羅　薇，冉丹丹，陳冬平，劉　群

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌感染實(shí)驗(yàn)小鼠的組織病理學(xué)及抗原分布

羅薇，冉丹丹，陳冬平，劉群

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

為了研究天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌感染致實(shí)驗(yàn)小鼠的組織病理學(xué)變化和其菌體抗原的組織分布，奠定菌株致病機(jī)制的研究基礎(chǔ)，采用天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌株口腔灌服感染實(shí)驗(yàn)小鼠，在感染后不同時(shí)點(diǎn)采集小鼠11個(gè)組織臟器制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色和免疫酶組織化學(xué)染色，對(duì)感染小鼠的組織病變及菌體抗原的分布進(jìn)行觀察。感染小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸道、腦等組織在感染3～6 h后開(kāi)始出現(xiàn)炎性反應(yīng)，直至感染后14 d；感染鼠回腸組織有顯著的壞死、脫落及炎性損傷，右心室呈現(xiàn)脫落的血栓栓子，肺泡壁增厚、血管充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和支氣管肺炎，多臟器變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多臟器組織可見(jiàn)“傷寒小結(jié)”。感染3 h，除腦外，其他被檢臟器皆檢出細(xì)菌抗原，除感染途徑腸道細(xì)菌抗原含量極高，脾、心、肺、肝的陽(yáng)性信號(hào)也很強(qiáng)，且主要存在組織的細(xì)胞質(zhì)中。研究結(jié)果提示天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌能感染實(shí)驗(yàn)小鼠，侵嗜小鼠多個(gè)臟器，長(zhǎng)時(shí)間不同程度地引起多臟器變性、壞死及炎性反應(yīng)。

天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌；病理變化；抗原分布

沙門(mén)菌是腸桿菌科中一類重要的食源性人畜共患病原菌，血清型種類繁多，絕大多數(shù)血清型能在人和動(dòng)物間交叉感染，人一旦攝入了含有大量沙門(mén)菌的動(dòng)物源性食品，會(huì)造成感染性腹瀉和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門(mén)菌引起的中毒病例占首位或第二位，每年皆有不同程度的沙門(mén)菌中毒事件的報(bào)道。2012年美國(guó)部分州暴發(fā)活禽引發(fā)的沙門(mén)菌疫情，造成該地區(qū)517人感染，據(jù)認(rèn)為感染者接觸帶沙門(mén)菌雞鴨可能是疫情暴發(fā)的原因[1]。1994—2005年，我國(guó)共報(bào)道了57 612起食物中毒事件，22.2%歸因于沙門(mén)菌[2]。王曉泉等2003—2005年在江蘇部分地區(qū)分離的117株沙門(mén)菌中有81株來(lái)自動(dòng)物源食品[3]；胡杰等2006—2012年對(duì)廣西規(guī)模場(chǎng)、活禽市場(chǎng)以及農(nóng)村散養(yǎng)雞進(jìn)行沙門(mén)菌感染情況調(diào)查，結(jié)果顯示，活禽市場(chǎng)雞沙門(mén)菌感染陽(yáng)性率為20.81%～33.2%，且傷寒沙門(mén)菌的陽(yáng)性率為22.52%[4]。丙型副傷寒是由丙型副傷寒沙門(mén)菌引起的經(jīng)消化道傳播的人類急性傳染病，臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎或膿毒血癥。近年，丙型副傷寒沙門(mén)菌引起人類食物中毒案例報(bào)道有所增多，其病原感染引發(fā)的問(wèn)題多限于疾病發(fā)生的流行報(bào)告及其病例的臨床診治[5-6]，也有少量與病原結(jié)構(gòu)和功能等相關(guān)研究[7-11]，其致病機(jī)制、系統(tǒng)組織病變等問(wèn)題卻少有涉及。作者以實(shí)驗(yàn)小鼠為感染對(duì)象，建立丙型副傷寒沙門(mén)菌感染的實(shí)驗(yàn)病理模型，對(duì)感染鼠的動(dòng)態(tài)組織病理變化和細(xì)菌抗原定位進(jìn)行觀察，以期了解天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)試驗(yàn)小鼠的致病機(jī)制，為闡明動(dòng)物源丙型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)人類的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株

丙型副傷寒沙門(mén)菌DT4株：源自成都邛崍地區(qū)大雁、天鵝馴養(yǎng)基地外表健康的成年白天鵝肛拭子，采用常規(guī)細(xì)菌分離、鑒定方法鑒定為丙型副傷寒沙門(mén)菌，四川醫(yī)學(xué)疾控中心鑒定確認(rèn)，西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20～22 g健康昆明系SPF小白鼠，購(gòu)自中醫(yī)研究院。實(shí)驗(yàn)鼠飼養(yǎng)于消毒的鼠籠內(nèi)，飼料、墊料、飲用水均采用常規(guī)方法進(jìn)行沙門(mén)菌檢測(cè)，結(jié)果陰性。

1.3主要試劑

Rabbit Anti-Salmonella tropina、免疫組化SP 染色試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 染色試劑盒均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司。

1.4丙型副傷寒沙門(mén)菌感染小鼠模型的建立及樣品采取

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為感染組(45只)和對(duì)照組(45只)，感染組每只口服0.5 mL菌液(3.6×109CFU)，對(duì)照組每只口服0.5 mL滅菌生理鹽水。攻毒后，觀察小鼠臨床癥狀，并于感染后3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、168 h和14 d等10個(gè)時(shí)間點(diǎn)各剖殺3只感染組小鼠(頻死者、發(fā)病者優(yōu)先)和3只對(duì)照組小鼠，觀察組織器官病變情況，采集其心、肝、脾、肺、腎和腸道(十二指腸、空腸、回腸、盲腸、大腸)、腦等組織臟器，分別置于4% 多聚甲醛中固定。

1.5組織切片的制作及HE染色觀察

將置于4% 多聚甲醛中固定24 h的被采樣本，進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，按常規(guī)的石蠟制片方法制作組織切片，用Nikon顯微鏡進(jìn)行組織切片觀察，SPOTADVANCE拍照、圖像處理。

1.6免疫組化染色觀察

同“1.5”制作組織切片，進(jìn)行免疫組化染色及檢測(cè)，具體步驟參照ABC檢測(cè)試劑盒、超敏即用型二歩法(非生物素)檢測(cè)試劑盒PV9003說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用Nikon ECLIPSE 6200 顯微數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)觀察采集圖像，并用ImagePro-Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量其陽(yáng)性顆粒累積光密度值(IOD)。

2　結(jié)　果

2.1感染小鼠的臨床癥狀

感染后6 h小鼠開(kāi)始聚攏扎堆、嗜睡；感染后12 h小鼠出現(xiàn)精神萎靡，被毛蓬松，采食量和飲水量明顯減少；36 h小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡。5 d后存活小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，逐漸恢復(fù)常態(tài)生活。陰性對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯變化。

2.2感染小鼠病理剖檢變化

感染后24 h部分實(shí)驗(yàn)鼠肝可見(jiàn)白色壞死點(diǎn)。感染后12 h肺可見(jiàn)點(diǎn)狀出血，24 h呈現(xiàn)斑片狀淤血、出血灶，隨時(shí)間推移出血程度逐漸加重，但在感染后7 d剖檢觀察見(jiàn)出血面積減少。腸道感染6 h前未見(jiàn)明顯眼觀變化，感染后12 h腸壁變薄呈透明狀，有點(diǎn)狀出血，腸腔內(nèi)有多量黃色黏液狀內(nèi)容物，感染后36 h腸黏膜壞死脫落；感染后14 d剖檢6只存活鼠，其中2只腸腔明顯擴(kuò)張，腸腔內(nèi)充盈有多量的水樣內(nèi)容物及氣體。其他臟器未見(jiàn)明顯病變。

2.3感染小鼠的組織病理學(xué)變化

感染小鼠心、肝、脾、肺、腎、腸道、腦均有不同程度的病理變化。

2.3.1心感染后3 h，肌間小血管淤血，右心室可見(jiàn)若干脫落的血栓栓子；感染后6 h，除3 h病變外(圖1A)，心內(nèi)膜表面的內(nèi)皮及其心外膜內(nèi)皮下均有多量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞，肌間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；感染后24 h，肌間小血管淤血、出血，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及絮狀纖維蛋白；感染后36～48 h，心肌纖維先是顆粒變性，為空泡樣變，病變持續(xù)至感染后96 h；在感染后7、14 d右心室仍有多個(gè)脫落的血栓栓子。

2.3.2肝感染后3～12 h，肝小葉間靜脈血管擴(kuò)張、淤血；感染后24～96 h肝細(xì)胞腫脹、空泡變，肝小葉內(nèi)可見(jiàn)多量網(wǎng)狀細(xì)胞聚集形成的“傷寒小結(jié)”(圖1B)；14 d分布在匯管區(qū)的小血管周?chē)摹皞〗Y(jié)”依舊可見(jiàn)，三只存活實(shí)驗(yàn)鼠兩只有肝脂肪變。

2.3.3脾感染后6 h，脾組織疏松，紅髓、白髓結(jié)構(gòu)比較清楚，脾竇隙內(nèi)可見(jiàn)大單核細(xì)胞和多核巨噬細(xì)胞；感染后12 h，紅髓髓竇擴(kuò)張、紅細(xì)胞增多；感染后36～72 h，紅髓髓竇紅細(xì)胞數(shù)量明顯增多；感染后96 h，脾白髓有較多的多核巨噬細(xì)胞、大單核細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞(圖1C)；感染后7～14 d，脾白髓面積增大，但淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不顯。

2.3.4肺感染后3～24 h，隨時(shí)間推移肺組織病理變化漸漸加重，肺泡壁增厚血管充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，一些支氣管周?chē)⒀苤車(chē)筒糠址闻輧?nèi)也出現(xiàn)了相似的病理變化(圖1D)；感染后48 h，除上述病變尚存外，一些病灶中心的細(xì)支氣管管腔內(nèi)充滿有炎性滲出物，其中以中性粒細(xì)胞為主，此外，還混有脫落的氣管黏膜上皮細(xì)胞及纖維蛋白，病灶周?chē)写鷥斝苑螝饽[；96 h，肺的大部分正常組織結(jié)構(gòu)被病變組織取代(圖1E)；感染后7、14 d，存活鼠肺仍有支氣管肺炎病灶存在。

2.3.5腎感染后6 h，腎近曲小管上皮細(xì)胞腫脹，致使管腔狹窄，腎遠(yuǎn)曲小管、集合管上皮細(xì)胞空泡變明顯增多，管腔中有粉染絮狀纖維蛋白滲出物，小葉間血管擴(kuò)張、充血；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，病變程度加劇，48 h，除上述病變外，腎小球血管叢體積增大，血管叢間有逸出紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；感染后72～96 h，病變腎小球增多，腎小管上皮細(xì)胞濁腫、空泡變性程度加重，小葉間血管充血、出血(圖1F)；感染后7 d、14 d 存活鼠仍可見(jiàn)腎、臟組織的病變。

2.3.6腸道按腸段介紹如下：

十二指腸：病變程度不嚴(yán)重，感染后3～96 h，腸黏膜有局灶性病變，腸絨毛斷裂(圖1G)，固有層毛細(xì)血管充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；感染后7、14 d，殘存的腸絨毛固有層仍可見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞和“傷寒小結(jié)”。

空腸：病變程度與十二指腸相近，感染后3～96 h，部分腸絨毛斷裂、脫落，腸腔有纖維蛋白滲出物和少量的紅細(xì)胞，可見(jiàn)“傷寒結(jié)節(jié)”；感染后7、14 d，存活鼠腸固有層及黏膜下結(jié)締組織仍見(jiàn)有浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。

回腸：其組織病變較十二指腸、空腸嚴(yán)重，感染后3 h，部分腸絨毛斷裂、脫落，腸腔黏膜面附著有多量絮狀纖維蛋白滲出物及炎性細(xì)胞；感染后12～96 h，組織病變程度加重，腸黏膜面可見(jiàn)較多的紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞和纖維蛋白滲出物，腸絨毛損傷、脫落明顯增多，(圖1H)，固有層、黏膜下層結(jié)締組織炎性細(xì)胞明顯增多，血管擴(kuò)張充血、出血，可見(jiàn)“傷寒小結(jié)”；7、14 d，存活鼠仍有組織病變。

結(jié)腸：組織病變較輕。感染后3 h～14 d，結(jié)腸黏膜有脫落，腸腔內(nèi)見(jiàn)有炎性滲出物，固有層炎性細(xì)胞數(shù)量增多，可見(jiàn)“傷寒小結(jié)”(圖1I)。

2.3.7 腦在感染后的6 h～14 d，腦組織有局域性的神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)疏松，呈篩網(wǎng)狀的脫髓鞘改變，血管擴(kuò)張充血、出血，部分血管周邊及腦組織有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有些小膠質(zhì)細(xì)胞成灶狀聚集。

2.4感染小鼠臟器組織中細(xì)菌抗原的分布

Image Pro-Plus 6.0軟件分析的多臟器組織免疫組化結(jié)果顯示，不同時(shí)間感染鼠的各器官組織檢測(cè)到的細(xì)菌抗原累積光密度(IOD)的信號(hào)強(qiáng)度不同，同一時(shí)間點(diǎn)不同器官組織檢測(cè)到細(xì)菌抗原的信號(hào)強(qiáng)度也有很大的差異(圖2、圖3)。

2.4.1心小鼠心從感染后3 h的弱陽(yáng)性到48 h強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，隨后陽(yáng)性信號(hào)逐漸減弱，直至14 d仍可檢出較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)。陽(yáng)性信號(hào)顆粒主要出現(xiàn)在心肌纖維細(xì)胞胞質(zhì)中，少數(shù)細(xì)胞核也有陽(yáng)性反應(yīng)(圖4A)；3只平行小鼠感染強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異。

A.感染后6 h，右心室多個(gè)脫落的血栓栓子；B.感染后24 h肝細(xì)胞空泡變，小葉間血管擴(kuò)張充血，可見(jiàn)“傷寒小結(jié)”(圖中箭頭所示)；C.感染后96 h，脾竇隙內(nèi)的多核巨噬細(xì)胞、大單核細(xì)胞；D.感染后24 h，肺泡壁增厚血管充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；E.感染后96 h，支氣管肺炎；F.感染后72 h，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、腎小球血管叢體積增大；G.感染后3 h，十二指腸絨毛斷裂；H.感染后12 h，回腸絨毛斷裂、脫落，腸黏膜面覆蓋有紅細(xì)胞、炎細(xì)胞和纖維蛋白滲出物；I.感染后12 h，結(jié)腸腸皺襞刷狀緣及皺襞組織脫落，固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)” A.6 h after being challenged，several fall-off thromboemblus in ventriculus dexter；B.24 h after being challenged，physalides，eclasis and hyperemia in interlobular blood vessel，typhoid nodule were observed (Indicated by the arrows in the figure)；C.96 h after being challenged，a large number of multinucleated giant cells and macromonocyte in space of sinus lienis were observed；D.24 h after being challenged，alveolar wall thickening of the blood vessel hyperemia，edema，inflammatory cells infiltration were observed；E.96 h after being challenged，bronchopneumonia were observed；F.72 h after being infected，swelling of renal cells and capillary bundle volume increase were observed；G.3 h after being challenged，break of duodenum villi was observed；H.12 h after being challenged，break and fall-off ileum villi and red blood cells，inflammatory cells and exudation focus of fibraesanguis in intestinal mucosa were observed；I.12 h after being challenged，fall-off of brush border of colon and plica tissue and lamina propria inflammatory cells infiltration were observed圖1　小鼠人工感染丙型副傷寒沙門(mén)菌株后的病理組織學(xué)變化(200×)Fig.1　Pathological changes of the main organs of the mice challenged by S.Paratyphi C(200×)

2.4.2肝小鼠感染24 h后肝可見(jiàn)中等強(qiáng)度的陽(yáng)性信號(hào)，隨著時(shí)間推移，陽(yáng)性信號(hào)逐漸增強(qiáng)，96 h陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到高峰，之后陽(yáng)性信號(hào)減弱，14 d仍然可檢測(cè)到中等強(qiáng)度的陽(yáng)性信號(hào)。陽(yáng)性信號(hào)顆粒主要分布于肝細(xì)胞質(zhì)(圖4B)；3只平行小鼠感染強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異。

圖2　免疫組化檢測(cè)感染鼠各時(shí)間點(diǎn)各臟器中IOD動(dòng)態(tài)變化Fig.2　Changes ofIOD of IHC staining different organs at different time

圖3　免疫組化檢測(cè)感染鼠各時(shí)間點(diǎn)腸道中陽(yáng)性累積光密度值動(dòng)態(tài)變化Fig.3　Changes of IHC staining IOD in different intestine sections at different time

2.4.3脾感染后3 h脾中可檢測(cè)到弱陽(yáng)性信號(hào)；感染后12 h便可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，信號(hào)隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)，96 h達(dá)到最強(qiáng)，之后陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度減退，但在14 d仍然可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。感染組3只平行小鼠免疫組化檢測(cè)到的脾組織陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯差異，陽(yáng)性顆粒在紅髓區(qū)、白髓區(qū)的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有出現(xiàn)，其中紅髓區(qū)陽(yáng)性信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)，且紅髓區(qū)邊緣部位陽(yáng)性細(xì)胞分布更密集(圖4C)。

2.4.4肺感染后3 h肺中可以檢測(cè)到弱陽(yáng)性信號(hào)；12 h檢測(cè)到中等強(qiáng)度的陽(yáng)性信號(hào)，96 h達(dá)到最強(qiáng)，之后陽(yáng)性信號(hào)開(kāi)始減退，但14 d仍可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。在相同感染時(shí)間，感染組的3只平行鼠肺陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度差異不明顯。陽(yáng)性信號(hào)顆粒主要分布于肺泡壁毛細(xì)血管上皮、支氣管黏膜上皮細(xì)胞、支氣管腔和肺泡中的炎性滲出物、血管中的血細(xì)胞(圖4D、E)。

2.4.5腎感染后6、12 h腎能檢測(cè)到弱陽(yáng)性信號(hào)；96 h陽(yáng)性信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，7 d開(kāi)始陽(yáng)性信號(hào)減弱，感染后的14 d仍可檢測(cè)到弱陽(yáng)性信號(hào)。陽(yáng)性信號(hào)顆粒主要分布在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)和腎小球毛細(xì)血管基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中(圖4F)。3只平行鼠腎的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度有部分差異。

2.4.6腸道按腸段分別介紹如下：

十二指腸：感染后3 h十二指腸中檢測(cè)到中等陽(yáng)性信號(hào)，96 h達(dá)到最強(qiáng)(圖4G)，7、14 d十二指腸中檢測(cè)到的陽(yáng)性信號(hào)且依舊很強(qiáng)。感染組的3只平行鼠的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異。陽(yáng)性顆粒主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞。

空腸：感染3 h可檢測(cè)到較強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，12、24 h陽(yáng)性信號(hào)有所減弱，感染后36～72 h陽(yáng)性信號(hào)快速增強(qiáng)，感染后96 h陽(yáng)性信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，直至感染后14 d仍然可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，且強(qiáng)度大于第7天。感染組3只平行鼠空腸陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度差異不明顯。陽(yáng)性信號(hào)主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。

回腸：感染后3 h回腸中可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)；感染后12 h陽(yáng)性信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，24、36 h陽(yáng)性信號(hào)有所減弱，但仍為強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)(圖4H)，感染后72、96 h陽(yáng)性信號(hào)再次達(dá)到最強(qiáng)，直至感染后14 d仍可檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。陽(yáng)性信號(hào)顆粒主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖4H)。

結(jié)腸：小鼠感染后3 h檢測(cè)到極強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)；除感染后的12～24 h和7～14 d兩個(gè)時(shí)段陽(yáng)性信號(hào)有所減弱(但信號(hào)為強(qiáng)陽(yáng)性)外，結(jié)腸中的陽(yáng)性信號(hào)在檢測(cè)階段一直持續(xù)高強(qiáng)；陽(yáng)性顆粒主要分布在腸黏膜上皮和腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(圖4I)。

腦：小鼠感染后6 h腦組織檢測(cè)到弱陽(yáng)性信號(hào)，一直持續(xù)到感染后72 h。陽(yáng)性信號(hào)主要見(jiàn)于神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。

3　討　論

沙門(mén)菌病一直是困擾全球的問(wèn)題。研究資料表明，絕大多數(shù)沙門(mén)菌血清型宿主范圍廣泛，但少數(shù)血清型有嚴(yán)格的宿主特異性，如引起腸熱癥的傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、乙型沙門(mén)菌和丙型沙門(mén)菌，這些病原被認(rèn)為主要是人類的病原菌，極少能從動(dòng)物中分離到[12]。2008—2011年研究者在對(duì)四川成都周邊天鵝、大雁馴養(yǎng)基地沙門(mén)菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，從594份外表健康的天鵝、大雁肛拭子中分離出的37株沙門(mén)菌中，經(jīng)血清學(xué)檢驗(yàn)確認(rèn)丙型副傷寒沙門(mén)菌有9株。沙門(mén)菌被認(rèn)為可在人類與動(dòng)物間通過(guò)直接或間接途徑傳播，引起腸道和全身感染性疾病[13]。丙型副傷寒沙門(mén)菌引起的丙型副傷寒是經(jīng)消化道傳播的人類急性傳染病，臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎或膿毒血癥。

小白鼠為嚙齒類哺乳動(dòng)物，因其組織結(jié)構(gòu)、生理功能與人類有許多相似之處，加之易于實(shí)驗(yàn)操作、觀察，是人類臨床實(shí)驗(yàn)中常被選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[14-16]。源自外表健康天鵝攜帶的丙型副傷寒沙門(mén)菌在動(dòng)物和人的傳染病的流行病學(xué)中有無(wú)價(jià)值，對(duì)人類有無(wú)致病性、病理?yè)p傷如何，我們并不了解。本研究以口服感染禽源丙型副傷寒沙門(mén)菌方式建立的小鼠感染模型，很好的模擬了食源沙門(mén)菌的自然感染狀態(tài)。通過(guò)觀察小鼠在感染病原后不同時(shí)段組織器官細(xì)菌抗原IOD，提示丙型副傷寒沙門(mén)菌主要在腸道繁殖，且主要在回腸、盲腸和大腸(結(jié)腸)等部位增殖；但組織病理變化卻顯示，被病原侵襲的腸組織以回腸損傷明顯，在感染后3 h已呈現(xiàn)出程度不同炎性變化，腸絨毛斷裂、脫落，病變持續(xù)存在直至14 d仍有損傷、充血、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而其他腸段尤其是大腸和盲腸的損傷則較輕。有研究表明，沙門(mén)菌主要在腸道生長(zhǎng)繁殖，病原菌將其含有甘露醇的細(xì)胞受體先黏附于回腸黏膜上的特殊上皮細(xì)胞“M細(xì)胞”表面，引發(fā)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白重排、內(nèi)在化，細(xì)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖后釋放于上皮下區(qū)，被固有層巨噬細(xì)胞吞噬[17]。這也就不難解釋觀察到的回腸損傷顯著的問(wèn)題。傷寒類沙門(mén)菌在宿主體內(nèi)可形成Vi抗原，以抵抗吞噬細(xì)胞的殺傷，阻擋補(bǔ)體、抗體的破壞作用，被巨噬細(xì)胞吞噬的傷寒類菌通過(guò)淋巴液到達(dá)腸系膜淋巴結(jié)；部分沙門(mén)菌經(jīng)胸導(dǎo)管入血形成菌血癥，菌隨血流入肝、脾、膽囊等器官，引起組織病理?yè)p傷，引發(fā)臨床前驅(qū)癥狀，病原在臟器繁殖后再次入血造成二次菌血癥[18]。IOD檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口服途徑感染的病原體抗原，在感染后的3 h已不同程度地出現(xiàn)在被觀察的臟器組織中，心、肝、脾、肺、腎組織中的菌體抗原主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)，結(jié)腸、回腸、十二指腸中的病原抗原高于空腸、盲腸，脾、肝、心、肺組織中的抗原檢出量明顯高于腎。除腎細(xì)菌抗原IOD陽(yáng)性信號(hào)始終較弱外，其他被檢測(cè)的臟器組織的陽(yáng)性信號(hào)在感染的不同時(shí)段強(qiáng)度有所差異，且呈正態(tài)分布。對(duì)試驗(yàn)鼠的器官組織切片、HE染色及病理學(xué)觀察顯示：天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌感染小鼠所呈現(xiàn)出的組織臟器損傷是一種泛嗜性的，隨著病原感染時(shí)間推移，絕大部分的損傷都有不同程度的加重，甚至在攻毒后的14 d組織損傷仍然存在，與一些學(xué)者[19-20]所描述的沙門(mén)菌所致的腸組織病變相似。在作者的試驗(yàn)中，感染鼠多個(gè)器官組織皆有程度不同的血管擴(kuò)張、充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性反應(yīng)和細(xì)胞的變性、壞死等組織病變。值得一提的是，感染后3 h，右心腔內(nèi)可見(jiàn)若干脫落的纖維蛋白血栓栓子，提示少量感染病原(如肝細(xì)菌抗原OID 1 105.27±172.80)的內(nèi)毒素進(jìn)入血液，就可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。肺病原感染后3 h(肺OID 1 179.06±167.77)，肺泡壁增厚血管充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，一些支氣管周?chē)?、血管周?chē)筒糠址闻輧?nèi)也出現(xiàn)了相似的病理變化；48 h后，肺內(nèi)沙門(mén)菌抗原(OID)達(dá)到92 299.92±5 667.39，除3 h可見(jiàn)的病理變化外，一些病灶中心的細(xì)支氣管管腔內(nèi)充滿有炎性滲出物，其中以中性粒細(xì)胞為主，此外，還混有脫落的氣管黏膜上皮細(xì)胞及纖維蛋白。另外，在被檢的肝、脾、十二指腸、空腸、回腸、大腸等多個(gè)器官可觀察到有具有診斷意義的“傷寒小結(jié)”。

A.感染后24 h抗原分布在心肌細(xì)胞胞質(zhì)，強(qiáng)陽(yáng)性；B.感染后24 h抗原分布于肝細(xì)胞胞質(zhì)，強(qiáng)陽(yáng)性；C.感染后24 h脾，抗原在紅髓、白髓區(qū)的淋巴細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，紅髓區(qū)陽(yáng)性信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)；D.感染后24 h，主要分布于肺泡壁毛細(xì)血管上皮，強(qiáng)陽(yáng)性；E.感染后96 h，抗原分布于肺泡壁毛細(xì)血管上皮、支氣管黏膜上皮細(xì)胞、支氣管腔和肺泡中的炎性滲出物、血管中的血細(xì)胞團(tuán)，強(qiáng)陽(yáng)性；F.感染后24 h，抗原分布在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)，腎小球毛細(xì)血管基質(zhì)，陽(yáng)性；G.感染后96 h，抗原分布于十二指腸腸絨毛上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞，強(qiáng)陽(yáng)性；H.感染后48 h，抗原分布在回腸絨毛上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)；I.感染后36 h，抗原分布在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)A.24 h after being challenged，antigen mainly existed in cytolymph of cardiac muscle cell (strongly positive)；B.24 h after being challenged，antigen existed in cytolymph of liver (strongly positive)；C.24 h after being challenged，antigen existed in cytolymph of leukomonocyte in red pulp and white pulp of spleen，and positive signal in red pulp was stronger；D.24 h after being challenged，antigen was dispersed in lung，antigen located in lung epithelial cells cytoplasm (strongly positive)；E.96 h after being challenged，antigen existed in the epithelium of alveolar walls blood capillary，bronchial mucosa epithelial cells，inflammatory exudate in bronchial and alveolar cavity，the clumps of cells in the blood vessels(strongly positive)；F.24 h after being challenged，antigen existed in renal tubular epithelial cell plasma and glomerular capillary matrix，positive；G.96 h after being challenged，antigen existed in villi of duodenum and epithelium of enteraden (strongly positive)；H.48 h after being challenged，antigen existed in villi of ileum and cytolymph of enteraden epithelium；I.36 h after being challenged，antigen existed in colonic mucosa epithelial cells and intestinal epithelial cell cytoplasm(strongly positive)圖4　感染小鼠組織中丙型副傷寒沙門(mén)菌株的免疫組化染色(200×)Fig.4　Salmonella Paratyphi C in tissues of the challenged mice with immuno-histochemistrydouble staining(200×)

由此可見(jiàn)，自外表健康白天鵝肛拭子分離鑒定的丙型副傷寒沙門(mén)菌，經(jīng)口服途徑感染研究模型選用的實(shí)驗(yàn)小鼠，病原既可直接作用于腸道引起腸組織結(jié)構(gòu)壞死、脫落及炎性損傷，還可快速突破腸壁屏障進(jìn)入宿主循環(huán)系統(tǒng)，作用于多個(gè)臟器組織引起廣泛病變，持續(xù)損傷。值得關(guān)注的發(fā)現(xiàn)，口服天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌的實(shí)驗(yàn)鼠的右心腔被觀察到有多個(gè)脫落的纖維素性血栓栓子；呼吸系統(tǒng)在感染后3 h呈現(xiàn)出肺泡壁增厚、血管充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；感染后48 h可見(jiàn)支氣管肺炎；腎組織內(nèi)的病原抗原盡管始終處于被檢臟器組織最低值，在感染后48 h除腎小管損傷也見(jiàn)有腎小球腎小球血管叢體積增大，血管叢間有逸出紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；暗示源于外表健康的天鵝源丙型副傷寒沙門(mén)菌的口服感染實(shí)驗(yàn)小鼠不僅引起腸道損傷，還可侵襲全身多個(gè)器官組織并產(chǎn)生嚴(yán)重的致病作用，其對(duì)人類是否有相似的器官組織損傷和/或致病性尚需證實(shí)。

[1]NAKAO J H，PRINGLR J，JONES R W，et al.‘One Health’ investigation：outbreak of humanSalmonellaBraenderup infections traced to a mail-order hatchery-United States，2012-2013[J].EpidemiolInfect，2015，10(143)：2178-2186.

[2]朱麗娜.成都地區(qū)大雁、天鵝源沙門(mén)氏菌病原特性及丙型副傷寒沙門(mén)氏菌的分子生物學(xué)特性研究[D].成都：西南民族大學(xué)，2011.

ZHU L N.Pathogenic Characteristics of Salmonella from Cygnus and Anser indicus in Chengdu area and molecular biological characteristics ofSalmonellaParatyphiC[D].Chengdu：South-west University for Nationalities，2011.(in Chinese)

[3]胡杰，張步嫻，屈素潔，等．2006-2012年廣西雞沙門(mén)氏菌感染情況調(diào)查[J]．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013(6)：4-6．

HU J，ZHANG B X，QU S J，et al.ChickenSalmonellainfection investigation in guangxi in 2006-2012[J].ShanghaiJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，2013(6)：4-6.(in Chinese)

[4]王曉泉，焦新安，劉曉文，等.江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門(mén)氏菌的多重耐藥性研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47(2)：221-227.

WANG X Q，JIAO X A，LIU X W，et al.Characterization of multidrug-resistantSalmonellaisolated from meats and human samples in some regions of Jiangsu[J].ActaMicrobiologicaSinica，2007，47(2)：221-227.(in Chinese)

[5]朱翔.一起丙型副傷寒沙門(mén)菌引起的食物中毒調(diào)查[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，12：49-50.

ZHU X.A food poisoning investigation caused by C paratyphoidSalmonella[J].ZhejiangJournalofPreventiveMedicine，2011，23(12)：49-50.(in Chinese)

[6]戴婧.一起由丙型副傷寒沙門(mén)氏菌引起食物中毒的報(bào)告[J].青海醫(yī)藥雜志，2012，7：71-72.

DAI J.A food poisoning report caused by C ParatyphoidSalmonella[J].QinghaiMedicalJournal，2012，42(7)：71-72.(in Chinese)

[7]DE JONG H K，PARRY C M，VAN DER POLL T，et al.Host-pathogen interaction in invasive Salmonellosis[J].PLoSPathon，2012，8(10)：e1002933

[8]SWEARINGEN M C，PORWOLLIK S，DESAI P T，et al.Virulence of 32Salmonellastrains in mice[J].PLoSOne，2012，7(4)：e36043

[9]SETHSMITH H M.SPI-7：Salmonella’s Vi-encoding pathogenicity island[J].JInfectDevCtries，2008，2(4)：267-271.

[10]GAL-MOR O，BOYEL E C，GRASSL G A.Same species，different diseases：how and why typhoidal and non-typhoidalSalmonellaentericaserovarsdiffer[J].FrontMicrobiol，2014，5(4)：1-10.

[11]NYE K J，F(xiàn)ALLON D，F(xiàn)RODSHAM D，et al.An evaluation of the performance of XLD，DCA，MLCB，and ABC agars as direct plating media for the isolation ofSalmonellaentericafrom faeces[J].JClinPathol， 2002，55(4)：286-288.

[12]賈文祥.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

JIA W X.Medical microbiology[M].Beijing：People’s Medical Publishing House，2001.(in Chinese)

[13]BARTHEL M，HAPFELMEIER S，QUINTANILLA-MARTíNEZ L，et al.Pretreatment of mice with streptomycin provides aSalmonellaentericserovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host[J].InfectImmun，2003，71(5)：2839-2858.

[14]GREGORY S G，SEKHON M，SCHEIN J，et al.A physical map of the mouse genome[J].Nature，2002，418(6899)：743-750.

[15]GRASSL G A，F(xiàn)INLAY B B.Pathogenesis of entericSalmonellainfections[J].CurrOpinGastroenterol，2008，24(1)：22-26.

[16]SANTOS R L，ZHANG S，TSOLIS R M，et al.Animal models ofSalmonellainfection：enteritis versus typhoid fever[J].MicrobesInfect，2001，3(4)：1335-1344.

[17]CLARK M A，JEPSON M A，SIMMONS N L，et al.Preferential interaction ofSalmonellatyphimuriumwith mouse Peyer’s patch M cell[J].ResMicrobiol，1994，145(7)：543-552.

[18]CLARK M A，JEPSON M A，SIMMONS N L，et al.Preferential andSalmonellapathogenicity island 1 regulate M-cell invasion and epithelial destruction by thphimurium[J].InfectImmun，1998，66(2)：724-731.

[19]顏彬.腸炎沙門(mén)氏菌實(shí)驗(yàn)感染鴨病理學(xué)及免疫組化與免疫熒光抗原定位方法的建立和應(yīng)用研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

YAN B.Pathological development and application of antigens locazilition with immunoperoxidase and immunofluorescent assay in ducklings experimentally infected withSalmonellaenteritidis[D].Ya′an:Sichuan Agricultural University，2008.(in Chinese)

[20]汪敏.腸炎沙門(mén)氏菌實(shí)驗(yàn)性感染雛雞的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2009.

WANG M.Study on the experimentalS.enteritidisinfect in chickens[D].Chongqing：South-West University，2009.(in Chinese)

(編輯白永平)

Histopathology and Antigen Distribution in the Mice Infected withSalmonellaParatyphiC Separated from Swan

LUO Wei，RAN Dan-dan，CHEN Dong-ping，LIU Qun

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestMinzuUniversity，Chengdu610041，China)

To learn histopathology of the mice infected withSalmonellaParatyphiC，clarify antigen distribution in tissue of the mice，and lay the groundwork of pathogenic mechanism，mice were infected withSalmonellaParatyphiC by drench.After being infected，11 tissues of the mice were sampled，embedded in paraffin，and dyed by HE and immune enzymatic technique.Three to six hours post challenge，inflammatory reaction were observed in heart，liver，spleen，lung, kidney，intestinal tract and brain，and lasted until 14 d post challenge.Necrosis，fall-off and inflammatory injury occurred in ileum，thrombus were found in ventriculus dexter.Alveolar walls were thickened，and vascular congestion，edema and inflammatory cells infiltration were observed.Chronic fibrous pneumonia，alveobronchiolitis，acute glomerulonephritis，and denaturation，necrosis，inflammatory injury and typhoid nodule in several organs were observed.Three hours after being challenged，antigen was detected in the sampled organs except brain.Besides extremely high quantity of antigen in the intestinal tract (infection route)，the strongest positive signal were also detected in spleen，heart，lung and liver，which mainly existed in cytoplasm of the tissues.These results indicate thatSalmonellaParatyphiC separated from swan can infect mice，encroach many organs of mice，and lead to denaturation，necrosis and inflammatory injury in the organs to different extent in long time.

SalmonellaParatyphiC separated from swan；pathological change；antigen distribution

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.018

2016-03-09

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013JY0045)

羅薇(1960-)，女，教授，碩導(dǎo)，主要從事動(dòng)物傳染病診治研究

S852.612

A

0366-6964(2016)08-1667-09