季蘇瓊，李悅，王瓊，孟麗娟，卜碧濤

?

·論著·

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的臨床表現(xiàn)與基因表型的關(guān)聯(lián)

季蘇瓊，李悅，王瓊，孟麗娟，卜碧濤

目的：分析杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）患者的基因突變特點(diǎn)，探討疾病的臨床表現(xiàn)與基因型的關(guān)聯(lián)。方法：回顧性分析52例DMD患者的臨床表現(xiàn)和基因特點(diǎn)。結(jié)果：患者多表現(xiàn)為肢體無力、走路姿勢(shì)異常，發(fā)育遲緩，部分患者伴智力下降，心臟功能減退等。多重鏈接探針依賴擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因檢測(cè)無異常4例（7.69%），DMD基因缺失40例（76.9%），重復(fù)8例（15.3%）?；蛲蛔儼l(fā)生在外顯子45～55 22例（40.74%），2～19區(qū)域10例（19.23%）。48例基因異?；颊咧?，符合閱讀框架原則42例（87.5%）。結(jié)論：基因缺失的大小與臨床癥狀的關(guān)系不大，病情嚴(yán)重程度關(guān)鍵取決于突變是否會(huì)破壞閱讀框結(jié)構(gòu)?；蛲蛔?cè)浇咏?'端對(duì)智力的影響越輕，越接近3'端對(duì)智力的影響越重。

進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良；杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因；多重鏈接探針依賴擴(kuò)增技術(shù)；基因缺失；基因重復(fù)

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種由編碼抗肌萎縮蛋白（dystrophy）基因突變所致的X-連鎖隱性遺傳性肌病，一般為男孩發(fā)病。全世界活產(chǎn)男性新生嬰兒中的發(fā)病率約為1/3 600[1]，患者出生時(shí)多無癥狀，多在3～5歲發(fā)病，起病隱匿[2]。該病進(jìn)展迅速，患者多在10歲需要使用輪椅生活，多于20～30歲死于心臟和呼吸衰竭[1]。

DMD基因位點(diǎn)位于X染色體p21.2，是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的人類基因，具有極高的突變頻率，主要表達(dá)在骨骼肌和心肌。主要分為三種突變類型：缺失突變、重復(fù)突變、微小突變[3]，這些突變改變了基因的閱讀框架，影響抗肌萎縮蛋白的合成[4]?？辜∥s蛋白是一個(gè)細(xì)胞骨架蛋白，主要位于骨骼肌和心肌的細(xì)胞漿面，少量表達(dá)于腦組織，在心肌和骨骼肌上，抗肌萎縮蛋白與肌膜上的不同蛋白結(jié)合形成抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合體（dystrophin-glycoprotein complex，DGC），其對(duì)于保護(hù)肌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整和維持肌細(xì)胞正常收縮功能有重要作用。當(dāng)患者因DMD基因缺陷時(shí)，DGC功能喪失，導(dǎo)致肌細(xì)胞壞死和功能缺失以及肌肉組織纖維化[5]。

DMD暫缺乏有效的治療措施，因此對(duì)DMD基因突變的檢測(cè)是控制和降低DMD發(fā)病率的關(guān)鍵。本研究回顧性分析52例DMD患者的臨床特點(diǎn)，均采用多重鏈接探針依賴擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)檢測(cè)DMD基因的缺失和重復(fù)突變，探討疾病的臨床表現(xiàn)與基因型的關(guān)聯(lián)。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2010～2015年于我院基因和臨床診斷為DMD的患者52例，均為男性；確診年齡2～19歲，平均（8.2±4.90）歲；起病年齡1～18歲，平均（5.4±4.54）歲；均無血緣關(guān)系，父母非近親結(jié)婚；有陽(yáng)性家族史2例，符合X連鎖隱性遺傳，均表現(xiàn)為哥哥有類似癥狀。

1.2方法

所有患者均采用對(duì)癥支持治療，少數(shù)患者使用糖皮質(zhì)激素治療。收集所有患者的病歷資料，采用MLPA技術(shù)對(duì)DMD基因79個(gè)外顯子缺失/重復(fù)突變進(jìn)行篩查。

2　結(jié)果

2.1病歷資料

52例患者均為慢性隱匿起??；發(fā)病癥狀為肢體無力、走路姿勢(shì)異常42例，意外發(fā)現(xiàn)肌酸激酶（creatine kinase，CK）顯著升高8例，出生后運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后就診2例；肌力5級(jí)16例，4級(jí)20例，3級(jí)14例，2級(jí)2例；Gower's癥陽(yáng)性40例，多表現(xiàn)為四肢近端為主的肌力減退，隨著病情進(jìn)展，大部分患者四肢近端肌群伴有不同程度萎縮（伴肌肉萎縮6例），大部分可見腓腸肌假性肥大（僅3例無肥大），伴肌痛或肌肉壓痛3例；伴輕度智能減退8例，伴心慌、心悸9例；CK最高27 167U/L，平均（12 097.3±8 112.19）U/L；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH） 最高 1 835U/L，平均（990.2±469.94）U/L；行肌紅蛋白檢測(cè)3例，均大于1 200 μg/L；心電圖檢查16例，異常7例（43.75%），其中竇性心動(dòng)過速2例，竇性心律不齊4例，不完全性右束支傳導(dǎo)阻滯1例；超聲心動(dòng)圖檢查15例，異常5例，提示左心室增大5例，室間隔與左心室壁增厚3例，右心室肥厚2例。

2.2基因檢測(cè)結(jié)果

52例患者中，基因檢測(cè)未見異常4例（7.69%），DMD基因缺失40例（76.9%），重復(fù)8例（15.3%）?；蛲蛔儼l(fā)生在外顯子45～55 22例（40.74%），2～19區(qū)域10例（19.23%）。26例患者父母進(jìn)行檢測(cè)，所有患者父親基因均未見異常，患者母親基因存在異常16例。48例基因異?；颊咧?，符合閱讀框架原則42例（87.5%）。8例伴智力下降患者的基因型：46～50外顯子重復(fù)，51～60外顯子區(qū)域重復(fù)，59～60外顯子缺失，45～57外顯子重復(fù)，45～48外顯子缺失，46～50外顯子缺失，51～54外顯子缺失，48～50缺失（圖1）。7例伴心慌胸悶癥狀/伴心電圖異常/心臟彩超異?；颊叩幕蛐停?～11號(hào)外顯子缺失，3號(hào)外顯子缺失，4號(hào)外顯子缺失，3～12外顯子缺失，2號(hào)外顯子缺失，45～47外顯子缺失，45～48外顯子缺失（圖2）。

圖1　伴智力障礙患者的基因異常位點(diǎn)分布

圖2　伴心臟損害患者的基因異常位點(diǎn)分布

3　討論

本研究中患者均采用MLPA，該技術(shù)使用一對(duì)通用引物對(duì)DMD基因79個(gè)外顯子缺失/重復(fù)突變進(jìn)行篩查，能檢測(cè)外顯子大片段缺失/重復(fù)突變，同時(shí)也可檢測(cè)雜合缺失/重復(fù)突變。本研究MLPA檢測(cè)結(jié)果示缺失40例（76.9%），重復(fù)8例（15.3%），未見異常4例（7.69%），與文獻(xiàn)報(bào)道（缺失65%，重復(fù)6%～10%）[6]大致相符。所有的突變和缺失可發(fā)生在基因的任何位置，但是有兩個(gè)缺失的熱點(diǎn)區(qū)域：一個(gè)位于基因的中央?yún)^(qū)，外顯子45～55，另一個(gè)位于5'端，包括外顯子2～19。本研究中32例患者缺失位于這兩個(gè)區(qū)域，其中位于外顯子45～55之間22例，位于外顯子2～19區(qū)域10例，與文獻(xiàn)相符[7]。

本研究中，一例患者有44號(hào)外顯子的一個(gè)位點(diǎn)的缺失，但臨床癥狀重，雙下肢肌力2～3級(jí)，腓腸肌肥大。另一患者表現(xiàn)為9～29號(hào)外顯子多個(gè)位點(diǎn)缺失，臨床癥狀輕，雙下肢肌力4級(jí)，腓腸肌輕度肥大?；颊叩呐R床癥狀輕重不一，患者的臨床癥狀與基因缺失的大小似乎并不平行。文獻(xiàn)提到，外顯子44缺失的患者，可表現(xiàn)為典型的DMD癥狀，而一些將近50%的基因缺失患者，臨床卻表現(xiàn)為貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Becker muscular dystrophy，BMD）[7]。有研究提到，患者的外顯子32～44、48～51、48～53缺失，但可表現(xiàn)為正常或接近正常的肌酶[8]?？赡芑颊呋蛉笔У拇笮∨c臨床癥狀的關(guān)系不大，病情嚴(yán)重程度關(guān)鍵取決于突變是否會(huì)破壞閱讀框結(jié)構(gòu)[7]。Monaco等[9]提出“閱讀框規(guī)則”，認(rèn)為保留閱讀框的突變通常可產(chǎn)生有部分功能的抗肌萎縮蛋白。如果破壞了閱讀框規(guī)則，框外突變可提前終止密碼，產(chǎn)生極不穩(wěn)定的mRNA后通常被迅速降解，抗肌萎縮蛋白明顯減少或缺失，在細(xì)胞中迅速降解不能發(fā)揮功能。所以影響基因開放閱讀框的突變會(huì)導(dǎo)致發(fā)病早、癥狀較重的DMD；若為框內(nèi)缺失，相連接的外顯子仍能維持mRNA的閱讀框架，產(chǎn)生有部分功能的抗肌萎縮蛋白，可表現(xiàn)為臨床癥狀較輕的BMD[10]。

本研究中有8例患者表現(xiàn)為智力下降，所有患者的缺失位點(diǎn)均靠近3’端。很多研究中發(fā)現(xiàn)患者的智力與基因突變位置及蛋白各亞型存在密切聯(lián)系。DMD的基因由79個(gè)外顯子和78個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，含有7個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子啟動(dòng)形成不同的蛋白亞型（圖3）[11]。位于5’端的基因（1～31）啟動(dòng)形成3個(gè)最長(zhǎng)的亞型Dp427M、Dp427C、Dp427P，這些都可表達(dá)于骨骼肌和心肌細(xì)胞、皮質(zhì)的神經(jīng)元、小腦浦肯野細(xì)胞。分別以DMD基因第30、45、56和63號(hào)外顯子作為第一個(gè)外顯子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物分別為260 kU（Dp260）、140 kU （Dp140）、116 kU（Dp116）和71 kuU（Dp71）[12]。Dp260在視網(wǎng)膜中高表達(dá)，Dp140主要表達(dá)于腦、腎組織，Dp116在雪旺細(xì)胞中表達(dá)，Dp71在包括腦、視網(wǎng)膜、腎、肝、肺等多種組織器官中表達(dá)[7]。在Bresolin研究中發(fā)現(xiàn)，DP140表達(dá)異常的患者的智力比其他亞型的患者的智力損害更為明顯[13]，而DP140是由第45號(hào)外顯子作為第一個(gè)外顯子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。另有研究認(rèn)為3’端（63號(hào)外顯子）的變異對(duì)于智力的影響更為嚴(yán)重，而這個(gè)位置是轉(zhuǎn)錄DP71的?；颊哂幸陨衔稽c(diǎn)的突變時(shí)，影響了任何可表達(dá)于顱內(nèi)的亞型的存在，都可表現(xiàn)出神經(jīng)發(fā)育遲滯[2]。DMD基因第45號(hào)外顯子后尤其是第63號(hào)外顯子后基因缺陷易導(dǎo)致智力障礙，基因突變?cè)浇咏?’端對(duì)智力的影響越輕，越接近3’端對(duì)智力的影響越重[12]。

文獻(xiàn)中提到DMD患者的心電圖異常主要為心律不齊，心房異位搏動(dòng)、室性早搏[14]，心臟彩超異常表現(xiàn)為左心房和左心室擴(kuò)大、瓣膜相對(duì)關(guān)閉不全、射血分?jǐn)?shù)降低等[15]，本研究中患者的異常與文獻(xiàn)相符。Jefferies 等[16]觀察69例DMD患者，發(fā)現(xiàn)第12和14～17號(hào)外顯子與患者心肌損害具有相關(guān)性，認(rèn)為基因越接近5'端，心臟損害程度越嚴(yán)重。Arbustini等[17]報(bào)道，在201例心臟損害的DMD患者中，6.5%患者的DMD基因異常位點(diǎn)位于外顯子45～55之內(nèi)。目前心臟損害的演變規(guī)律及其與基因型的關(guān)系尚未闡明，有待進(jìn)一步的研究。

本研究確診的DMD患者中，符合閱讀框架原則42例（87.5%）。如前文中提到，影響基因開放閱讀框的突變會(huì)導(dǎo)致發(fā)病早、癥狀較重的DMD；若為框內(nèi)缺失，不影響閱讀框架，相連接的外顯子可產(chǎn)生有部分功能的抗肌萎縮蛋白，臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，表現(xiàn)為BMD。在本研究中，少數(shù)患者雖然基因缺失并沒有改變基因的閱讀框架，但仍表現(xiàn)為臨床癥狀相對(duì)較重的DMD，因此其可能的機(jī)制為：在內(nèi)含子中部分序列的改變激活潛在的剪接增強(qiáng)子，雖不影響蛋白的分離，但改變mRNA的剪接方式，導(dǎo)致表型與基因型不符[7]。

DMD患者缺乏特異性的治療方法，本研究中的病例多給予對(duì)癥支持治療，少數(shù)患者使用糖皮質(zhì)激素治療，但是療效一般，在現(xiàn)階段的基因治療研究方向包括：干細(xì)胞移植、病毒載體及非病毒載體實(shí)現(xiàn)，外顯子跳躍，終止密碼子通讀[18]等。DMD的基因龐大，需要對(duì)于DMD基因有更多更詳細(xì)的了解，為DMD的診斷和基因治療提供方向。

圖3　[11]DMD基因的基因結(jié)構(gòu)

[1]Falzarano MS,Scotton C,Passarelli C,et al.Duchenne Muscular Dystrophy:From Diagnosis to Therapy[J].Molecules,2015,20:18168-18184.

[2]Hoffman EP,Brown RH Jr,Kunkel LM.Dystrophin:the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus[J].Cell,1987;51:919-928.

[3]Ferlini A,Neri M,Gualandi F.The medical genetics of dystrophinopathies:molecular genetic diagnosis and its impact on clinical practice[J].Neuromuscul Disord,2013,23:4-14.

[4]Findlay AR,Wein N,Kaminoh Y,et al.Clinical phenotypes as predic-77: 668-674.

[5] Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study[J].Lancet, 2011, 378: 595-605.

[6] Muntoni F, Melis MA, Ganau A, et al. Transcription of the dystrophin gene in normal tissues and in skeletal muscle of a family with X-linked dilated cardiomyopathy [J]. Am J Hum Genet, 1995, 56: 151-157.

[7] Muntoni F, Torelli S, Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes [J]. Lancet Neurol, 2003, 2: 731-740.

[8] Melis MA, Cau M, Muntoni F, et al. Elevation of serum creatine kinase as the only manifestation of an intragenic deletion of the dystrophin gene in three unrelated families[J]. Eur J Paediatr Neurol, 1998, 2: 255-261.

[9] Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S, et al. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus[J]. Genomics, 1988, 2: 90-95.

[10] Yokota T, Duddy W, Echigoya Y, et al. Exon skipping for nonsense mutations in Duchenne muscular dystrophy: too many mutations, too few patients?[J]. Expert Opin Biol Ther, 2012, 12: 1141-1152.

[11] Ricotti V, Mandy WP, Scoto M, et al. Neurodevelopmental, emotional,and behavioural problems in Duchenne muscular dystrophy in relation to underlying dystrophin gene mutations [J]. Dev Med Child Neurol, 2015, doi:10.1111/dmcn.12922.

[12] 王麗波,麻宏偉, 王琳, 等. Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒的智力特點(diǎn)及與基因突變關(guān)系初步探討[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2011, 13: 804-807.

[13] Felisari G, Boneschi F M, Bardoni A, et al. Loss of Dp140 dystrophin isoform and intellectual impairment in Duchenne dystrophy [J]. Neurology,2000, 55: 559-564.

[14] Nakamura A. X-Linked Dilated Cardiomyopathy: A Cardiospecific Phenotype of Dystrophinopathy [J]. Pharmaceuticals (Basel), 2015, 8:303-320.

[15] Jefferies JL, Eidem BW, Belmont JW, et al. Genetic predictors and remodeling of dilated cardiomyopathy in muscular dystrophy [J]. Circulation,2005, 112: 2799-2804.

[16] 張瑤, 張成,湯穎, 等. Duchenne 型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥心臟損害與基因型相關(guān)分析[J].中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志, 2015, 6: 453-457.

[17] Arbustini E, Diegoli M, Morbini P, et al. Prevalence and characteristics of dystrophin defects in adult male patients with dilated cardiomyopathy[J].J Am Coll Cardiol, 2000, 35: 1760-1768.

[18] 劉延波,徐乃軍, 賈飛勇. Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)發(fā)病機(jī)制及治療研究進(jìn)展[J].生命科學(xué), 2012, 24: 354-361.

（本文編輯：王晶）

The Association between Clinical Manifestations of Duchenne Muscular Dystrophy and Gene Expression

JI Su-qiong,LI Yue,WANG Qiong,BU Bi-tao.Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective:To analyze gene mutations in the dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy(DMD) patients and the correlation between the genotypes and clinical presentation.Methods:The clinical phenotuypes and gene mutations of 52 DMD patients were retrospective analysed.Results:The main clinical features of the patients were the proximal muscle weakness and atrophy,unusual walking posture,and stunted growth.In addition, some patients were accompanied with mental decline and heart function impairment.Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA)was used to detect the gene mutations.The exons deletion was detected in 40 cases (76.9%),the exons dupulition in 8 cases(15.3%),no mutations in 4 cases(7.69%).There were 22 cases(40.74%) gene mutation in exons 45 to 55,and 10 cases(19.23%)gene mutation in exons 2～19.In the 48 patients with detected mutatins,there were 42 patients(87.5%)were conformed to the principle of reading frame.Conclusion: The serious clinical symptoms do not depend on the size of the gene mutations,but on whether mutations destroy the reading frame structure.Gene mutations closer to the 5'end of the gene have lighter influence in intelligence, and those closer to the 3'end of the gene have much heavier impact on intelligence.

Duchenne muscular dystrophy;Duchenne muscular dystrophy gene;multiplex ligation-dependent probe amplification;gene deletion;gene duplication

·論著·

R741;R746.2

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.009

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430030

2015-06-13

卜碧濤

bubitao@tjh.tjmu. edu.cn