周文平

基礎(chǔ)研究

小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A RNA干擾對(duì)PAI-1表達(dá)的影響

周文平

目的 觀察肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（MEF2A）RNA干擾對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)的影響及纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建MEF2A RNA干擾慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒（NC），并對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，然后把主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分為MEF2A RNAi組、慢病毒陰性對(duì)照組（NC組）和對(duì)照組，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)MEF2A及PAI-1表達(dá)的變化。結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染MEF2A RNA干擾組PAI-1濃度為（2.45±0.16）ng/ml，病毒轉(zhuǎn)染對(duì)照組（NC組）PAI-1濃度為（1.23±0.13）ng/ml，對(duì)照組 PAI-1濃度為（1.35±0.10）ng/ml，MEF2A RNA 干擾組與 NC 組、對(duì)照組相比，P<0.05；NC組與對(duì)照組相比，P＞0.05。MEF2A RNA干擾明顯降低MEF2A活性及其mRNA表達(dá)，顯著促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1的活性及其mRNA表達(dá)。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可明顯抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A的表達(dá)，并促進(jìn)血管細(xì)胞內(nèi)PAI-1的高表達(dá)。

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A； RNA干擾； 纖溶酶原激活物抑制劑-1

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（myocyte enhancer factor2A，MEF2A）是目前研究較多的與動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）相關(guān)的生物活性物質(zhì)。肌肉細(xì)胞中MEF2A轉(zhuǎn)錄因子可與多數(shù)肌肉特異性基因調(diào)控區(qū)富含A/T的序列相結(jié)合，調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄，在血管生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用[1]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種可以高效特異地阻斷特定基因的表達(dá)基因治療方法，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于體內(nèi)外基因功能的研究。本研究應(yīng)用體外合成 MEF2A短發(fā)夾 RNA（small hairpin RNA，shRNA）轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，高效特異性地抑制MEF2A的表達(dá)，觀察MEF2A RNA干擾對(duì)MEF2A表達(dá)及細(xì)胞因子PAI-1表達(dá)的影響，為預(yù)防AS的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 本實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞為小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（mouse aorta：normal aortic endothelial Cells），購自江蘇江陰齊氏生物科技有限公司。細(xì)胞的培養(yǎng)采用江蘇江陰齊氏生物科技有限公司專利產(chǎn)品小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒（Mouse Aorta PrimaCellTM：Normal Aortic Endothelial Cells Cat No.3-4197）來優(yōu)化目的細(xì)胞生長(zhǎng)條件，以降低雜細(xì)胞的污染，同時(shí)保證質(zhì)量的穩(wěn)定。

1.2 主要試劑 PBS液：KCl 0.2 g，NaCl 5.0 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·5H2O 1.55 g，加蒸餾水至1000 ml溶解，高壓蒸汽消毒30 min后4℃保存。

細(xì)胞凍存液配制：10%二甲基亞砜（DSMO），50%DMEM培養(yǎng)基（含15%胎牛血清），混合均勻并過濾后備用。

胰蛋白酶溶液：蒸餾水配制，濃度為0.25%，注射濾器過濾除菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)共分3組，對(duì)照組、慢病毒陰性對(duì)照組（negative control，NC組）及MEF2A RNAi組。觀察纖溶酶原激活劑抑制物-1（PAI-1）在正常小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞組和MEF2A RNAi組的表達(dá)。

1.4 上清液MEF2A及PAI-1活性的檢測(cè) 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照MEF2A及PAI-1 ELISA試劑盒說明書分別測(cè)定MEF2A及PAI-1活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料以±s表示，多樣本均數(shù)間的兩兩比較采用least significant difference（LSD）檢驗(yàn)和 Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAI-1在對(duì)照組、病毒陰性對(duì)照組（NC組）和MEF2A RNAi組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的表達(dá) 在對(duì)照組、NC組及MEF2A RNAi組的表達(dá)水平有顯著差異。MEF2A RNAi組與對(duì)照組及NC組均有顯著差異。NC組與對(duì)照組各指標(biāo)濃度水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表 1。

表1 PAI-1在小鼠上清液中的表達(dá)（±s）

表1 PAI-1在小鼠上清液中的表達(dá)（±s）

注：MEF2A：肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A；PAI-1：纖溶酶原激活物抑制劑-1。與對(duì)照組比較，aP<0.05；與NC組相比，bP<0.05

組別 例數(shù) PAI-1（ng/ml）對(duì)照組 8 1.35±0.10 NC 組 8 1.23±0.13aMEF2A RNAi 8 2.45±0.16ab

2.2 MEF 2A RNAi對(duì)纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）基因表達(dá)的影響 MEF 2A RNAi對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1活性及其mRNA表達(dá)的影響：對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC或MEF 2A RNAi慢病毒載體來觀察MEF 2A RNAi對(duì)PAI-1基因表達(dá)的影響，測(cè)定PAI-1活性及其mRNA的表達(dá)。NC組與對(duì)照組相比，PAI-1濃度及其mRNA表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MEF2A RNAi可明顯抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A表達(dá)并使PAI-1表達(dá)增高（濃度及mRNA表達(dá)）。見圖1。

圖1 PAI-1活性及其mRNA表達(dá)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是隨著人年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的動(dòng)脈非炎癥性病變，其規(guī)律通常是在青少年時(shí)期發(fā)生，至中老年時(shí)期加重、發(fā)病，是冠心病及其并發(fā)癥的潛在原因和病理生理學(xué)基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化不僅是一種脂質(zhì)性疾病，更是一種與炎癥有著錯(cuò)綜復(fù)雜聯(lián)系的炎癥性疾病。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程中起重要作用，涉及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段，并與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、進(jìn)展、破裂、血栓形成及血管成形術(shù)后再狹窄等一系列病理生理過程密切相關(guān)。因此，早期、正確、積極地診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥具有重要意義。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與血管壁內(nèi)皮下組織之間的單層細(xì)胞，它在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中所起的作用受到越來越多的重視。在各種病因啟動(dòng)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，平滑肌細(xì)胞增殖形成新生內(nèi)膜，由此導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，管腔狹窄。在正常內(nèi)皮修復(fù)功能作用下，內(nèi)皮細(xì)胞快速覆蓋受損內(nèi)膜能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。在動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程中血管壁的病理改變主要有以下三個(gè)方面：一是血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)功能性或器質(zhì)性改變，內(nèi)膜通透性增加；二是血液中的脂類物質(zhì)（如低密度脂蛋白）侵入受損的血管內(nèi)皮下被氧化修飾，炎癥細(xì)胞（主要是單核細(xì)胞）黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上，和中膜增殖的平滑肌細(xì)胞一起進(jìn)入內(nèi)膜下，吞噬已被氧化修飾的血液脂類物質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞；三是增殖的平滑肌細(xì)胞使血管壁增厚，啟動(dòng)血栓形成機(jī)制，遷移到內(nèi)皮下形成纖維帽。

纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）是纖溶系統(tǒng)的主要抑制因子，可抑制組織型纖溶酶原激活物和尿激酶型纖溶酶原激活物。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血漿中PAI-1產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PAI-1減少纖維蛋白降解，引起纖維蛋白聚集，使纖溶系統(tǒng)和抗纖溶系統(tǒng)處在動(dòng)態(tài)平衡中[2]。正常血管中PAI-1分布在內(nèi)膜和中膜中，PAI-1mRNA主要在平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)[3]。在動(dòng)脈粥樣硬化血管中PAI-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，PAI-1在壞死細(xì)胞核中和斑塊周圍增厚內(nèi)膜中的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)呈強(qiáng)陽性[4]。斑塊破裂時(shí)，活化的血小板通過釋放PAI-1而使纖溶系統(tǒng)功能削弱，形成凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)之間的失平衡，血栓形成促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程[5]。MEF2A屬于轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）家族中的一員。MEF2A轉(zhuǎn)錄因子的N端結(jié)構(gòu)具有MADS盒結(jié)構(gòu)。MADS盒結(jié)構(gòu)存在于多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子家族中，這樣的結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)之間形成二聚體，識(shí)別靶DNA并與之結(jié)合。MEF2A包含了由29個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域，用來識(shí)別靶DNA上的序列結(jié)構(gòu)（-CTA［APT］4TAGPA-）并與之結(jié)合，MEF2A蛋白與基因啟動(dòng)子中特定序列結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)表明，MEF2A蛋白與血管的完整性和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存有關(guān)[6]，有絲分裂原激活蛋白（MAPK）的蛋白激酶ERK5（extracellular-regulatedkinases-5）參與內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖的信號(hào)分子，MEF2-HDAe（histone deacetylase）信號(hào)在維持血管的完整性方面的作用[7]。因此，MEF2A在維護(hù)血管內(nèi)皮完整性方面發(fā)揮著重要的作用。RNA干擾是生物體生命進(jìn)程中普遍存在的一種現(xiàn)象，是指內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后，產(chǎn)生特異性序列的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，進(jìn)而抑制靶基因表達(dá)的現(xiàn)象。在此過程中，雙鏈RNA通過刺激目標(biāo)RNA降解而特異性地抑制特定目標(biāo)蛋白的表達(dá)。本研究設(shè)計(jì)針對(duì)MEF2A基因的shRNA慢病毒載體，用它轉(zhuǎn)染小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，采用RNA干擾的方法高效特異性地抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A的表達(dá)，然后觀察對(duì)MEF2A及相關(guān)炎癥基因mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MEF2A RNAi能有效地抑制MEF2A和PAI-1的表達(dá)。抑制炎癥因子是未來治療動(dòng)脈粥樣硬化的新途徑，基因治療是未來治療動(dòng)脈粥樣硬化的新方向。

PAI-1與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)，PAI-1在AS發(fā)病過程中發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)血管壁的炎癥反應(yīng)及AS的形成和發(fā)展，血液中高水平的PAI-1還可以對(duì)斑塊不穩(wěn)定、破裂及未來的心血管事件起到預(yù)測(cè)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)針對(duì)MEF2A基因的shRNA慢病毒載體，用它轉(zhuǎn)染人小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞，采用RNA干擾的方法高效特異性地抑制小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A的表達(dá)，然后觀察對(duì)MEF2A及PAI-1基因mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEF2A RNAi能有效地抑制MEF2A表達(dá)并促進(jìn)PAI-1的表達(dá)。NC組和對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)MEF2A及其mRNA表達(dá)有任何差別，說明NC慢病毒轉(zhuǎn)染不能降低MEF2A及mRNA表達(dá)，也說明MEF2A RNAi的有益作用并不是來源于慢病毒轉(zhuǎn)染所引起的非特異性免疫反應(yīng)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，MEF2A RNAi促進(jìn)了小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1的表達(dá)，這對(duì)明確MEF2A RNAi與PAI-1和AS形成的關(guān)系提供了有力證據(jù)。因此，慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾可以有效降低小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞MEF2A活性及mRNA表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)PAI-1活性及mRNA表達(dá)。慢病毒介導(dǎo)的MEF2A RNA干擾及對(duì)PAI-1表達(dá)的影響，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有明顯的促進(jìn)作用。

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Effect of myocyte enhancer factor 2A RNA interference on expression of PAI-1 in mouse aortic endothelial cells

ZHOU Wen-ping．Department of Cardiovascular Medicine，the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，zhengzhou 450052，China

Objective To observe the effect of MEF2A RNA interference on the expression of MEF2A in mouse aortic endothelial cells，and the effect on the expression of plasminogen activator inhibitor-1 （PAI-1）.Methods The MEF2A RNA interference lentivirus and the negative control of lentivirus（NC）were constructed，and transfected to the mouse aortic endothelial cells.Their silencing efficiency was determined.The changes of MEF 2A and PAI-1 expression levels were detected by ELISA and reverse transcription polymerase chain reaction.Results The concentration of PAI-1 in Lentivirus transfection MEF2A RNA interference group was （2.45±0.16）ng/ml，the concentration of PAI-1 in virus transfection control group（NC group）was（1.23±0.13）ng/ml，the concentration of PAI-1 in control group was（1.35±0.10）ng/ml，MEF2A RNA interference group compared with NC group and the control group，P<0.05，NC group compared with control group，P＞0.05，MEF 2A RNA interference can significantly reduce the MEF2A activity and its mRNA expression，and remarkably increase the activity and mRNA expression of PAI-1 in mouse aortic endothelial cells.Conclusion Lentivirus-mediated RNA interference of MEF 2A can significantly inhibit the expression of MEF 2A and enhance the expression of inflammatory gene PAI-1.

Myocyte enhancer factor 2A； RNA interference； PAI-1

450052 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．05．023

Q95-33；R543.1

A

1672-5301（2016）05-0473-04

2015-09-29）