不同生育期蘋(píng)果園土壤氨氧化微生物豐度研究

李景云， 秦嗣軍， 葛 鵬， 呂德國(guó)， 劉靈芝*

(1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院， 沈陽(yáng) 110866;2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省果樹(shù)品質(zhì)發(fā)育與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 沈陽(yáng) 110866)

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不同生育期蘋(píng)果園土壤氨氧化微生物豐度研究

李景云1， 秦嗣軍2， 葛 鵬1， 呂德國(guó)2， 劉靈芝1*

(1 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院， 沈陽(yáng) 110866;2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省果樹(shù)品質(zhì)發(fā)育與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 沈陽(yáng) 110866)

氨氧化微生物； 豐度； 果園酸性土壤； 環(huán)境因子； 熒光定量PCR

果園土壤長(zhǎng)期過(guò)量施入氮肥導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮過(guò)量累積問(wèn)題突出，土壤氮素淋失程度顯著高于一般農(nóng)田土壤[1]。遼寧省丹東東港地區(qū)自上個(gè)世紀(jì)90年代初最先開(kāi)始種植寒富蘋(píng)果，近年來(lái)果園土壤逐漸呈酸化趨勢(shì)，蘋(píng)果錳中毒引起的粗皮病[2]、 果實(shí)鈣失調(diào)等生理障礙發(fā)生較重，制約著寒富蘋(píng)果的優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)。

硝化作用是土壤氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，由氨氧化微生物 (氨氧化細(xì)菌, ammonia-oxidizing bacteria， AOB； 氨氧化古菌, ammonia-oxidizing archaea， AOA)參與完成的氨氧化過(guò)程是硝化作用的限速步驟，在土壤氮庫(kù)調(diào)節(jié)方面起著不可替代的作用[3]。氨氧化微生物參與的土壤硝化作用不僅影響果園土壤的進(jìn)一步酸化，對(duì)果園土壤中無(wú)機(jī)氮素的有效性也具有重要影響。編碼參與氨氧化過(guò)程主要酶類(lèi)的氨單加氧酶(AMO)基因amoA具有較強(qiáng)的保守性，常作為氨氧化微生物的分子標(biāo)記在許多研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4]。研究表明，不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中AOA與AOB的種群多樣性和amoA基因豐度存在明顯差異[5-6]。AOA多主導(dǎo)酸性土壤中的硝化作用，而AOB則主導(dǎo)中性和堿性土壤中的硝化作用[7]。由于AOA和AOBamoA基因豐度及比值與環(huán)境因子密切相關(guān)[8-10]，Wessén等[11]提出氨氧化古菌和細(xì)菌的amoA基因豐度可作為生物指標(biāo)，在一定程度上反映土壤理化因子(氮肥、 pH等)的變化[12-14]。與傳統(tǒng)清耕制果園土壤環(huán)境日趨惡化相比，實(shí)行生草制、 提倡施加有機(jī)肥等對(duì)于重建果園土壤健康具有重要意義。本試驗(yàn)針對(duì)該區(qū)域多年清耕和生草且不同施肥管理的兩種土壤管理方式蘋(píng)果園，在不同生育時(shí)期(萌芽期、 新梢停長(zhǎng)期和落葉期)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究果園土壤中氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌豐度，結(jié)合環(huán)境因子與硝化強(qiáng)度分析，以期為預(yù)警土壤質(zhì)量變化，科學(xué)調(diào)控蘋(píng)果園土壤環(huán)境，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育等提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集及處理

采樣地點(diǎn)位于遼寧省丹東地區(qū)東港市長(zhǎng)山鎮(zhèn)七股頂村兩個(gè)相鄰果園，編號(hào)分別為D1和D2。果園為淺緩丘陵地，海拔7至20 m，土壤為棕壤。其中，D1果園自2001年栽植寒富蘋(píng)果，果園土壤采用清耕管理； D2果園自1995年栽植寒富蘋(píng)果，果園土壤采用自然生草、 人工刈割管理。兩園施用化肥的時(shí)間、 種類(lèi)基本相同，均為每年4月上旬以尿素和磷酸二銨為主配施少量復(fù)合肥、 6月下旬施復(fù)合肥、 9月上旬施復(fù)合肥和硫酸鉀，個(gè)別年限還少量施用鈣鎂硼等肥料。全年氮磷鉀施肥量折合: D1果園N、 P2O5、 K2O分別為485、 85、 443 kg/hm2，D2果園N、 P2O5、 K2O分別為418、 143、 300 kg/hm2。另外，D1和D2果園于9月上旬各撒施少量雞糞與秸稈堆漚的農(nóng)家肥15 t/hm2和37.5 t/hm2。

試驗(yàn)分別于2012年4月28日(萌芽期)、 7月24日(新梢停長(zhǎng)期)、 10月23日(落葉期)采樣。取樣點(diǎn)位于樹(shù)冠下，距樹(shù)干1.5 m處。垂直向下取0—20 cm的土壤樣品，去除表層尚未腐爛的雜草等覆蓋物，5點(diǎn)采樣混合處理作為1次重復(fù)，去除根系和石礫等土壤入侵物，采用“四分法”取1 kg土樣于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫總€(gè)果園取3個(gè)重復(fù)土樣。土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照鮑士旦等[15]方法。

1.2土壤硝化強(qiáng)度測(cè)定

土壤硝化強(qiáng)度的測(cè)定參照趙爽等[16]的方法: 稱(chēng)取5 g鮮土樣3份，分別置于100 mL三角瓶中，加2.5 mL NaClO3(75 mmol/L)，其中兩份在25℃下培養(yǎng)24 h，另一份置于-20℃冰箱中24 h作對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后每份加5 mL去離子水、 10 mL 2 mmol/L KCl溶液，完全搖勻后立即過(guò)濾，吸取5 mL濾液放入試管中，加3 mL NH4Cl緩沖溶液(0.19 mmol/L, pH 8.5)、 2 mL磺胺試劑，搖勻后室溫下放置15 min，520 nm波長(zhǎng)下比色。按以下公式計(jì)算:

1.3土壤微生物總DNA提取

土壤微生物DNA的提取采用CWBIO Soil Gen DNA Kit說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。獲得DNA樣品后用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop2000 UV-Vis Spectrophotometer, Thermo Scientific)測(cè)其濃度，并采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的質(zhì)量，-20℃保存。

1.4熒光定量PCR

表1　AOA和AOB定量PCR 擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件

2　結(jié)果與分析

2.1不同生育時(shí)期寒富蘋(píng)果園土壤基本理化性質(zhì)和硝化強(qiáng)度

不同采樣時(shí)期的果園土壤硝化強(qiáng)度表明，果園土壤硝化強(qiáng)度隨季節(jié)變化表現(xiàn)出先降后增的趨勢(shì)(圖1)，除7月份D2果園土壤硝化強(qiáng)度顯著高于D1果園土壤外，4月與10月D2果園土壤硝化強(qiáng)度均顯著低于D1果園土壤。

圖1　不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤硝化強(qiáng)度的變化Fig.1　Potential nitrification of soils at different growth stages of apple

表2　不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤理化性質(zhì)

注(Note): D1—果園1 Orchard 1； D2—果園2 Orchard 2. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，數(shù)值后不同字母表示不同采樣期處理間差異顯著 Data are mean±standard error. Values followed by different letters indicate significant differences among treatments of different sampling dates (P<0.05).

2.2不同生育期土壤氨氧化微生物種群豐度的變化情況

由圖2所示，同一采樣時(shí)期，D2果園土壤的AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)均顯著高于D1土壤； 隨生育期延長(zhǎng)，D1果園土壤AOAamoA基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，D2果園土壤除4月顯著高于后兩個(gè)時(shí)期，后兩個(gè)時(shí)期無(wú)顯著差異； D1果園土壤 AOBamoA基因隨生育期延長(zhǎng)先增后降，D2果園土壤卻表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)。

圖2　不同生育時(shí)期蘋(píng)果園土壤中氨氧化微生物amoA基因的豐度與比值Fig.2　Abundances and ratios of amoA gene of AOA and AOB in soils at different growth stages of apple[注(Note): D1—果園1 Orchard 1； D2—果園2 Orchard 2. 方柱上不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著 Values followed by different letters are significantly different among treatments at 0.05 level. ]

2.3不同生育時(shí)期氨氧化微生物豐度與土壤硝化強(qiáng)度(PN)和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系

表3　氨氧化微生物豐度和土壤硝化強(qiáng)度、 理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

注(Note): PN—土壤硝化強(qiáng)度Potential nitrification; *—P<0.05; **—P< 0.01.

3　討論

果樹(shù)不同生育期，因溫度、 水分、 施肥量等因素的改變，可導(dǎo)致植株根系分泌物的變化，進(jìn)而影響土壤理化性質(zhì)與土壤微生物種群及其活性的相互關(guān)系[10]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)研究了不同生育時(shí)期寒富蘋(píng)果園土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的豐度，并分析了氨氧化微生物豐度與土壤硝化強(qiáng)度及環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

氨氧化微生物的硝化潛能、 土壤氮素養(yǎng)分有效性以及果樹(shù)氮素養(yǎng)分吸收利用三者之間相互作用，密切相關(guān)。微生物合成的胞外酶是調(diào)控氮素轉(zhuǎn)化的重要因素，施肥處理、 不同生育時(shí)期根系生理活性及土壤環(huán)境因子的差異都將形成不同功能的微生物群落，從而改變土壤脲酶、 磷酸酶和蛋白酶等的合成與活性，干擾氮轉(zhuǎn)化的酶調(diào)控過(guò)程[32]。一些報(bào)道認(rèn)為，蘋(píng)果是喜硝植物，盡管一些施肥處理整體上可以增加土壤氨氧化細(xì)菌的數(shù)量，與AOB相比，不論有機(jī)肥、 無(wú)機(jī)肥單獨(dú)施用還是配施，AOA多為土壤硝化作用的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[33]。因此，在果樹(shù)根系-硝化微生物-果園土壤氮循環(huán)系統(tǒng)中，長(zhǎng)期或過(guò)量施用氮素養(yǎng)分直接或間接地改變根際環(huán)境，影響了氨氧化微生物的種群結(jié)構(gòu)組成與活性，進(jìn)而影響了植株根系對(duì)氮素吸收利用。由于AOA和AOB分別主導(dǎo)不同pH條件下土壤氮代謝的轉(zhuǎn)化過(guò)程，而果園pH值與施肥及土壤管理等有密切的關(guān)系。因此，通過(guò)檢測(cè)AOA與AOB種群結(jié)構(gòu)、 基因豐度與硝化活性的變化，作為潛在的土壤環(huán)境預(yù)測(cè)指標(biāo)，分析氮肥施入與土壤酸化的關(guān)系，可為科學(xué)調(diào)控果園投入氮肥種類(lèi)、 數(shù)量，減緩?fù)寥浪峄?，維持果園肥力提供參考依據(jù)。

4　結(jié)論

不同生育時(shí)期‘寒富’蘋(píng)果園土壤理化性狀、 氨氧化微生物豐度及土壤硝化強(qiáng)度均表現(xiàn)出不同程度的差異。蘋(píng)果園土壤受長(zhǎng)期施肥影響逐漸呈酸化趨勢(shì)，AOA是蘋(píng)果園土壤硝化作用的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，與土壤pH值變化呈顯著正相關(guān)。土壤硝化強(qiáng)度受多種土壤環(huán)境因子的調(diào)控，蘋(píng)果園無(wú)機(jī)氮肥混合有機(jī)肥的施入，同時(shí)自然生草、 人工刈割等管理制度，可在一定程度上改變土壤AOA與AOB的豐度與比例，以及土壤氮素的含量與種類(lèi)，減緩?fù)寥浪峄?/p>

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Abundance of ammonia oxidizers in apple orchard soil at different growth stages

LI Jing-yun1, QIN Si-jun2, GE Peng1, Lü De-guo2, LIU Ling-zhi1*

(1CollegeofLandandEnvironment,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China；2CollegeofHorticulture/KeyLabofFruitQualityDevelopmentandRegulationofLiaoningProvince,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

ammonia oxidizer; abundance; orchard acidic soil; environmental factor; real-time PCR

2015-01-26接受日期: 2015-04-01網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101504, 31171917)； 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2011M500575)； 遼寧省高等學(xué)校果樹(shù)栽培與生理生態(tài)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(LT2014014)； 遼寧省蘋(píng)果科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2014204004)； 遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2014070)； 沈陽(yáng)市大型儀器共享服務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(F14-194-4-00)資助。

李景云(1988—)， 女， 河北邯鄲人， 碩士研究生， 主要從事土壤微生物研究。 E-mail: lijingyun08@163.com

E-mail: liulingzhi2006@163.com

S154.54

A

1008-505X(2016)04-1149-08