姜　洋　楊惠民　馬玉琪　梁志齊

補腎祛瘀化痰法對載脂蛋白E基因敲除小鼠Morris水迷宮研究的影響

姜洋楊惠民馬玉琪梁志齊

目的 通過研究補腎祛瘀化痰法對ApoE基因敲除小鼠Morris水迷宮成績的影響,探討補腎祛瘀化痰法對認(rèn)知功能障礙的改善作用.方法 將ApoE基因敲除小鼠共32只隨機分為成年中藥組、成年模型組及老年中藥組、老年模型組,并取相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠共16只隨機分成成年正常組及老年正常組,連續(xù)給予補腎祛瘀化痰法組方灌胃12周,成年組至32周齡、老年組至44周齡時檢測Morris水迷宮定位航行實驗及空間探索實驗的成績.結(jié)果 定位航行實驗逃避潛伏期結(jié)果不符合正態(tài)分布,故采用非參數(shù)檢驗中K組獨立樣本檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計:成年各組之間逃避潛伏期無明顯差異(P>0.05).老年模型組較老年中藥組逃避潛伏期顯著延長(P<0.01),老年模型組較老年正常組亦明顯延長(P<0.05).空間探索實驗中,第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時間均符合正態(tài)分布,故采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計:成年各組之間在穿臺次數(shù)、第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時間均無明顯差異(P>0.05);老年模型組較老年正常組穿臺次數(shù)明顯減少(P<0.05),老年中藥組及老年模型組均較老年正常組在第Ⅲ象限路程及第Ⅲ象限時間明顯縮短(P<0.05).結(jié)論老年中藥組及老年正常組小鼠Morris水迷宮成績較理想,說明補腎祛瘀化痰法可改善老齡小鼠Morris水迷宮成績,從而改善認(rèn)知功能.

補腎祛瘀化痰法; ApoE基因敲除小鼠; Morris水迷宮

ApoE基因敲除小鼠由于缺乏ApoE基因而容易出現(xiàn)脂質(zhì)代謝障礙,可導(dǎo)致血脂異常及脂質(zhì)堆積引起的血管內(nèi)皮炎性損傷,故ApoE基因敲除小鼠更易受到氧化應(yīng)激作用的侵害而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、動脈粥樣硬化等.本實驗中以補腎祛瘀化痰中藥干預(yù)ApoE基因敲除小鼠,并觀察各組在Morris水迷宮實驗中對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力,從而探索補腎祛瘀化痰法對小鼠認(rèn)知功能的改善作用.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級8周齡ApoE基因敲除小鼠32只,均為雄性,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號為:SCXK(京)2011-0012;8周齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠16只,均為雄性,體質(zhì)量(20±2)g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗室,動物許可證號為:SCXK(軍)2007-004.飼養(yǎng)場地為北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物房,普通飲食,充足攝食及飲水,室溫(25±2)℃,每天光照12小時,濕度50%～70%.

1.1.2實驗藥物 通脈益智膠囊的藥物組成:女貞子15 g、何首烏20 g、丹參30 g、赤芍15 g、石菖蒲20 g、遠志10 g、漏蘆10 g.將上述藥物水煎煮后濃縮干燥,粉碎過篩,混勻制成膠囊,購自中日友好醫(yī)院試劑科,批號:Z20053786.

1.1.3主要實驗儀器 Morris水迷宮系統(tǒng),包括水迷宮、電腦攝像系統(tǒng)、配套軟件分析系統(tǒng),上海移碼數(shù)字有限公司生產(chǎn),由北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供.

1.2方法

1.2.1動物分組及給藥方法 將32只ApoE基因敲除小鼠隨機分為四組,即成年中藥組、老年中藥組、成年模型組及老年模型組,每組8只;將16只同品系C57BL/6J小鼠隨機分為兩組,即成年正常組及老年正常組,每組8只.成年組小鼠至20周起、老年組小鼠至32周起,中藥組以通脈益智膠囊750 mg/(kg.d)灌胃12周(本劑量根據(jù)人與實驗動物用藥劑量換算得出),模型組與正常組以同容積0.9%氯化鈉注射液灌胃12周,均每天1次.

1.2.2實驗方法 成年組小鼠到32周齡時、老年組小鼠到44周齡時,予Morris水迷宮實驗.Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分.定位航行實驗歷時5天,其中訓(xùn)練2天,正式測試3天,檢測小鼠的逃避潛伏期,統(tǒng)計結(jié)果以正式測試為準(zhǔn).空間探索實驗歷時1天,在定位航行實驗后正式測試后進行.根據(jù)池壁上懸掛的四個入水點,將水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限,第Ⅲ象限處存在隱匿平臺.定位航行實驗訓(xùn)練期間,小鼠每天分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限入水點處入水2次(每天共入水6次),由圖像采集及處理系統(tǒng)記錄小鼠航行軌跡、找到隱匿平臺時間(即:逃避潛伏期)等,若小鼠60秒內(nèi)未找到隱匿平臺,則逃避潛伏期按60秒計算,并由實驗者引導(dǎo)小鼠至平臺.待小鼠在平臺上休息10秒后撈出,將下只小鼠放入水池.定位航行實驗正式測試時,亦按照訓(xùn)練期間方式進行測試,并采集各項數(shù)據(jù);于正式測試結(jié)束后第二日進行空間探索實驗,小鼠入水步驟不變,將位于第Ⅲ象限隱匿平臺撤掉,記錄其在第Ⅲ象限航行的路程及時間,來考察小鼠對原平臺的記憶.

恒溫游泳池直徑120 cm,水深30 cm,隱匿平臺低于水面1～2 cm,水溫保持在(23±1)℃.為與黑色ApoE基因敲除小鼠形成鮮明對比,故在池水中加入適量奶粉,使池水呈現(xiàn)乳白色.

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析、處理.其中各組小鼠定位航行實驗成績、第Ⅲ象限航行的路程及時間為計量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組之間比較若符合正態(tài)分布且方差齊則采用單因素方差分析,兩組之間比較采用LSD及S-N-K統(tǒng)計方法;若符合正態(tài)分布而方差不齊則采用Tamhane's T2及Dunnett's T3檢驗;若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗;穿臺次數(shù)為計數(shù)資料,使用卡方檢驗;以P<0.01表示有顯著差異的界限.

2　結(jié)果

2.1定位航行實驗成績

先檢測每組小鼠每天定位航行時間,再匯總?cè)鞙y試結(jié)果(第三、四、五天),統(tǒng)計各組小鼠之間的定位航行時間差異,結(jié)果顯示,與老年模型組相比,老年中藥組定位航行時間更短,具有顯著差異(P<0.01),老年正常組航行時間亦較短,具有明顯差異(P<0.05).見表1、2,圖1A、B.

表1　各組小鼠定位航行實驗成績(±s,n=8,s)

表1　各組小鼠定位航行實驗成績(±s,n=8,s)

訓(xùn)練測試組別第三天第四天第五天成年中藥組53.68±12.645.04±16.543.79±16.3944.23±16第一天第二天.641.4±19.27成年模型組44.67±16.9743.81±14.0141.68±17.639.26±18.5538.68±15.92成年正常組48.6±17.6148.94±15.5241.57±18.1340.98±20.0447.79±16.91老年中藥組50.17±14.7836.87±14.2428.90±14.5734.76±18.5126.76±18.01老年模型組50.64±16.5646.26±15.8344.93±18.8337.46±20.8638.65±21.05老年正常組48.61±18.0838.79±19.8539.98±19.6934.35±16.727.51±16.06

表2　各組小鼠定位航行測試匯總結(jié)果(±s,n=8,s)

表2　各組小鼠定位航行測試匯總結(jié)果(±s,n=8,s)

注:與老年模型組相比,aP<0.01、bP<0.05.

組別測試匯總組別測試匯總組別測試匯總成年中藥組43.14±17.37成年模型組39.87±17.28成年正常組43.45±18.49老年中藥組30.14±17.29a老年模型組40.35±20.35老年正常組33.95±18.13b

圖1　各組小鼠定位航行實驗成績

第1天各組小鼠的定位航行實驗成績無明顯差異(P>0.05),隨著訓(xùn)練時間的增長,小鼠逃避潛伏期呈遞減趨勢.將第三天至第五天匯總后得出逃避潛伏期的成績(即測試成績)進行統(tǒng)計得出:成年各組之間,模型組較正常組及中藥組逃避潛伏期雖有所縮短,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);老年各組則可見明顯差異,與老年模型組相比,老年中藥組逃避潛伏期明顯縮短,具有顯著差異(P<0.01),老年正常組亦具有明顯差異(P<0.05),而老年中藥組與老年組之間無明顯差異(P>0.05).

2.2空間探索實驗

小鼠入水步驟不變,將位于第Ⅲ象限隱匿平臺撤掉,記錄其在第Ⅲ象限航行的路程及時間.穿臺次數(shù)的結(jié)果顯示:老年模型組較老年正常組有明顯差異(P<0.05),而成年各組之間無明顯差異(P>0.05).第Ⅲ象限路程:老年中藥組及老年模型組較正常組均有顯著差異(P<0.01).成年各組之間無明顯差異(P>0.05).第Ⅲ象限時間:老年中藥組及老年模型組較正常組均有明顯差異(P<0.05),成年各組之間無明顯差異(P>0.05).見表3.

表3　各組小鼠空間探索實驗成績(±s,n=8)

表3　各組小鼠空間探索實驗成績(±s,n=8)

注:與老年正常組相比,aP<0.01,bP<0.05.

組別穿臺次數(shù)第Ⅲ象限路程(cm)第Ⅲ象限時間(s)成年中藥組2.39±1.46445.9±119.3520.12±4.23 0.95±1.28175.19±124.3714.22±9.71成年模型組1.00±1.03215.12±74.5518.14±6.93成年正常組0.83±0.79197.07±70.7115.36±7.24老年中藥組1.78±1.44337.17±170.42a16.42±9.14b老年模型組1.50±1.88b348.0±306.99a16.40±13.33b老年正常組

空間探索實驗以穿越撤走平臺次數(shù)及平臺所在第Ⅲ象限的游泳路程及時間計算.空間探索實驗成績中,成年各組在穿臺次數(shù)、第Ⅲ象限游泳路程及第Ⅲ象限停留時間均無明顯差異(P>0.05).而老年各組中,老年正常組在第Ⅲ象限游泳路程顯著超越中藥組及模型組(P<0.01),老年正常組在第Ⅲ象限時間明顯超越中藥組及模型組(P<0.01),穿臺次數(shù)亦較模型組有明顯差異(P<0.05).

3　討論

本實驗中采用的Morris水迷宮是一種強迫實驗動物游泳,學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的一種實驗,主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力.由于本實驗ApoE基因敲除小鼠均飼養(yǎng)于清潔級動物房,在飼養(yǎng)周期無法將小鼠移出實驗室進行Morris水迷宮實驗,故水迷宮實驗僅在飼養(yǎng)周期完成后、取材前進行.Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示,成年各組ApoE基因敲除小鼠在學(xué)習(xí)及記憶能力未見明顯差異(P>0.05),說明當(dāng)ApoE基因敲除小鼠成年階段并未表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙,前期研究亦表明在小鼠32周齡時動脈硬化、高脂血癥等癥狀表現(xiàn)并不明顯.但是當(dāng)ApoE基因敲除小鼠進入老年化階段時,其認(rèn)知功能明顯減低.研究表明老年組小鼠在44周齡時,實驗成績顯示中藥組及正常組小鼠在記憶和學(xué)習(xí)能力方面明顯高于模型組小鼠(P<0.01),中藥組及正常組小鼠并無明顯差異(P>0.05).實驗結(jié)果將定位航行實驗中的三天測試結(jié)果相結(jié)合比較,增加了統(tǒng)計的樣本量,進而增加了統(tǒng)計的精確度;而最后一天的空間探索實驗由于小鼠數(shù)量有限,而且僅有一次空間探索結(jié)果,故樣本量較少,統(tǒng)計的精確度有待提高,在以后的實驗中應(yīng)增加實驗次數(shù)以提高統(tǒng)計的精確度.

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)屬癡呆范疇,其病位在心和腦,屬虛實夾雜之證,病機主要有腎精虧虛、髓海失充而導(dǎo)致腦失所養(yǎng),或由肝郁脾濕、痰阻血瘀造成腦脈痹阻.治以補腎填精、益智開竅、滌痰化瘀為法,佐以益氣健脾、養(yǎng)血柔肝、通絡(luò)開痹之品.通脈益智膠囊中女貞子、何首烏補肝益腎,填精充髓,有滋陰強壯之力,為君藥;丹參、赤芍活血化瘀,為臣藥;石菖蒲、遠志芳香化濁,祛痰利竅,為佐藥;再配以漏蘆清熱通竅疏經(jīng),諸藥合用,共奏補肝益腎、化瘀祛痰、益智醒神之功.

研究發(fā)現(xiàn)[1],ApoE基因可能與記憶呈相關(guān)性. ApoE基因敲除小鼠的血腦屏障的通透性是普通小鼠的3.7倍,這就導(dǎo)致一些非必需小分子化合物進入大腦,造成大腦功能的部分紊亂,從而可能引發(fā)老年癡呆[2].Zhang N等[3]發(fā)現(xiàn),載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)β-淀粉樣蛋白的表達高于C57BL/6J小鼠,與ApoE基因異常導(dǎo)致AD等神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能障礙可能有著密切聯(lián)系.ApoE基因敲除小鼠一直被用于動脈粥樣硬化的研究,由于其認(rèn)知功能的異常,故近期亦被用于認(rèn)知障礙的研究.

Morris水迷宮實驗成年組及老年組ApoE基因敲除小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)成績可知,補腎祛瘀化痰法針對認(rèn)知功能障礙有一定改善作用,而且在前期研究中,補腎祛瘀化痰法針對血管性癡呆[4]、動脈粥樣硬化[5]及高脂血癥等均有較好療效.本實驗通過對中藥干預(yù)ApoE基因敲除小鼠Morris水迷宮實驗的研究,證明補腎祛瘀化痰法具有改善小鼠認(rèn)知功能的作用,為進一步深入開展實驗及臨床研究打下基礎(chǔ).

[1] Masliah E,SamuelW,Veinbergs I,et al.Neurodegeneration and cognitive impairment in ApoE-deficient mice is ameliorated by infusion of recombinant ApoE[J].Brain Res,1997,751(12): 307-314.

[2] Hafezi-Moghadam A,Thom as KL,Wagner DD.ApoE deficiency leads to a progressive age-dependent blood-brain barrier leakage [J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,292(4):1256-1262.

[3] Zhang N,Jia XM,Xu L,et al.The expression change of amyloid protein β in the hippocampal neurons of ApoE knockoutmice[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui,2011,46(6):531-534.

[4] Wang H,Yan XP.Changes of ET and CGRP in Vascular Dementia with TongmaiyizhiCapsule[J].Journal of Beijing University of TCM,2000,23(2):64-65.

[5] Zhang TZ,Wang YX.Experiment on the Effects of Tongmaiyizhi Capsules AgainstAtherosclerosis[J].Journal of Beijing University of TCM,2002,25(5):33-37.

(本文編輯:韓虹娟)

The effects of tonifying kidney and removing stasis and phlegm on morris water maze of ApoE knockout mice

JIANG Yang,YANG Hui-min,MA Yu-qi,et al. Department of traditional Chinese medicine,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China
Corresponding author:JIANG Yang,E-mail:jiangyang310@sohu.com

Objective To assess the effects of tonifying kidney and removing stasis and phlegm on the test of morris water maze of ApoE knockout mice in adult and old groups.Methods ApoE knockout mice were divided into adult treatment group,adult model group,old treatment group and old model group. And C57BL/6J mice were divided into adult normal groups and old normal groups.When the adult groups mice were 32 weeks and the old groups were 44 weeks,the mice were tested by morris water maze.The scores of navigation experiment and space exploration experiment in morris water maze were recorded. Results The escape latency of adult rats in the treatment group,model group and normal group had no significantly difference(P>0.05).But in old rats,the escape latency of the model group was significantly longer than that of the normal group and treatment group.The space exploration experiment showed that the normal group was much better than the treatment and model groups.Conclusions The normal group and the treatment group show better scores in morris water maze than the model group.The results support that tonifying kidney and removing stasis and phlegm can improve cognitive function of old ApoE knockout mice.

Tonifying kidney and removing stasis and phlegm; ApoE knockout mice; Morris water maze

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.006

北京中醫(yī)藥大學(xué)博士自主課題(2013-JYB22-XS-128)

100035 北京積水潭醫(yī)院中醫(yī)科(姜洋、馬玉棋、梁志齊);北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院教務(wù)處(楊惠民)

姜洋(1986-),女,博士,住院醫(yī)師.研究方向:中醫(yī)老年病學(xué).E-mail:jiangyang310@sohu.com

2015-06-12)