虎松艷　范麗梅　郭友峰

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院；2.廣東省婦幼保健院；3.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510000）

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谷氨酰胺通過PI3K/Akt信號通路對心肌細胞的缺氧保護作用

虎松艷1范麗梅2郭友峰3

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院；2.廣東省婦幼保健院；3.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510000）

目的：谷氨酰胺對心肌細胞的缺氧保護作用及上游PI3K/Akt信號通路在其中的作用。方法：體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，分為對照組、缺氧組和谷氨酰胺+缺氧組。采用MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測心肌細胞的凋亡百分率，采用Western Blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax的表達情況，檢測信號通路PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。結(jié)果：與對照組比較，缺氧組的細胞增殖活性明顯降低，凋亡蛋白Bax的表達明顯增加。而隨著培養(yǎng)時間的延長，缺氧心肌細胞與谷氨酰胺共培養(yǎng)組細胞活性呈上升趨勢，24小時效果最明顯，且Bcl-2蛋白表達增加，而Bax蛋白水平下降，PI3K和Akt蛋白磷酸化水平明顯升高。結(jié)果：在缺氧情況下，谷氨酰胺通過激活PI3K/Akt信號通路抑制細胞的凋亡，提高缺氧心肌細胞的增加活性。

谷氨酰胺PI3K/Akt信號通路心肌細胞缺氧

大量研究表明，心血管疾病的發(fā)生過程中均伴有不同程度的缺氧。缺氧可以抑制細胞的生長，引起心肌細胞的壞死和凋亡［1］。谷氨酰胺可以明顯抑制腸道缺血再灌注損傷引起的損傷，在氧化應(yīng)激中有重要的保護作用。但其是否可以通過PI3k/Akt通路緩解缺氧心肌細胞的凋亡，目前尚未見研究報道［2］。本研究將培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，建立缺氧細胞模型，通過體外試驗進一步探討谷氨酰胺在缺氧心肌細胞中的保護作用及可能機制。

1　資料與方法

1.1一般資料

取一定量谷氨酰胺超微粉劑溶解于無胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基，超聲促溶后，通過高速離心，取上清液，過濾除菌，低溫冰箱保存，根據(jù)實驗需要，使用DMEM配置不同濃度。Bax、Bcl-2兔抗鼠單克隆抗體購自美國ABcam公司，Akt鼠抗兔單抗購自Santa Cruz公司，細胞培養(yǎng)液、MTT試劑盒等購自Gibcol公司。

1.2分組對照組

細胞在37℃培養(yǎng)箱中在正常條件下培養(yǎng)。缺氧組：心肌細胞在95%N2+4%CO2+1%O2條件下培養(yǎng)，制備缺氧心肌細胞培養(yǎng)模型。共培養(yǎng)組：缺氧條件下的心肌細胞培養(yǎng)基中加入100 mg/L的谷氨酰胺共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h后分別收集各組細胞，檢測細胞的增殖活性和凋亡情況。

1.3方法

采用Western Blot法檢測各組細胞p-Akt、Bax、Bcl-2的表達，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，待70%～80%鋪滿時，消化細胞，使用細胞裂解液溶解5 min，取裂解產(chǎn)物蛋白進行SDS-PAGE電泳，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)膜，使用p-Akt（1∶500）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）單克隆抗體孵育1 h，二抗孵育30 min，沖洗后，暗室曝光。細胞凋亡百分率的檢測：收集各組細胞，PBS沖洗3次5 min，70%乙醇固定，PBS懸浮，加入RNase 2 mL/L孵育30 min，加入PI 10 mg/L染色50 min，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡百分率。MTT法檢測細胞的增殖活性：采集對數(shù)生長期細胞株，經(jīng)0.25%胰酶消化，96孔板接種，每孔接種5 000個細胞/100 μL，每孔加入20 μL的MTS試劑，37℃孵育3 h，酶標(biāo)儀讀取每孔吸光度值（OD=490 nm），實驗重復(fù)3次以減少誤差，計算增殖率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間定量資料比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗后，對方差齊資料使用最小顯著差異法進行兩兩比較，方差不齊時采用Dunnett T3法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組心肌細胞的增殖活性比較

與對照組比較，缺氧組細胞增殖活性降低，而隨著時間的延長，缺氧心肌細胞與谷氨酰胺共培養(yǎng)組活性呈上升趨勢，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組心肌細胞的增殖活性比較

2.2各組心肌細胞的凋亡率比較（見表2）

2.3各組PI3K/Akt信號通路蛋白的表達情況

Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，缺氧組p-AKT水平明顯降低，bal-2表達下調(diào)，而Bax表達升高，而通過與谷氨酰胺共培養(yǎng)后，Akt磷酸化水平明顯升高，bal-2上調(diào)而Bax表達下調(diào)，見圖1、圖2。

表2　各組心肌細胞的凋亡率比較

3　討論

谷氨酰胺是近年來研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腸缺血再灌注損傷中和氧化應(yīng)激反應(yīng)中均對機體具有保護作用的物質(zhì)。其在心腦血管疾病中亦被研究證實具有明顯的抗氧化和清除自由基作用，可以保護心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞的缺血缺氧損傷［3］。但其是如何提高心肌細胞對缺氧的耐受程度以及其可能的分子機制，目前尚無研究報道。Akt是PI3k的下游靶點，其磷酸化水平是評估PI3k/Akt通路的常用指標(biāo)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠內(nèi)毒素血癥模式證實抑制PI3k/Akt信號通路后加重了小鼠的心功能不全和機體的炎癥反應(yīng)，而激活PI3k/Akt后可以提高小鼠的生存率［5］。本研究進而設(shè)想，在體外心肌細胞缺氧模型中，心肌細胞的凋亡是否亦與PI3k/Akt信號通路的抑制有關(guān)；在缺氧條件下給予抗氧化劑谷氨酰胺共培養(yǎng)后，是否可以激活PI3k/Akt信號通路，增加Akt磷酸化水平，而達到減輕細胞凋亡的目的。

圖1　Western Blot檢測結(jié)果

圖2　各組PI3K/Akt信號通路蛋白的表達情況注：與對照組比較，**P＜0.05，與缺氧組比較，*P＜0.05。

本研究結(jié)果顯示，缺氧組心肌細胞AKT磷酸化水平降低。與對照組比較，MMT法證實細胞的增殖活性明顯降低，但與谷氨酰胺共培養(yǎng)24 h后，Akt磷酸化水平明顯上調(diào)，增殖活性增加而凋亡百分率降低。國外小鼠模型研究表明，在缺氧條件下，可以通過激活PI3k/Akt信號通路調(diào)節(jié)能量代謝和促進血管的形成，增強心肌細胞的抗缺氧能量［6］。大量研究證明，PI3k/Akt信號通路還參與了調(diào)控細胞形態(tài)、粘附等作用，參與了多種心血管疾病如冠脈硬化、心肌缺血、冠脈痙攣等的發(fā)生發(fā)展過程。通過激活PI3k/Akt信號通路，可以抑制冠脈痙攣，從而減輕缺血引起的心肌細胞損傷［7］。PI3k/Akt已經(jīng)成為了心血管疾病治療的一個重要靶點。通過研究影響該通路的相關(guān)因素，證實其與心肌細胞凋亡率相關(guān)［8］。本研究結(jié)果表明，在缺氧條件下，谷氨酰胺可以提高心肌細胞的增殖活性，其可能是通過PI3k/Akt信號通路對心肌細胞發(fā)揮抗缺氧損傷能力。

細胞凋亡可能是心肌細胞缺氧損傷的重要原因之一。谷氨酰胺是否通過抗凋亡實現(xiàn)對缺氧的心肌細胞發(fā)揮保護作用亦是本課題的研究內(nèi)容之一。本研究結(jié)果顯示，缺氧組心肌細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降，而凋亡蛋白Bax表達明顯增加，與谷氨酰胺處理后的缺氧心肌細胞Bcl-2表達明顯上調(diào)。而Bax顯著下降，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率明顯降低。結(jié)果均表明谷氨酰胺可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白而發(fā)揮保護作用。在缺血小鼠動物模型中，心肌細胞凋亡明顯增加，同時存在明顯的凋亡蛋白表達增加。研究證實了在缺氧條件下心肌細胞存在明顯凋亡［9］。而在缺血再灌注模型中，當(dāng)恢復(fù)血液供應(yīng)后，小鼠腸道出現(xiàn)了缺血再灌注損傷，谷氨酰胺可以通過調(diào)控凋亡蛋白而發(fā)揮保護作用［10］。因此，谷氨酰胺保護缺血細胞的重要機制之一是調(diào)控細胞的凋亡。

綜上所述，谷氨酰胺可以減輕缺氧心肌細胞的損傷，其作用可能是依賴于PI3k/Akt信號通路的激活。在缺氧環(huán)境下，通過上調(diào)Akt蛋白磷酸化水平，通過促進抗凋亡因子表達而抑制凋亡蛋白的表達，提高缺氧心肌細胞的增殖活性，降低凋亡百分率。但谷氨酰胺是否還通過其他環(huán)節(jié)提高心肌細胞耐缺氧能力有待進一步深入研究探討。

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