吳娜 宋達(dá)琳 蔡尚郎

基礎(chǔ)研究

硝酸鹽后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響研究

吳娜 宋達(dá)琳 蔡尚郎

目的 探討硝酸鹽后處理（PPostC）對(duì)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中細(xì)胞凋亡的影響，以及特異性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）損傷相關(guān)蛋白Grp78（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78）和Caspase 12（半胱氨酸蛋白酶12）的蛋白表達(dá)水平的變化和意義。方法 Wistar大鼠24只隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組（缺血再灌注組）、PPostC組（硝酸鹽后處理組）三組，每組8只。分別測(cè)定各組大鼠心肌缺血和梗死面積、細(xì)胞凋亡指數(shù)及Caspase12、Grp78蛋白表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組未見(jiàn)梗死心肌和缺血心肌，PPostC組心肌缺血區(qū)面積和梗死區(qū)面積均明顯小于 I/R 組［（42.08±4.84）%比（53.31±3.87）%，（38.13±2.05）%比（52.19±3.44）%，P 均<0.01］。假手術(shù)組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于 I/R 組和 PPostC 組［（6.70±2.25）%比（26.92±1.91）%比（20.54±3.05）%，P均<0.01］。心肌組織Grp78蛋白水平假手術(shù)組亦明顯低于I/R組和PPostC組，且PPostC組高于I/R組［0.13±0.03比1.04±0.16比1.22±0.11，P均<0.01］；心肌組織Caspase12蛋白表達(dá)水平假手術(shù)組明顯低于I/R組和PPostC組，且PPostC組低于I/R組［0.11±0.01比0.41±0.06比0.33±0.04，P均<0.01］。結(jié)論 PPostC能減輕心肌細(xì)胞凋亡，而ERS激活參與了大鼠MIRI過(guò)程，推測(cè)PPostC在大鼠MIRI過(guò)程中可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERS途徑抑制細(xì)胞凋亡，改善MIRI。

缺血后處理； 心肌缺血再灌注損傷； 細(xì)胞凋亡； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

目前我國(guó)心肌梗死發(fā)病率及死亡率仍居高不下[1]。急性心肌梗死后再灌注治療能挽救梗死心肌，但某些情況下伴隨出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷（MIRI）也可加重心肌損傷，增加心肌細(xì)胞凋亡[2]。既往眾多研究證實(shí)，缺血后處理（包括藥物缺血后處理）能夠減輕MIRI，縮小梗死面積[3,4]，可通過(guò)多種途徑改善細(xì)胞凋亡[5,6]。但目前對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是否參與調(diào)節(jié)的研究較少，Grp78、Caspase-12是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中重要的特異性因子。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察硝酸鹽藥物后處理（PPostC）對(duì)MIRI中細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Grp78）和半胱氨酸蛋白酶12（Caspase 12）的蛋白表達(dá)水平變化，以期探討硝酸鹽藥物后處理對(duì)MIRI過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備及分組

1.1.1 動(dòng)物模型制備 大鼠麻醉后連接記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖1 min，采用改良Pferfer MA推管法制備大鼠缺血再灌注模型。

1.1.2 動(dòng)物模型分組 選取Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為3組，每組8只。①Sham組（假手術(shù)組）：LAD（左前降支冠狀動(dòng)脈）下穿線、套管，不結(jié)扎，曠置220 min。②I/R組（缺血再灌注組）：結(jié)扎LAD 40 min后完全開(kāi)放LAD，實(shí)施再灌注180 min。③PPostC組（硝酸鹽藥物后處理組）：結(jié)扎LAD 40 min后再灌注缺血開(kāi)始前，將異舒吉按5 mg/kg經(jīng)頸靜脈注入5 min，結(jié)扎LAD 40 min，在再灌注開(kāi)始前，LAD實(shí)施再灌注180 min，同時(shí)異舒吉按5 mg/kg泵入持續(xù)20 min。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 心肌梗死面積測(cè)定 應(yīng)用Evan′s blue和TTC雙染法測(cè)定。正常心肌組織染色呈現(xiàn)藍(lán)色，缺血區(qū)呈現(xiàn)磚紅色，梗死區(qū)顯示白色。心臟橫切面拍照后，使用Image-Pro I^lus 6.0圖像分析軟件測(cè)定各區(qū)域面積，求和計(jì)算出所需總面積。其中藍(lán)紅白面積和為左心室面積；紅白面積和為缺血區(qū)面積；白色區(qū)面積即梗死面積。缺血區(qū)面積百分比（%）=（缺血區(qū)總面積/左心室區(qū)面積）×100%，心肌梗死面積百分比（%）=（梗死區(qū)面積/缺血區(qū)總面積）×100%。

1.2.2 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 按常規(guī)病理組織學(xué)方法制備心肌石蠟標(biāo)本，采用TUNEL法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細(xì)胞。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取10個(gè)高倍視野，計(jì)算出平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)（%）表示凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.2.3 心肌組織Caspase12、Grp78蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫印跡法（Western Blotting）測(cè)定。I/R組和IPostC組取梗死區(qū)心肌組織，假手術(shù)組取對(duì)應(yīng)心肌組織，從心肌提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、DAB或ECL顯色等步驟，檢測(cè)Grp78、Caspase12的蛋白表達(dá)。應(yīng)用圖像分析儀測(cè)定各條帶的吸光度值（A值），以RACK1（A值）/β-Actin（A值）的結(jié)果作為RACK1蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 假手術(shù)組測(cè)定結(jié)果 肉眼觀察心肌組織呈現(xiàn)藍(lán)色，未見(jiàn)白色梗死心肌和磚紅色缺血心肌；細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于I/R組和PPostC組［（6.70±2.25）%比（26.92±1.91）%比（19.49±2.41）%］，P 均<0.01，t=19.39、10.98。

2.2 手術(shù)各組心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)果比較 I/R組和PPostC組心肌缺血面積分別為（53.31±3.87）%和（42.08±4.84）%，心肌梗死面積分別為（52.19±3.44）%和（38.13±2.05）%。與 I/R 組相比，PPostC組心肌缺血面積和梗死面積均明顯減少，P 均<0.05，t=5.13，9.93。I/R 組和 PPostC 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為（26.92±1.91）%和（19.49±2.41）%。與I/R組相比，PPostC組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少，P<0.01，t=6.84。見(jiàn)表1。

2.3 各組蛋白表達(dá)結(jié)果 Grp78蛋白表達(dá)水平在假手術(shù)組心臟相應(yīng)區(qū)域心肌與I/R組和PPostC組梗死灶區(qū)心肌分別為（0.13±0.03，1.04±0.16，1.22±0.11），與假手術(shù)組相比，I/R組和 PPostC組的Grp78蛋白表達(dá)明顯升高，P均<0.01，t=-16.25，-27.31；與I/R組相比，PPostC組的Grp78蛋白表達(dá)水平增加，P<0.01，t=-2.66。Caspase12蛋白表達(dá)水平在假手術(shù)組心臟相應(yīng)區(qū)域心肌與I/R組和PPostC組梗死灶區(qū)心肌分別為（0.11±0.03，0.46±0.71，0.40±0.06）。I/R組和 PPostC 組的 Caspase12 蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組相比明顯增加，P均<0.01，t=-14.16，-12.98；與I/R組相比，PPostC組的Caspase12蛋白表達(dá)水平降低，P<0.01，t=3.19。見(jiàn)表2、圖1。

表1 I/R組和PPostC組心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表1 I/R組和PPostC組心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

注：I/R：缺血再灌注，PPostC：硝酸鹽后處理。與I/R組相比，aP<0.01

凋亡指數(shù)（%）I/R 組 8 53.31±3.87 52.19±3.44 26.92±1.91 PPostC 組 8 42.08±4.84a38.13±2.05a19.49±2.41a組別 例數(shù) 缺血區(qū)面積（%）梗死區(qū)面積（%）

表2 各組心肌組織Grp78蛋白和Caspase12蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 各組心肌組織Grp78蛋白和Caspase12蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：I/R：缺血再灌注，PPostC：硝酸鹽藥物后處理。與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與I/R組比較，bP<0.01

組別 例數(shù) Grp78蛋白 Caspase12蛋白假手術(shù)組 8 0.13±0.03 0.11±0.01 I/R 組 8 1.04±0.16a0.41±0.06aPPostC 組 8 1.22±0.11ab0.33±0.04ab

圖1 免疫印跡檢測(cè)Grp78蛋白和Caspase12蛋白表達(dá)

3 討論

2003年Zhao等[3]在犬在體缺血再灌模型中首次發(fā)現(xiàn)缺血后處理能縮小心肌梗死面積。Chiari等[7]在兔在體缺血/再灌模型中證實(shí)給予異氟烷藥物后處理能產(chǎn)生和缺血后處理同樣的心肌保護(hù)作用。2005年，法國(guó)學(xué)者Staat等[6]率先在臨床上證實(shí)了缺血后處理的心肌保護(hù)作用。此后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，在再灌注時(shí)給予腺苷、麻醉藥、曲美他嗪、左西孟旦等均可以通過(guò)不同機(jī)制改善MIRI[8]。本研究結(jié)果同樣顯示PPostC組的缺血區(qū)面積和梗死區(qū)面積均明顯小于I/R組（P均<0.01），證實(shí)了PPostC能改善MIRI。并且PPostC組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)低于I/R組（P均<0.05），顯示PPostC能減輕MIRI過(guò)程中的心肌細(xì)胞凋亡。

Kunapuli等[9]的研究顯示，缺血后處理可在減輕心肌酶釋放的同時(shí)，通過(guò)死亡受體途徑和線粒體途徑激活有效減輕心肌細(xì)胞凋亡。與其不同，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是通過(guò)激活下游凋亡因子引發(fā)細(xì)胞凋亡。既往研究顯示，在心肌缺血再灌注時(shí)存在ERS激活現(xiàn)象[10]。Grp78是ERS反應(yīng)的一種特異性細(xì)胞保護(hù)性蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺氧、低血鈣等應(yīng)激時(shí)，Grp78蛋白表達(dá)明顯增加，可以修復(fù)蛋白的組成以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞[11]。Grall等[12]的研究結(jié)果顯示，在大鼠缺血再灌注損傷模型中，缺血后處理組Grp78和ATF-6蛋白的表達(dá)增加，通過(guò)增強(qiáng)ERS減輕MIRI。Caspase-12在介導(dǎo)ERS凋亡途徑過(guò)程中作為一種促細(xì)胞凋亡性蛋白酶具有特異性作用[13]。被激活的Caspase-12可以轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中直接或間接激活效應(yīng)Caspase-3引起細(xì)胞凋亡[14]。Liu等[15]對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧后處理能夠通過(guò)減少鈣調(diào)蛋白和Caspase 12活性抑制ERS，保護(hù)缺血再灌注損傷心肌。本研究結(jié)果顯示，I/R組和PPostC組心肌組織Caspase-12蛋白表達(dá)和Grp78蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERS激活參與了大鼠MIRI過(guò)程。同時(shí)結(jié)果顯示，PPostC組Caspase-12蛋白表達(dá)低于I/R組（P<0.05），而Grp78蛋白表達(dá)水平IPostC組明顯高于I/R組（P<0.05）。從而推測(cè)，缺血后處理可能通過(guò)下調(diào)Caspase-12蛋白表達(dá)減少ERS反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)上調(diào)Grp78蛋白表達(dá)，修復(fù)蛋白以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，從而減少ERS反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕MIRI。

MIRI是多因子多通路共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)ERS激活參與了大鼠MIRI過(guò)程，并且通過(guò)結(jié)果推測(cè)缺血后處理在大鼠MIRI過(guò)程中可能通過(guò)減少心肌組織促細(xì)胞凋亡性蛋白酶Caspase-12表達(dá)和增加細(xì)胞保護(hù)性蛋白Grp78表達(dá)，從而調(diào)節(jié)ERS途徑抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血再灌注心肌。但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)闡明。

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Effect of nitrates postconditioning on the endoplasmic reticulum stress during the period of myocardial ischemia-reperfusion injury

WU Na＊，SONG Da-lin，CAI Shang-lang．＊Cardiac Medicine Department，the Affiliated Hospital of Qingdao U-niversity，Qingdao 266001，China

Objective To investigate the effects and mechanisms of nitrates ischemic postconditioning（PPostC）on the myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI）model of rat，and investigate whether the endoplasmic reticulum stress（ERS）can influence MIRI.Methods Wistar rats were randomized into three groups（n=8）：sham operation group（sham group），ischemia-reperfusion group（I/R group），nitrates ischemia postconditioning group（PPostC group）.Relative markers which include Ischemic size and infarct size of myocardium，cardiomyocyte apoptosis，Caspase12 and Grp78 protein expression were measured respectively in every group.Results There were no infarct and ischemic myocardium in sham group.Compared with I/R group，PPostC significantly decreased the myocardial ischemic area，myocardial infarct size，and cardiomyocyte apoptosis（P<0.01）.Compared with sham group，the Caspase12 and Grp78 protein expressions in I/R and PPostC groups significantly increased（P<0.05）.Compared with I/R group，the Caspase12 protein expression in PPostC group significantly decreased（P<0.01），while Grp78 protein expression in PPostC group significantly increased （P<0.01）.Conclusion PPostC can reduce the myocardial ischemia-reperfusion injury via decreasing the myocardial ischemic and infarct size，and cardiomyocyte apoptosis.Nitrates ischemic postconditioning can decrease cardiomyocyte apoptosis via low-er the regulation ERS.

Ischemic postconditioning； Myocardial ischemia-reperfusionon injury； Apoptosis； Endoplasmic reticulum stress

CAI Shang-lang，E-mail：caishl@126．com

中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)探索心血管研究基金（項(xiàng)目編號(hào)：DFCMDA201303）

266001 山東省青島市，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院心內(nèi)科（吳娜），老年內(nèi)科（宋達(dá)琳）；青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（蔡尚郎）

蔡尚郎，E-mail：caishl@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．05．022

Q95-33；R542

A

1672-5301（2016）05-0470-04

2016-02-17）