管峰，金嘉長(zhǎng)，趙華國(guó)，洪磊，沈志森，竺亞斌

1 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 3152112 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315041

組織工程與細(xì)胞培養(yǎng)

海豚鏈球菌誘變發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸及其在動(dòng)物皮膚修復(fù)中的應(yīng)用

管峰1，金嘉長(zhǎng)1，趙華國(guó)1，洪磊1，沈志森2，竺亞斌1

1 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211
2 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315041

管峰， 金嘉長(zhǎng)， 趙華國(guó)， 等. 海豚鏈球菌誘變發(fā)酵法制備透明質(zhì)酸及其在動(dòng)物皮膚修復(fù)中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào)，2016， 32（8）: 1104-1114.

Guan F， Jin JC， Zhao HG， et al. Hyaluronic acid production by Streptococcus iniae and its application in rabbit skin's regeneration. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1104-1114.

透明質(zhì)酸 （HA） 是一種非常重要的生物材料，是體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞外基質(zhì)成分之一。為了獲得產(chǎn)量、分子量及純度較高的透明質(zhì)酸，并研究透明質(zhì)酸水凝膠在動(dòng)物皮膚修復(fù)中的潛在作用。通過(guò)紫外誘變的方法對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行誘變，并對(duì)此突變菌發(fā)酵后產(chǎn)物的蛋白含量及HA分子量進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)CTAB法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提純，運(yùn)用物理凍融法將透明質(zhì)酸制成水凝膠后，用于兔背部全層皮膚修復(fù)的初探。結(jié)果表明通過(guò)誘變海豚鏈球菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力從 （82.3±3.3） mg/L增加到 （120±10.6） mg/L，增加了46.4%；產(chǎn)物經(jīng)純化后蛋白含量從 （0.178±0.011） mg/L減少到 （0.032±0.017） mg/L，減少了82.02%；所制得透明質(zhì)酸的分子量約為3.0×105Da；透明質(zhì)酸水凝膠對(duì)兔全層皮膚缺損的修復(fù)有較明顯的促進(jìn)作用，能減輕炎癥和傷口瘢痕的形成。

海豚鏈球菌，發(fā)酵，透明質(zhì)酸，皮膚修復(fù)

透明質(zhì)酸 （Hyaluronic acid，HA） 是一種非常重要的直鏈聚陰離子粘多糖，由 （1→4）-β-D-葡萄糖醛酸及 （1→3）-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復(fù)單位組成［1］，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示［2］。1934年由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)眼科教授Meyer和Palmer在牛眼晶狀體中發(fā)現(xiàn)［3］。HA在體內(nèi)分布廣泛，在關(guān)節(jié)滑液、皮膚、臍帶、腦、軟骨等組織中均有分布，是大多數(shù)結(jié)締組織中主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分。HA除了具有生物可吸收性、生物相容性、黏稠性、保水性和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等重要特性，更重要的是其無(wú)抗原性、無(wú)過(guò)敏性、通常不發(fā)生免疫反應(yīng)，因此，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。而隨著對(duì) HA功能越來(lái)越深入的研究，其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用也越來(lái)越受到關(guān)注，如在外科手術(shù)防黏劑、藥物遞送系統(tǒng)、癌癥治療、眼科、整容外科等領(lǐng)域已開(kāi)始得到研究和開(kāi)發(fā)［4-11］。

圖1　透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)式[2]Fig. 1 The structure scheme of hyaluronic acid［2］.

透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法有動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法，前者由于效率低、成本高、原料來(lái)源有限及來(lái)源組織的安全性等問(wèn)題，已逐漸被微生物發(fā)酵法所取代。微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA 于1983年被首次報(bào)道后［12］，由于其克服了動(dòng)物組織提取法所存在的缺點(diǎn)而得到廣泛的關(guān)注和研究，目前發(fā)酵法已成為規(guī)?；a(chǎn)HA的主要方法，文獻(xiàn)所報(bào)道的發(fā)酵法中所采用的菌株主要為獸疫鏈球菌和馬疫鏈球菌，缺乳鏈球菌、糞馬鏈球菌及雞霍亂桿菌等也有少量報(bào)道［13-15］。

海豚鏈球菌 （Streptococcus iniae， Strep.） 最初是從一例皮膚潰瘍的亞馬遜淡水河豚中分離得到的。它屬兼性厭氧菌，大多呈β溶血活性，最佳生長(zhǎng)溫度為 37 ℃，10-45 ℃可生長(zhǎng)［16］。據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道，大多數(shù)鏈球菌在培養(yǎng)初期可見(jiàn)到微莢膜，內(nèi)含有透明質(zhì)酸，因?yàn)槲⑶v膜對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)具有抗吞噬的作用，有利于細(xì)菌侵襲宿主。因此，本文對(duì)從海豚鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中透明質(zhì)酸的提取進(jìn)行了研究，這在現(xiàn)有的文獻(xiàn)上還未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。另外，為了提高HA的產(chǎn)量，對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行了紫外誘變及最佳培養(yǎng)基的篩選，在此基礎(chǔ)上，對(duì)由 HA做成的凝膠進(jìn)行了動(dòng)物全層皮膚缺損的修復(fù)初探。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用海豚鏈球菌 （Streptococcus iniae，Strep.） 由寧波大學(xué)海洋學(xué)院提供，從美國(guó)羅非魚(yú)中分離得到，并進(jìn)行了 16S rRNA 的PCR鑒定。購(gòu)自山東福瑞達(dá)公司的透明質(zhì)酸 （分子量1 800 000 Da） 作為對(duì)照。十六烷基三甲基溴化銨 （CTAB，aladdin），腦-心浸出液肉湯（BHI，廣州環(huán)凱），葡萄糖、七水硫酸鎂、NaCl、乙醇、醋酸鈉、乙酸、磷酸二氫鉀、瓊脂糖 （國(guó)藥），酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨 （HANGWEI，杭州），十二烷基硫酸鈉 （SDS，Solarbio）。

1.2培養(yǎng)基

BHI為粉末狀，成分 （100 m L） 為胰蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鈉0.25 g、葡萄糖0.2 g和牛心浸出液50 m L，pH 7.4。使用時(shí)稱取3.7 g溶于100 m L超純水，pH 7.4，121 ℃高壓滅菌 30 m in。在上述 BHI液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂糖，即得 BHI固體培養(yǎng)基，然后121 ℃高壓滅菌30 m in備用。

葡萄糖培養(yǎng)基由葡萄糖2 g、酵母浸膏2 g、牛肉浸膏2 g、蛋白胨1 g、七水硫酸鎂0.2 g和磷酸二氫鉀0.2 g組成，加100 m L超純水溶解，調(diào)pH至7.4，121 ℃高壓滅菌30 m in備用。

將上述液體BHI和葡萄糖培養(yǎng)基按一定比例混合即得混合培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)中BHI和葡萄糖培養(yǎng)基的比例設(shè)為0∶1，1∶0，1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1等7種。

1.3海豚鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物的粗提和純化

經(jīng)Strep.菌發(fā)酵15 h后往發(fā)酵液中加入與發(fā)酵液等體積的0.1%十二烷基硫酸鈉 （SDS，W/V），攪勻，室溫靜置10 m in，離心10 min （7 000 r/m in），取上清，加入兩倍體積的乙醇，4 ℃過(guò)夜，然后4 ℃下離心18 m in （7 000 r/m in），得到的沉淀用乙醇鹽溶液 （75%乙醇、25% 的0.15 mol/L NaCl）洗滌、離心3次，每次2 m in （10 000 r/min），最后將沉淀干燥，即得發(fā)酵粗產(chǎn)物［17］。

對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的純化采用“CTAB法”［18-19］。在發(fā)酵初產(chǎn)物中加入0.1% SDS，靜置10 m in后離心，取上清，加入一定量的CTAB （10%，W/W） 溶液，攪拌，靜置15 m in，離心得沉淀；加入NaCl溶液 （0.2 mol/L） 攪拌，然后離心得上清液，在上清液中加入兩倍體積乙醇，離心得到沉淀。最后，用乙醇鹽溶液洗滌、離心3次，得到沉淀，室溫下干燥。上述離心條件均為 2 m in，10 000 r/min。干燥后的HA，用于紅外表征及分子量的測(cè)定［18］。

1.4發(fā)酵產(chǎn)物中HA濃度的測(cè)定

HA濃度的測(cè)定采用改良的CTAB比濁法［20］，以標(biāo)準(zhǔn)HA配制濃度分別為0、20、40、60、80 及100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定400 nm處的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述純化的發(fā)酵產(chǎn)物用超純水溶解，取150 μL置于2 m L EP管，加入350 μL醋酸緩沖液 （0.2 mol/L醋酸鈉，0.15 mol/L氯化鈉，用乙酸調(diào)節(jié) pH至6.0），最后加入1 m L CTAB溶液，混勻，室溫靜置10-15 m in，于400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出發(fā)酵產(chǎn)物中HA的濃度。

1.5發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定及蛋白去除率的計(jì)算

BCA試劑盒由康為世紀(jì)公司 （Cat:CW 0014）提供，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程，根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算出所測(cè)溶液的蛋白質(zhì)濃度。

蛋白去除率為純化前蛋白含量 （P0） 與純化后蛋白含量 （P1） 的差值比上P0，即去除率= （P0-P1）/P0。

1.6HA分子量測(cè)定

1.7海豚鏈球菌的紫外誘變

取少量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的海豚鏈球菌 Strep.均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，紫外 （U ltraviolet，UV） 燈照射一定時(shí)間，根據(jù)不同照射時(shí)間的致死率，選擇致死率在 90%以上的照射時(shí)間作為紫外誘變的最佳時(shí)間，然后挑取若干單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，再擴(kuò)大培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行HA的提取、純化、HA含量和蛋白含量以及分子量測(cè)定，與未誘變的菌株比較，篩選產(chǎn)量明顯提高的菌株。紫外燈的功率為20 W，照射距離為30 cm，致死率的計(jì)算為不同照射時(shí)間下的菌落數(shù) （N1） 與未照射下的菌落數(shù) （N0） 之差，除以N0所得，即致死率=（N1-N0）/N0×100%。

1.8培養(yǎng)基的優(yōu)化

將 BHI培養(yǎng)基 （B） 與葡萄糖培養(yǎng)基 （G）按不同的比例混合，觀察菌體的生長(zhǎng)狀況，實(shí)驗(yàn)中按B∶G=0∶1，1∶0，1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1共7種比例混合，然后將活化后的菌種按 1∶100的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，28-30 ℃、150 r/min培養(yǎng)15 h以上，停止培養(yǎng)，取 500 μL混勻后的菌液，8 000 r/m in離心10 m in，吸去上清，再加入500 μL PBS重懸，取200 μL測(cè)吸光度 （波長(zhǎng)600 nm），用于確定不同培養(yǎng)基下菌體的生物量。每種比例培養(yǎng)基重復(fù)培養(yǎng)3次，得到平均結(jié)果。

1.9透明質(zhì)酸應(yīng)用于兔子皮膚修復(fù)

運(yùn)用物理凍法將透明質(zhì)酸粉末制備成 HA水凝膠［22］。將上述制備的 HA水凝膠承載于無(wú)菌無(wú)紡布上。HA濃度為16 mg/m L，每張無(wú)紡布上的水凝膠用量為3 m L。以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將兔子背部人為造成3.5 cm×3.5 cm的全層皮膚缺損，缺損皮厚度約為1.5 mm。實(shí)驗(yàn)兔分為二組共20只，一組常規(guī)消毒，紗布覆蓋 （對(duì)照組）；另一組酒精消毒后以上述HA水凝膠覆蓋傷口 （HA組），2 d換一次凝膠，5 d后拆掉覆蓋層。觀察傷口外觀、傷口尺寸隨時(shí)間變化、傷口周圍炎癥情況及血液中的白細(xì)胞（White blood cell，WBC） 變化情況。

1.10統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的分析采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)，差異具有顯著性。應(yīng)用Graphpad Prism 6.0及SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1海豚鏈球菌的生長(zhǎng)曲線

Strep. 在14 h的培養(yǎng)周期中其生長(zhǎng)曲線如圖2所示，從圖中可以看出，0-6 h為該菌的生長(zhǎng)適應(yīng)期，6-10 h為該菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 h以后該菌即進(jìn)入穩(wěn)定期。對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物的提取，在鏈球菌進(jìn)入穩(wěn)定期后其自身的透明質(zhì)酸酶會(huì)分解透明質(zhì)酸，而且進(jìn)入穩(wěn)定期后其產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力也有所減弱，因此，我們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)11-13 h后，即進(jìn)行透明質(zhì)酸的提取；對(duì)于鏈球菌的紫外誘變，一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期比較適宜，因此，我們選擇在發(fā)酵培養(yǎng)9-10 h后進(jìn)行紫外誘變。

2.2海豚鏈球菌的紫外誘變及培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1紫外誘變

海豚鏈球菌在相同紫外燈功率下，照射不同時(shí)間后的致死率如圖3所示，在0、5、30、60 和120 s共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，在照射時(shí)間為5 s時(shí)，已有近50%以上的鏈球菌死亡，30 s時(shí)，死亡率已達(dá)到90%以上，60 s以上，鏈球菌的死亡率已接近100%。因此，實(shí)驗(yàn)中我們采用紫外照射時(shí)間35 s作為紫外誘變時(shí)間。

圖2　海豚鏈球菌的生長(zhǎng)曲線Fig. 2 The grow th curve of Streptococcus iniae as a function of time.

圖3　海豚鏈球菌的紫外誘變致死率曲線Fig. 3 The mortality of Streptococcus iniae under UV treatment as a function of time.

對(duì)第一次紫外誘變后的菌株進(jìn)行篩選，得到透明質(zhì)酸產(chǎn)量略高的菌株，將該菌株再重復(fù)誘變一次，得到的菌株其產(chǎn)量比未誘變的Strep.提高達(dá) 46.4% （從 （82.3±3.3） mg/L增加到（120±10.6） mg/L），結(jié)果如圖4所示。

2.2.2培養(yǎng)基的優(yōu)化

在 7種不同的培養(yǎng)基中，BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鏈球菌其吸光度值比在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的鏈球菌高很多，說(shuō)明鏈球菌在普通葡萄糖培養(yǎng)基中很難生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)緩慢，甚至不生長(zhǎng)，而當(dāng)在葡萄糖培養(yǎng)基中加入BHI后其生長(zhǎng)明顯加快，菌體量明顯增多，且隨著B(niǎo)HI比例的增加，其菌體量隨之增高，在BG5.5 （即BHI∶葡萄糖培養(yǎng)基=5∶3） 之前，混合培養(yǎng)基中的菌體量少于BHI培養(yǎng)基中的菌體量，而在BG7.3之后 （包括 BG7.3） 混合培養(yǎng)基中菌體量則比純BHI培養(yǎng)基中的菌體量多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），如圖5所示。說(shuō)明BHI中一定量的葡萄糖培養(yǎng)基有助于鏈球菌的生長(zhǎng)。

圖4　海豚鏈球菌2次紫外誘變后的HA產(chǎn)量變化Fig. 4 The variation of HA's yield of Streptococcus iniae after two times of UV mutation.

圖5　海豚鏈球菌在不同培養(yǎng)基配比下的吸光度Fig. 5 Absorbance of Streptococcus iniae （at 600 nm）w ith a variety of culture media of different ratio of BHI to glucose medium. In picture， BG0.1 stands for the ratio of BHI medium to glucose medium （B:G）=0:1； so are others.

發(fā)酵產(chǎn)物純化的目的主要是去除產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)成分，本文采用CTAB法［18-19］純化HA，純化后產(chǎn)物的蛋白含量從 （0.178±0.011） mg/L降低到 （0.032±0.017） mg/L，如圖6所示（P＜0.05），蛋白去除率達(dá)82.02%，純化的效率為88.32%，比文獻(xiàn)［19］報(bào)道的略低。對(duì)純化后的HA采用烏氏粘度法進(jìn)行分子量的測(cè)定，得到其分子量約為3×105Da。

圖6　HA純化前后蛋白含量的變化Fig. 6 The variation of protein content before and after HA purification.

2.3FTIR表征

海豚鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后，充分干燥，以溴化鉀壓片，利用紅外光譜儀 （Thermo，美國(guó)） 進(jìn)行FTIR吸收光譜測(cè)試 （掃描范圍4 000-400 cm-1）。得到的紅外吸收光譜與HA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，從圖7可以看出，海豚鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中HA的吸收峰 （A） 與HA標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰 （B） 基本一致，在3 400 cm-1附近有很強(qiáng)的O-H伸縮振動(dòng)的特征吸收，說(shuō)明存在多羥基結(jié)構(gòu)；在2 920 cm-1附近有-CH2的伸縮振動(dòng)；在1 560-1 620 cm-1附近有CO-、CN-的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明存在酰胺基結(jié)構(gòu)；1 420 cm-1處為羧基中O-H的伸縮振動(dòng)，以上的特征吸收峰可以表明Streptococcus iniae發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后得到的主要為HA，其含有的多糖羥基、乙酰氨基及羥羧基結(jié)構(gòu)，與 HA重復(fù)單位中的乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸一致。綜上所述，采用Streptococcus iniae誘變發(fā)酵法可以作為HA的微生物發(fā)酵制備的菌株。

2.4HA 水凝膠在皮膚修復(fù)中的作用初探

圖7　透明質(zhì)酸的FTIR曲線Fig. 7 FTIR curve of hyaluronic acid. A: HA fabricated from Strep. Fermentation； B: standard HA.

圖8　兔子背部全層皮膚修復(fù)觀察Fig. 8 Overview of wound skin repairing on rabbit's back. a: control group； b: HA group.1: day 0 post-operation； 2: day 5 post-operation； 3: day 18 post-operation； 4: day 27 post-operation； 5: day 40 post-operation.

兔子背部傷口分別經(jīng)臨床上常規(guī)紗布包覆和采用 HA水凝膠包覆后傷口修復(fù)的外觀觀察情況如圖6所示，18 d和27 d時(shí)其傷口的修復(fù)情況均明顯好于對(duì)照 （無(wú)凝膠） 組。HA組與對(duì)照組的傷口在手術(shù)后2 d均是濕潤(rùn)的，凝膠及無(wú)紡布上都有血跡，傷口有紅腫，HA組比對(duì)照組略輕；在術(shù)后 5 d左右二組均有一定程度的化膿，傷口周圍紅腫但比 2 d時(shí)減輕，相對(duì)而言HA組化膿情況輕微，紅腫不如對(duì)照組明顯，傷口周圍已部分結(jié)痂；5 d后傷口均慢慢縮小，整個(gè)傷口部分均結(jié)痂變硬；到18 d和27 d時(shí)，二組的傷口情況已發(fā)生明顯差異 （圖8和圖9），結(jié)痂變硬的部分有所脫落，但瘢痕仍明顯，至40 d時(shí)傷口幾乎完全愈合，留下一個(gè)很小的無(wú)毛發(fā)區(qū)。

對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行血液白細(xì)胞檢查，結(jié)果如圖10所示。術(shù)后6 d前，白細(xì)胞值總體呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組 （Ctrl） 的白細(xì)胞上升趨勢(shì)尤其明顯，而 HA組變化不明顯。通常手術(shù)一周內(nèi)傷口易發(fā)生炎癥，體現(xiàn)在血液中白細(xì)胞量增加，這也說(shuō)明HA有助于降低傷口炎癥的發(fā)生。6 d后，兩組白細(xì)胞值總體呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)兔子傷口炎癥已較輕微；到20 d左右，基本與術(shù)前一致，也即在傷口處基本已無(wú)炎癥。相比而言，HA組的總體炎癥情況明顯低于對(duì)照組，這對(duì)傷口的修復(fù)是非常有利的。

圖9　傷口面積的大小變化 (cm2)，第18及27天時(shí)，Ctrl及HA組的傷口面積差異有顯著性 (P<0.05)Fig. 9 The variation of area of scars （cm2）， the area of scars of Ctrl and HA groups are different significantly at the 18thand 27thdays （P＜0.05）.

圖10　術(shù)后20 d內(nèi)對(duì)照組與HA組血液中白細(xì)胞相對(duì)含量的變化Fig. 10 Relative values of WBC in blood of Ctrl and HA groups in 20 days post-operation.

3　討論

早在1937年Kendall等［23］就在溶血性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)并提取了透明質(zhì)酸，之后許多科學(xué)家及研究者對(duì)菌種及發(fā)酵提取方法做了眾多改進(jìn)，獲得了無(wú)溶血性、透明質(zhì)酸酶缺陷及透明質(zhì)酸產(chǎn)量較高的菌株，形成了多種較好的發(fā)酵及分離純化方法，使產(chǎn)物提取效率增大、雜質(zhì)含量減少以及分子量提高。但這些研究所使用的菌株主要為獸疫鏈球菌或馬疫鏈球菌等，本實(shí)驗(yàn)室所用的海豚鏈球菌是從美國(guó)羅非魚(yú)中分離得到的，為革蘭氏陽(yáng)性球菌，兼性厭氧，呈β溶血。其微莢膜主要是由透明質(zhì)酸組成，并且能一定程度地向培養(yǎng)基中分泌透明質(zhì)酸，目前還未有從海豚鏈球菌中提取透明質(zhì)酸的報(bào)道，我們的研究表明該海豚鏈球菌 Streptococcus iniae，尤其在紫外誘變后可以作為透明質(zhì)酸的發(fā)酵菌株。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于 HA菌株的誘變劑主要有紫外線、γ射線、亞硝基胍等［24］，它們對(duì)菌株產(chǎn)生突變的作用方式有所不同，亞硝基胍等主要是引起堿基對(duì)置換，得到的突變株回復(fù)突變率較高，而紫外線、γ射線等則引起堿基對(duì)缺失、編碼框移位等較大的遺傳物質(zhì)損傷，使回復(fù)突變率較低［25］。除了能產(chǎn)生相對(duì)穩(wěn)定的突變株，紫外線和 γ射線還具有相對(duì)安全、無(wú)毒及無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。因此在海豚鏈球菌的篩選中，我們使用更方便、設(shè)備要求更低的紫外誘變方法，通過(guò)紫外誘變，我們得到了產(chǎn)量比未突變株有所提高的菌株。但是與獸疫鏈球等成熟的發(fā)酵菌株相比，海豚鏈球菌發(fā)酵的 HA在產(chǎn)量、分子量及純度方面還是有很大不足［26-30］。不過(guò)，目前我們對(duì)于海豚鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn) HA的研究才剛剛開(kāi)始，今后將在提高 HA產(chǎn)量、分子量及純度上進(jìn)行更深入的研究。

海豚鏈球菌對(duì)于培養(yǎng)基的要求非常高，基本上只在BHI培養(yǎng)基或含有腦心浸出液的培養(yǎng)基中能較好生長(zhǎng)。在相同的培養(yǎng)條件下，海豚鏈球菌的生長(zhǎng)速度比獸疫鏈球菌慢，尤其是在有氧條件下。但是從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看在 BHI培養(yǎng)基中加入一定量的葡萄糖培養(yǎng)基有助于海豚鏈球菌的生長(zhǎng)，比在單獨(dú)BHI培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況要好。說(shuō)明葡萄糖培養(yǎng)基或葡萄糖培養(yǎng)基中的某些成分在BHI培養(yǎng)基中的含量對(duì)海豚鏈球菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。這個(gè)問(wèn)題還將在今后的研究中逐步深入。

透明質(zhì)酸應(yīng)用于皮膚修復(fù)的研究已有報(bào)道，如直接將 HA粉末應(yīng)用于傷口［31-32］，或者將 HA與其他成分如生長(zhǎng)因子等混合應(yīng)用于傷口［31，33］。我們采用將透明質(zhì)酸制成水凝膠，在未加任何生長(zhǎng)因子的情況下用于動(dòng)物全層皮膚缺損的修復(fù)，初步研究已發(fā)現(xiàn)其明顯的降低炎癥、提高傷口收口速度、以及疤痕程度減輕等優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)可能跟 HA水凝膠在動(dòng)物體內(nèi)的降解有關(guān)。HA在體內(nèi)的降解吸收速度決定于其分子量的大小，分子量大降解吸收慢，相反分子量小降解吸收快，當(dāng)小分子量的 HA形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠后，其在體內(nèi)的降解吸收速度也會(huì)變慢，因此等量的 HA在凝膠狀態(tài)比在單體狀態(tài) （如 HA粉末） 在體內(nèi)存在時(shí)間更長(zhǎng)，發(fā)揮效用的時(shí)間也因此延長(zhǎng)，這也是為什么我們要將 HA單體制成凝膠后應(yīng)用于動(dòng)物皮膚修復(fù)的原因。

4　結(jié)論

我們發(fā)現(xiàn)了一種新的有望作為透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌的鏈球菌——海豚鏈球菌 Streptococcus iniae，經(jīng)過(guò)紫外誘變后獲得了一株產(chǎn)量較高的突變株，相比原始菌株其產(chǎn)量提高達(dá) 46%，該海豚鏈球菌在有氧和無(wú)氧條件下均能產(chǎn)生透明質(zhì)酸，但在無(wú)氧條件下略高。另一方面，Streptococcus iniae對(duì)培養(yǎng)基的要求比較高，需要牛心浸出液等成分才能很好的生長(zhǎng)，在一般葡萄糖、蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)非常緩慢，我們經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)在BHI培養(yǎng)基中混合少量葡萄糖培養(yǎng)基，有利于其生長(zhǎng)。

將透明質(zhì)酸采用物理方法 （即不加其他成分） 制成水凝膠后對(duì)兔子背部全層皮膚的修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)在減輕傷口及全身的炎癥反應(yīng)、減少瘢痕的形成等。對(duì)于 HA用于皮膚修復(fù)更詳細(xì)的研究仍在進(jìn)行中，將會(huì)在后續(xù)工作中報(bào)道。由于在 HA轉(zhuǎn)變成水凝膠的過(guò)程中沒(méi)有添加其他成分，保證了其應(yīng)用的安全性，也有助于今后在臨床上進(jìn)行推廣。

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（本文責(zé)編 陳宏宇）

December 9， 2015； Accepted: March 17， 2016

Yabin Zhu. Tel: +86-574-87609592； E-mail: zhuyabin@nbu.edu.cn

Hyaluronic acid production by Streptococcus iniae and its app lication in rabbit skin’s regeneration

Feng Guan1, Jiachang Jin1, Huaguo Zhao1, Lei Hong1, Zhisen Shen2, and Yabin Zhu1

1 The Medical School， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China
2 The Lihuili Hospital Affiliated to the Medical School， Ningbo University， Ningbo 315041， Zhejiang， China

Hyaluronic acid （HA） is an important biomaterial as the extracellular matrix in human body. We produced HA by fermentation of Streptococcus iniae （Strep.）. Production of HA by Strep. was evaluated and further improved by strain mutation by ultraviolet. One strain w ith higher HA yield and lower content of protein was obtained. Its HA yield increased from （82.3±3.3） mg/L to （120±10.6） mg/L， and protein decreased from （0.178±0.011） mg/L to （0.032±0.017） mg/L. The molecular weight （MW） of HA yield from Strep. is about 3.0×105Da. Using the method of freezing and thaw ing， HA aqueous solution was transferred into hydrogel. This HA hydrogel， casted on sterilized non-woven fabric， was applied to repair rabbit skin w ith full-thickness defect. The prelim inary results of the animal tests displayed that HA hydrogel obviously reduced the inflammation around the wound and promoted the skin regeneration comparing w ith the control tests.

Streptococcus iniae， fermentation， hyaluronic acid， skin regeneration

Supported by: National Natural Science Foundation of China （Nos. 81171476， 81471797）， Project of Scientific Innovation Team of Ningbo （Nos. 2015B11050， 2012C5015）.

國(guó)家自然科學(xué)基金 （Nos. 81171476， 81471797），寧波科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （Nos. 2015B11050， 2012C5015） 資助。