陳水昌 李 穎（廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院沙頭分院骨科佛山528208）

補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)成骨細(xì)胞中ASK1、ERO1、Caspase-12調(diào)節(jié)作用*

陳水昌 李 穎
（廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院沙頭分院骨科佛山528208）

目的：探討補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)成骨細(xì)胞中ASK1、ERO1、Caspase-12調(diào)節(jié)作用機(jī)制。方法：將新西蘭大白兔9只隨機(jī)分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。三組分別用中藥提取液、雌二醇混懸液按中藥劑量和同體積（約10 ml）蒸餾水灌胃，1個(gè)月后抽取含藥血漿。選用1 d齡SD大鼠獲取原代的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，分為中藥組、西藥組、凋亡空白組、正?？瞻捉M。中藥組、西藥組分別給予對(duì)應(yīng)的含藥血漿培養(yǎng)；凋亡空白組和正常空白組均給予常規(guī)血清培養(yǎng)。24 h后檢測(cè)ASK1、ERO1和Caspase-12含量。結(jié)果：在ASK1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且西藥組比中藥組更能顯著降低ASK1 mRNA的表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在ERO1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在Caspase-12方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方通過(guò)ASK1、ERO1所介導(dǎo)的方式對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控。

成骨細(xì)胞；中藥復(fù)方；ASK1；ERO1；Caspase-12

細(xì)胞衰老的過(guò)程是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）持續(xù)的過(guò)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活非折疊蛋白反應(yīng)以保護(hù)由應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，恢復(fù)細(xì)胞功能，但如果應(yīng)激刺激過(guò)于強(qiáng)烈、持久，內(nèi)環(huán)境紊亂無(wú)法糾正，則相應(yīng)凋亡機(jī)制被激活并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。本項(xiàng)目通過(guò)補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞內(nèi)非折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方式進(jìn)行初步的研究，探討補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞用1 d齡SPF級(jí)健康雌性SD大鼠20只；制備藥物血清用新西蘭大白兔9只，體重2.0～2.2 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、丹參、黃芪等10味中藥組成，該方所含生藥量為1.43 kg/L，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供。戊酸雌二醇片，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司提供（國(guó)藥準(zhǔn)字J20080036，批號(hào)：177A12）。

1.3含藥血漿的制備新西蘭大白兔9只，隨機(jī)分為中藥組、西藥組、空白組，每組3只。三組大白免連續(xù)灌胃1周，最后一次灌胃后2 h，分別行心臟采血，將獲得的全血置于含抗凝劑的試管中，5～10 min后，于3 000 r/min離心15 min，吸取上清，即獲取含

1.4成骨細(xì)胞的培養(yǎng)1 d齡SD大鼠，75％酒精浸泡15 min，取出頭蓋骨，剔凈附著軟組織，0.25％胰蛋白酶預(yù)消化，0.1％Ⅱ型膠原酶消化，離心，獲取細(xì)胞，PBS液沖洗，置含10％NCS-MEM培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2中靜置培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液1次，棄去原培養(yǎng)液，加入含10％的胎牛血清MEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)4～7 d，單層細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底。傳代時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用D-Hank's液沖洗，0.25％胰蛋白酶消化，棄去消化液，加入培養(yǎng)液，吹打培養(yǎng)瓶底，使細(xì)胞脫落，制成細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶，置37℃、5％CO2中靜置培養(yǎng)。

1.5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡采用紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。采用紫外線照射成骨細(xì)胞10 min，照射過(guò)程中以0.5 ml D-Hank's液濕潤(rùn)皿底，以保持皿底不干，照射后中藥組和西藥組分別給予對(duì)應(yīng)的含藥血漿培養(yǎng)；凋亡空白組和正?？瞻捉M均給予常規(guī)血清培養(yǎng)。24 h后，收集成骨細(xì)胞做下一步實(shí)驗(yàn)。正?？瞻捉M不用紫外線照射。

1.6指標(biāo)檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）檢測(cè)Caspase-12的含量，采用熒光定量PCR（Realtime Fluorescence Quantitative PCR，RTFQ PCR）檢測(cè)ASK1的含量，采用光密度（OD值）的方法檢測(cè)ERO1的含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)性分析，符合要求后各組間差異分別采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1成骨細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期變化與正?？瞻捉M相比，中藥組、西藥組、凋亡空白組G0/G1、G2/M期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞明顯減少。中藥組、西藥組、凋亡空白組細(xì)胞凋亡率較正?？瞻捉M顯著增高（P＜0.05），其中凋亡空白組凋亡率最高，與其他三組差異明顯（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西藥組凋亡率略低于中藥組（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　紫外線對(duì)成骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響（±s）

表1　紫外線對(duì)成骨細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的影響（±s）

組別G0/G1SG2/M凋亡率（％）中藥組西藥組凋亡空白組正常空白組45.596±2.328 45.792±2.251 44.181±1.959 39.335±1.789 43.528±2.981 41.069±2.731 46.835±1.396 53.987±2.970 10.880±1.27 13.14±1.427 8.986±1.775 6.673±1.383 8.284±0.541 7.745±0.962 10.15±0.838 3.728±0.830

2.2蛋白表達(dá)的變化在Caspase-12方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在ERO1方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在ASK1 mRNA方面，中藥組、西藥組與凋亡空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且西藥組比中藥組更能顯著降低ERO1蛋白的表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　各組ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表達(dá)情況（±s）

表2　各組ASK1 mRNA、ERO1、Caspase-12表達(dá)情況（±s）

注：與凋亡空白組比較，*P＜0.05；與中藥組比較，#P＜0.05。

組別Caspase-12（pmol/L）ERO1ASK1 mRNA中藥組西藥組凋亡空白組正?？瞻捉M11.987±4.133 12.192±3.168 12.118±3.211 10.481±2.871 1.216±0.234*0.983±0.110*#1.351±0.191 0.640±0.102 3.14±0.24*2.21±0.33*#4.56±0.61 1.45±0.86

3討論

骨質(zhì)疏松癥是一種衰老的疾病。衰老是在正常狀況下生物發(fā)育成熟后，隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分漸進(jìn)退變。衰老過(guò)程在整體、組織、細(xì)胞和分子水平皆有所體現(xiàn)，隨年齡增加，器官、組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)、反應(yīng)敏感性及功能均逐步下降。Naidoo等［2］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)衰老發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)效應(yīng)減退，損害效應(yīng)增強(qiáng)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能加速衰老，因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能導(dǎo)致細(xì)胞功能下降和凋亡。錯(cuò)誤和未折疊蛋白的積累激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)度應(yīng)激導(dǎo)致凋亡，適度的反應(yīng)最終減輕損害，保護(hù)細(xì)胞，但卻是以細(xì)胞功能的丟失為代價(jià)。目前研究表明，非折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有三條主要的途徑：（1）CHOP/GADD153途徑：CHOP/GADD153（GrowthArrestand DNA-damage-inducible Gene 153）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員。在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，CHOP的表達(dá)量大大增加并聚集在細(xì)胞核內(nèi)。CHOP能激活GADD34、ERO1和死亡受體DR5等凋亡反應(yīng)蛋白過(guò)量表達(dá)的CHOP能促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。（2）Caspases-12途徑：Caspases-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的關(guān)鍵分子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活各種下游Caspase，誘導(dǎo)凋亡［4］。（3）ASK1/JNK途徑：ASK1是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶中的一種。活化的ASK1又依次激活MKK4/MKK7-JNK和MKK3/MKK6-p38激酶途徑，對(duì)應(yīng)激做出應(yīng)答或促使細(xì)胞凋亡［5］。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1（Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1，ERO1）主要參與維持ER內(nèi)氧化狀態(tài)，是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白合成、折疊的關(guān)鍵基因。ERO1參與氧化二硫鍵異構(gòu)酶，維持蛋白折疊過(guò)程能夠持續(xù)進(jìn)行。ERO1在形成二硫鍵的過(guò)程中可產(chǎn)生H2O2，因此Ozgur等［6］認(rèn)為ERO1激活是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）產(chǎn)生的重要來(lái)源之一。過(guò)多的ROS產(chǎn)生，超過(guò)細(xì)胞抗氧化防御能力就會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，引起氧化應(yīng)激和ERS等過(guò)程。目前有研究發(fā)現(xiàn)，ERO1同源異構(gòu)體ERO1 a限制胰島素原突變體誘導(dǎo)的ERS，且ERO1 a蛋白可能參與高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并可以作為ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的重要標(biāo)志蛋白。

凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（Apoptosis Signal-regulating Kinase 1，ASK1）是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase，MAP3Ks）家族成員之一。在疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，由于致病因子的持續(xù)刺激，使ASK1處在持久異常活化的狀態(tài)，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。多種內(nèi)源性和外源性刺激均可激活A(yù)SK1，異?；罨腁SK1參與了多種疾病的病理過(guò)程。眾多學(xué)者認(rèn)為心臟由代償性心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭的過(guò)程中，心肌細(xì)胞凋亡起著重要作用。慢性心力衰竭時(shí)，ASK1參與凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡

［7～8］。

Caspase是一類一、二級(jí)結(jié)構(gòu)相似的半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中一組關(guān)鍵的蛋白酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行者［9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的一個(gè)主要因素是Caspase-12，通過(guò)激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9酶原，這一過(guò)程需與另外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同作用，活化后的Caspase-9通過(guò)對(duì)Caspase-3酶原等Caspase效應(yīng)分子的活化，切割多ADP聚合酶（PARP）和多種其它細(xì)胞內(nèi)的底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥屬“骨痿”，根據(jù)腎主骨的理論，其病因病機(jī)，當(dāng)首責(zé)于各種原因?qū)е履I（氣、陰、陽(yáng)）的不足，影響骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充養(yǎng)，易發(fā)生骨骼脆弱無(wú)力之證。補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方經(jīng)過(guò)臨床及科研實(shí)踐［11～13］具有補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣、活血化瘀之功效，方中以補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽(yáng)壯骨為君藥；肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強(qiáng)補(bǔ)腎陽(yáng)之功為臣藥；佐以黃芪補(bǔ)中益氣，丹參、當(dāng)歸活血化瘀，熟地、白芍滋陰益精。在本研究中，中藥組和西藥組相比，兩者均可以降低ASK1 mRNA、ERO1蛋白的含量，與凋亡空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但在Caspase-12方面，兩組與凋亡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們可以認(rèn)為，補(bǔ)腎健脾中藥復(fù)方可能是通過(guò)CHOP/GADD153途徑和ASK1/JNK途徑對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控，這對(duì)于中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松癥具有重要的意義。

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Effects of Chinese Medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in Osteoblasts

CHEN Shui-chang，LI Ying
（The Department of Orthopedics，the Shatou Branch Hospital of Guangdong Province Traditional Chinese and Western Medicine，F(xiàn)oshan528208）

Objective：To explore the effects of chinese medicine for Bushenjianpi on ASK1，ERO1 and Caspase-12 in osteoblasts. Methods：9 New Zealand rabbits were randomly divided into the chinese medicine group（n=3），the western medicine group（n=3）and the control group（n=3）.The chinese medicine group was given the intragastric administration with chinese herbal compound.The western medicine group was given the alendronate sodium，the control group was given distilled water.After treament for 1 month，the plasma was separated from blood.1 Day old SD rats were used to culture osteoblasts，which were divided into the chinese medicine group，the western medicine group，the apoptosis group and the control group.The chinese medicine group and the western medicine group were given the corresponding plasma，other group were given serum culture.After 24 h，GADD34、ERO1、IRE-1 were examined.Results：Compared with the apoptosis group，the chinese medicine group and the western medicine group could decrease the expression level of ASK1 and ERO1 in serum obviously（P＜0.05）.Compared with the chinese medicine group in ASK1 and ERO1，the western medicine group could decrease the expression level obviously（P＜0.05）.But compared with the apoptosis group，there was no statistical significance in Caspase-12. Conclusion：Chinese medicine for Bushenjianpi is regulated by ASK1 and ERO1 in the way of apoptosis.

Osteoblasts；Chinese herbal compound；ASK1；ERO1；Caspase-12

R285.5

Bdoi：10.13638/j.issn.1671-4040.2016.04.042

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013B021800162）；廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：201308180）藥血漿，再滅活，抽濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2016-03-18）