hm2,D2果園N、 P2O5、 K2O分別為418、 143、 300 kg/hm2。另外,D1和D2果園于9月上旬各撒施少量雞糞與秸稈堆漚的農(nóng)家肥15 t/hm2和37.5 t/hm2。
試驗(yàn)分別于2012年4月28日(萌芽期)、 7月24日(新梢停長(zhǎng)期)、 10月23日(落葉期)采樣。取樣點(diǎn)位于樹(shù)冠下,距樹(shù)干1.5 m處。垂直向下取0—20 cm的土壤樣品,去除表層尚未腐爛的雜草等覆蓋物,5點(diǎn)采樣混合處理作為1次重復(fù),去除根系和石礫等土壤入侵物,采用“四分法”取1 kg土樣于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫總€(gè)果園取3個(gè)重復(fù)土樣。土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照鮑士旦等[15]方法。
1.2土壤硝化強(qiáng)度測(cè)定
土壤硝化強(qiáng)度的測(cè)定參照趙爽等[16]的方法: 稱(chēng)取5 g鮮土樣3份,分別置于100 mL三角瓶中,加2.5 mL NaClO3(75 mmol/L),其中兩份在25℃下培養(yǎng)24 h,另一份置于-20℃冰箱中24 h作對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后每份加5 mL去離子水、 10 mL 2 mmol/L KCl溶液,完全搖勻后立即過(guò)濾,吸取5 mL濾液放入試管中,加3 mL NH4Cl緩沖溶液(0.19 mmol/L, pH 8.5)、 2 mL磺胺試劑,搖勻后室溫下放置15 min,520 nm波長(zhǎng)下比色。按以下公式計(jì)算:
1.3土壤微生物總DNA提取
土壤微生物DNA的提取采用CWBIO Soil Gen DNA Kit說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。獲得DNA樣品后用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop2000 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Scientific)測(cè)其濃度,并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的質(zhì)量,-20℃保存。
1.4熒光定量PCR
表1 AOA和AOB定量PCR 擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件
2.1不同生育時(shí)期寒富蘋(píng)果園土壤基本理化性質(zhì)和硝化強(qiáng)度
不同采樣時(shí)期的果園土壤硝化強(qiáng)度表明,果園土壤硝化強(qiáng)度隨季節(jié)變化表現(xiàn)出先降后增的趨勢(shì)(圖1),除7月份D2果園土壤硝化強(qiáng)度顯著高于D1果園土壤外,4月與10月D2果園土壤硝化強(qiáng)度均顯著低于D1果園土壤。
圖1 不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤硝化強(qiáng)度的變化Fig.1 Potential nitrification of soils at different growth stages of apple
表2 不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤理化性質(zhì)
注(Note): D1—果園1 Orchard 1; D2—果園2 Orchard 2. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,數(shù)值后不同字母表示不同采樣期處理間差異顯著 Data are mean±standard error. Values followed by different letters indicate significant differences among treatments of different sampling dates (P<0.05).
2.2不同生育期土壤氨氧化微生物種群豐度的變化情況
由圖2所示,同一采樣時(shí)期,D2果園土壤的AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)均顯著高于D1土壤; 隨生育期延長(zhǎng),D1果園土壤AOAamoA基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì),D2果園土壤除4月顯著高于后兩個(gè)時(shí)期,后兩個(gè)時(shí)期無(wú)顯著差異; D1果園土壤 AOBamoA基因隨生育期延長(zhǎng)先增后降,D2果園土壤卻表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)。
圖2 不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤中氨氧化微生物amoA基因的豐度與比值Fig.2 Abundances and ratios of amoA gene of AOA and AOB in soils at different growth stages of apple[注(Note): D1—果園1 Orchard 1; D2—果園2 Orchard 2. 方柱上不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著 Values followed by different letters are significantly different among treatments at 0.05 level. ]
2.3不同生育時(shí)期氨氧化微生物豐度與土壤硝化強(qiáng)度(PN)和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系
表3 氨氧化微生物豐度和土壤硝化強(qiáng)度、 理化性質(zhì)的相關(guān)性分析
注(Note): PN—土壤硝化強(qiáng)度Potential nitrification; *—P<0.05; **—P< 0.01.
果樹(shù)不同生育期,因溫度、 水分、 施肥量等因素的改變,可導(dǎo)致植株根系分泌物的變化,進(jìn)而影響土壤理化性質(zhì)與土壤微生物種群及其活性的相互關(guān)系[10]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)研究了不同生育時(shí)期寒富蘋(píng)果園土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的豐度,并分析了氨氧化微生物豐度與土壤硝化強(qiáng)度及環(huán)境因子之間的相關(guān)性。
氨氧化微生物的硝化潛能、 土壤氮素養(yǎng)分有效性以及果樹(shù)氮素養(yǎng)分吸收利用三者之間相互作用,密切相關(guān)。微生物合成的胞外酶是調(diào)控氮素轉(zhuǎn)化的重要因素,施肥處理、 不同生育時(shí)期根系生理活性及土壤環(huán)境因子的差異都將形成不同功能的微生物群落,從而改變土壤脲酶、 磷酸酶和蛋白酶等的合成與活性,干擾氮轉(zhuǎn)化的酶調(diào)控過(guò)程[32]。一些報(bào)道認(rèn)為,蘋(píng)果是喜硝植物,盡管一些施肥處理整體上可以增加土壤氨氧化細(xì)菌的數(shù)量,與AOB相比,不論有機(jī)肥、 無(wú)機(jī)肥單獨(dú)施用還是配施,AOA多為土壤硝化作用的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[33]。因此,在果樹(shù)根系-硝化微生物-果園土壤氮循環(huán)系統(tǒng)中,長(zhǎng)期或過(guò)量施用氮素養(yǎng)分直接或間接地改變根際環(huán)境,影響了氨氧化微生物的種群結(jié)構(gòu)組成與活性,進(jìn)而影響了植株根系對(duì)氮素吸收利用。由于AOA和AOB分別主導(dǎo)不同pH條件下土壤氮代謝的轉(zhuǎn)化過(guò)程,而果園pH值與施肥及土壤管理等有密切的關(guān)系。因此,通過(guò)檢測(cè)AOA與AOB種群結(jié)構(gòu)、 基因豐度與硝化活性的變化,作為潛在的土壤環(huán)境預(yù)測(cè)指標(biāo),分析氮肥施入與土壤酸化的關(guān)系,可為科學(xué)調(diào)控果園投入氮肥種類(lèi)、 數(shù)量,減緩?fù)寥浪峄?,維持果園肥力提供參考依據(jù)。
不同生育時(shí)期‘寒富’蘋(píng)果園土壤理化性狀、 氨氧化微生物豐度及土壤硝化強(qiáng)度均表現(xiàn)出不同程度的差異。蘋(píng)果園土壤受長(zhǎng)期施肥影響逐漸呈酸化趨勢(shì),AOA是蘋(píng)果園土壤硝化作用的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,與土壤pH值變化呈顯著正相關(guān)。土壤硝化強(qiáng)度受多種土壤環(huán)境因子的調(diào)控,蘋(píng)果園無(wú)機(jī)氮肥混合有機(jī)肥的施入,同時(shí)自然生草、 人工刈割等管理制度,可在一定程度上改變土壤AOA與AOB的豐度與比例,以及土壤氮素的含量與種類(lèi),減緩?fù)寥浪峄?/p>
[1]王艷萍, 高吉喜, 劉尚華, 等. 有機(jī)肥對(duì)桃園土壤硝態(tài)氮分布的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 19(7): 1501-1505.
Wang Y P, Gao J X, Liu S H,etal. Effects of organic manure on the profile distribution of soil nitrate-N in a peach orchard[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(7): 1501-1505.
[2]姜學(xué)玲, 于忠范, 張廣和. 膠東蘋(píng)果粗皮病發(fā)生原因及防治技術(shù)初探[J]. 落葉果樹(shù), 1998, (1): 36-38.
Jiang X L, Yu Z F, Zhang G H. The reasons and countermeasures of internal bark necrosis in apple tree in Jiaodong area[J]. Deciduous Fruits, 1998 (1): 36-38.
[3]李順鵬. 環(huán)境生物學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2002.
Li S P. Environmental biology[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2002.
[4]劉晶靜, 吳偉祥,丁穎, 等. 氨氧化古菌及其在氮循環(huán)中的重要作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 21(8): 2154-2160.
Liu J J, Wu W X, Ding Y,etal. Ammonia-oxidizing archaea and their important roles in nitrogen biogeochemical cycling[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2010, 21(8): 2154-2160.
[5]K?nneke M, Bernhard A E, de la Torre J R,etal. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon[J]. Nature, 2005, 437: 543-546.
[6]Leininger S, Urich T, Schloter M,etal. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils[J]. Nature, 2006, 442: 806-809.
[7]Shen J P, Xu Z H, He J Z. Frontiers in the microbial processes of ammonia oxidation in soils and sediments[J]. Journal of Soils Sediments, 2014, 14: 1023-1029.
[8]Long X, Chen C R, Xu Z H,etal. Abundance and community structure of ammonia oxidizing bacteria and archaea in a Sweden boreal forest soil under 19-year fertilization and 12-year warming[J]. Journal of Soils Sediments, 2012, 12: 1124-1133.
[9]Ollivier J, Wanat N, Austruy A,etal. Abundance and diversity of ammonia-oxidizing prokaryotes in the root-rhizosphere complex of Miscan thusxgiganteus grown in heavy metal-contaminated soils[J]. Microbial Ecology, 2012, 64: 1038-1046.
[10]Sher Y, Zaady E, Nejidat A. Spatial and temporal diversity and abundance of ammonia oxidizers in semi-arid and arid soils: indications for a differential seasonal effect on archaeal and bacterial ammonia oxidizers[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 86, 544-556.
[11]Wessén E, Hallin S. Abundance of archaeal and bacterial ammonia oxidizers-Possible bio-indicator for soil monitoring[J]. Ecological Indicators, 2011, 11: 1696-1698.
[12]Nicol G W, Leininger S, James I. The influence of soil pH on the diversity, abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria[J]. Environmental Microbiology, 2008, 10 (11): 2966-2978.
[13]Hu B L, Liu S A, Shen L D,etal. Effect of different ammonia concentrations on community succession of ammonia-oxidizing microorganisms in a simulated paddy soil column[J]. PLOS ONE, 2012, doi: 10.1371/journal.pone.0044122
[14]Wan R, Wang Z, Xie S G. Dynamics of communities of bacteria and ammonia-oxidizing microorganisms in response to simazine attenuation in agricultural soil[J]. Science of the Total Environment, 2014, 472: 502-508.
[15]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2000.
Bao S D. Soil and agro-chemistry analysis[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2000.
[16]趙爽, 胡江, 沈其榮. 兩個(gè)水稻品種根際土壤細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2010, 47(5): 939-945.
Zhao S, Hu J, Shen Q R. Difference in community structure of bacteria and ammonia-oxidizing bacteria in rhizosphere between two different rice cultivars[J]. Acta Pedologica Sinica, 2010, 47(5): 939-945.
[17]Francis C, Roberts K, Beman J,etal. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2005, 102: 14683-14688.
[18]Rotthauwe J H, Witzel K P, Liesack W. The ammonia monooxygenase structural geneamoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations[J]. Applied Environmental Microbiology,1997, 63: 4704-4712.
[19]姜遠(yuǎn)茂, 張宏彥, 張福鎖. 北方落葉果樹(shù)養(yǎng)分資源綜合管理理論與實(shí)踐[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2007.
Jiang Y M, Zhang H Y, Zhang F S. Theory and practice in nutrient resources management of the deciduous fruit trees in northern China[M]. Beijing: China Agricultural University Press, 2007.
[20]張福鎖, 曹一平. 根際微生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分有效性及植物適應(yīng)性機(jī)理[J]. 土壤, 1993, (5): 260-262.
Zhang F S, Cao Y P. Adaptive mechanism of rhizosphere micro-ecosystem nutrient availability and plant[J]. Soils, 1993, 260-262.
[21]葉優(yōu)良, 張福鎖, 于忠范, 等. 蘋(píng)果粗皮病與錳含量的關(guān)系[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2002, 19(4): 219- 222.
Ye Y L, Zhang F S, Yu Z F,etal. Study on the relationship between leaf content of manganese and internal bark necrosis disease of apple trees[J]. Journal of Fruit Science, 2002, 19(4): 219-222.
[22]徐圣友, 姚青, 王賀, 等. 對(duì)錳害敏感性不同的兩個(gè)蘋(píng)果品種枝條中錳的積累與分布[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2003, 30(1): 19-22.
Xu S Y, Yao Q, Wang H,etal. Accumulation and distribution of manganese in shoots of apple cultivars with different sensitivity to manganese[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30(1): 19- 22.
[23]徐圣友, 張福鎖, 王賀, 等. 環(huán)境因子對(duì)蘋(píng)果粗皮病發(fā)生的影響[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2008, 25(1): 73-77.
Xu S Y, Zhang F S, Wang H,etal. Effects of environmental factors on internal bark necrosis of apple trees[J]. Journal of Fruit Science, 2008, 25(1): 73-77.
[24]Shen J P, Zhang L M, Di H J,etal. A review of ammonia-oxidizing bacteria and archaea in Chinese soils[J]. Front Microbiology, 2012, 3: 296.
[25]Zhang L M, Hu H W, Shen J P,etal. Ammonia-oxidizing archaea have more important role than ammonia-oxidizing bacteria in ammonia oxidation of strongly acidic soils[J]. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology, 2012, 6: 1032-1045.
[26]Wang B Z, Zheng Y, Huang R,etal. Active ammonia oxidizers in an acidic soil are phylogenetically closely related to neutrophilic archaeon[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(5): 1684-1691.
[27]Suzuki I, Dular U, Kwok S C. Ammonia or ammonium ion as substrate for oxidation by nitrosomonase uropaea cells and extracts[J]. Journal of Bacteriology, 1974, 120: 556-558.
[28]Stopnisek N, Gubry-Rangin C, Hofferle S,etal. Thaumarchaeal ammonia oxidation in an acidic forest peat soil is not influenced by ammonium amendment[J]. Applied Environmental Microbiology, 2010, 76: 7626-7634.
[29]He J Z, Hu H W, Zhang L M. Current insights into the autotrophic thaumarchaeal ammonia oxidation in acidic soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2012, 55, 146-154.
[30]Hatzenpichler R, Lebecleva E V, Spieck E,etal. A moderately thermophilic ammonia-oxidizing crenarchaeote from a hot spring[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 2008, 105: 2134-2139.
[31]Di H J, Cameron K C, Shen J P,etal. Nitrification driven by bacteria and not archaea in nitrogen rich grassland soils[J]. Nature Geoscience, 2009, 2: 621 -624.
[32]Jan M T, Roberts P, Tonheim S K,etal. Protein breakdown represents a major bottleneck in nitrogen cycling in grassland soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41: 2272-2282.
[33]Hai B, Diallo N H, Sall S,etal. Quantification of key genes steering the microbial nitrogen cycle in the rhizosphere of sorghum cultivars in tropical agroecosystems[J]. Applied and Envrionmental Microbiology, 2009, 75(15): 4993-5000.
Abundance of ammonia oxidizers in apple orchard soil at different growth stages
LI Jing-yun1, QIN Si-jun2, GE Peng1, Lü De-guo2, LIU Ling-zhi1*
(1CollegeofLandandEnvironment,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China;2CollegeofHorticulture/KeyLabofFruitQualityDevelopmentandRegulationofLiaoningProvince,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)
ammonia oxidizer; abundance; orchard acidic soil; environmental factor; real-time PCR
2015-01-26接受日期: 2015-04-01網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-11
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101504, 31171917); 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2011M500575); 遼寧省高等學(xué)校果樹(shù)栽培與生理生態(tài)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(LT2014014); 遼寧省蘋(píng)果科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2014204004); 遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2014070); 沈陽(yáng)市大型儀器共享服務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(F14-194-4-00)資助。
李景云(1988—), 女, 河北邯鄲人, 碩士研究生, 主要從事土壤微生物研究。 E-mail: lijingyun08@163.com
E-mail: liulingzhi2006@163.com
S154.54
A
1008-505X(2016)04-1149-08