安云鶴，高麗娟，李俊博，田彥捷，王金龍，鄭學娟，武會娟

1 北京市理化分析測試中心，北京 1000892 北京市基因測序與功能分析工程技術研究中心，北京 100094

生物技術與方法

PCR擴增循環(huán)數對細菌群落多樣性測序分析的影響

安云鶴1，2，高麗娟1，2，李俊博1，2，田彥捷1，2，王金龍1，2，鄭學娟1，2，武會娟1，2

1 北京市理化分析測試中心，北京 100089
2 北京市基因測序與功能分析工程技術研究中心，北京 100094

安云鶴， 高麗娟， 李俊博， 等. PCR 擴增循環(huán)數對細菌群落多樣性測序分析的影響. 生物工程學報， 2016， 32（8）: 1115-1123.

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運用高通量測序技術分析復雜樣品中微生物群落組成及變化趨勢，已經成為目前微生物研究領域的熱點之一。本研究以復雜土壤樣品和應用范圍較廣的瘤胃食糜樣品為對象，選取20、25和30三個擴增循環(huán)數分別對樣品的16S rRNA基因的V3區(qū)進行擴增，然后進行文庫構建和測序。最后通過數據分析比較不同的擴增循環(huán)數對細菌多樣性測定結果的影響。結果表明，擴增循環(huán)數越多，捕獲到的細菌數量和種類越多；但并非循環(huán)數越多，群落中的微生物組成比例最優(yōu)。整體來看，當擴增循環(huán)數為25時，樣品中物種的數量和組成是最優(yōu)的。

PCR擴增循環(huán)數，高通量測序，微生物多樣性分析

目前，能夠在實驗室條件下培養(yǎng)的微生物種類占自然界中微生物總數的不到1%，絕大多數尚未被人類所認識［1］。隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR指紋技術［2-3］、DNA 文庫［4-5］、RAPD［6-7］、ITS［8-9］、DGGE［10-11］等技術相繼被廣泛應用于微生物群落結構及基因資源的開發(fā)利用，從而擺脫了培養(yǎng)的限制。尤其近幾年，新一代測序技術以高通量、速度快、低成本等特點迅速發(fā)展，在微生物多樣性研究領域，正在逐步取代傳統(tǒng)的分子生物學方法［12-16］，從而進一步豐富和拓展了人們對于未培養(yǎng)微生物的認識。

利用高通量測序技術研究微生物的多樣性，對于樣品的要求較為嚴格。其中，目的片段的擴增是進行微生物多樣性測序的關鍵步驟之一。不同的擴增循環(huán)數會直接影響最終數據分析中微生物種群的組成和豐度。由此可見，在微生物多樣性測序中，環(huán)境樣品的PCR擴增是非常關鍵和重要的環(huán)節(jié)。

盡管之前已有研究對土壤和羊瘤胃食糜樣品擴增條件［17-19］的報道，但大多是基于 DGGE方法的，并且很少涉及擴增循環(huán)數的優(yōu)化。目前對高通量測序方法過程中，不同類型樣品的PCR擴增條件等方面尚未有系統(tǒng)的研究。本研究以土壤和羊瘤胃食糜樣品為對象，對最適PCR擴增循環(huán)數進行了比較研究。結果發(fā)現，在相同DNA模板量情況下，擴增循環(huán)數越多捕獲到的微生物種類越多，但會造成優(yōu)勢菌群的過量擴增，從而使其比例變化顯著。

1　材料與方法

1.1DNA提取

土壤樣品直接稱取250 mg進行后續(xù)操作；食糜樣品離心沉淀并用PBS洗滌后用于與處理土壤樣品同樣的后續(xù)操作。樣品中加入 800 L CTAB緩沖液振蕩2 m in，加0.3 g 0.1 mm研磨珠和0.1 g 0.5 mm研磨珠，每隔2 m in振蕩1次，持續(xù)30 m in；70 ℃水浴20 m in后離心收集上清，加入RNAase 37 ℃水浴30 m in以去除樣品中的RNA 污染；加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）振蕩 30 s至呈白色乳液，離心收集上清；重復萃取步驟1次后，加入0.8倍體積異丙醇，充分混勻，室溫放置5-10 m in，放入-20 ℃過夜沉淀DNA；高速離心20 m in，去除上清，用70%乙醇洗滌沉淀，最后風干沉淀并用50-100 L去離子水溶解。最后用BioSpec-nano核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度和質量，同時取500 ng DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2PCR擴增

選取土壤和食糜樣品各 25 ng，分別利用Ex Taq酶對 16S rRNA基因的 V3可變區(qū)進行PCR擴增，擴增循環(huán)數分別選取 20、25和 30個循環(huán)。擴增引物為：Forward：5′-CCTACGGGA GGCAGCAG-3′，Reverse：5′-ATTACCGCGGCT GCTGG-3′。每一條前向引物的5′末端均加入10 bp的一段barcode序列，用于區(qū)分不同條件的擴增產物。擴增產物分別命名為S-20c、S-25c、S-30c、C-20c、C-25c和C-30c。

1.3文庫構建和測序

將6個擴增產物按照每個100 ng的質量進行混合后，對混合產物進行末端補平加 A、連接接頭和少量擴增進行富集。對構建好的文庫進行Agilent 2 100和QPCR質檢，合格后用于M iseq 2×150 bp的測序。

1.4分析軟件

對測序得到的原始數據進行過濾，去掉接頭和低質量的測序序列，得到可用于后續(xù)分析的高質量數據，并用fastqc軟件對數據進行質量評估，使用FLASH軟件對高質量數據進行組裝，獲得更多含barcode的測序序列。再使用QIIME軟件根據barcode序列將該組裝結果回歸樣品，并對每個樣品的序列數進行統(tǒng)計。然后使用uclust軟件根據序列相似性 （閾值為97%） 進行聚類，得到 OTU （操作分類單元） 序列，并進行優(yōu)化和分類。本研究采用菌群豐富度指數 chao1、ACE，菌群多樣性指數Simpson、Shannon和菌群覆蓋度指數goods coverage、observed species對菌群進行多樣性分析。最后使用 greengenes數據庫 （201305版本） 并根據分類學分析結果，分析樣品在各分類水平上的物種組成比例情況。

1.5主要試劑和儀器

土壤樣品 （簡稱 S），為山東冬季未經圍填的距離圍填海區(qū)域1.5 km、距表層15 cm的植物根系土壤。樣品采集后，冰塊運送并于 24 h內處理；羊瘤胃食糜樣品 （簡稱 C），取自立即處死的羊瘤胃胃液，經紗布過濾處理，并立即進行核酸提取；RNAase購自美國NEB公司；0.1 mm和0.5 mm研磨珠購自美國BioSpec公司；CTAB （十六烷基三甲基溴化銨）、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇等均購自北京化學試劑公司；Ex Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；Truseq DNA library prep kit、Illum ina 2×150 bp測序試劑均購自美國Illum ina公司。高速離心機購自德國 Eppendorf公司；BioSpec-nano核酸蛋白測定儀購自日本島津公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司；M iseq測序儀購自美國Illum ina公司。

2　結果與分析

2.1土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA提取

按照材料與方法中DNA提取步驟提取土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA，然后用BioSpec-nano測定DNA的濃度和質量 （表1）。結果表明，土壤樣品的DNA濃度為12.25 ng/L，食糜的提取濃度為11.85 ng/L，A260/280的值均在1.7-2.0之間。瓊脂糖凝膠電泳的結果如圖 1所示，表明提取的微生物基因組完整，沒有RNA等污染。

2.2不同的擴增循環(huán)數對測序數據OTU和稀釋曲線的影響

表1　土壤和羊瘤胃食糜樣品DNA提取濃度Table 1 DNA concentration extracted from soil and chyme sam p les

分別對土壤和食糜樣品的 16S V 3區(qū)進行20、25和30三個不同擴增循環(huán)數的擴增，最終通過數據分析觀察不同擴增循環(huán)數對最終數據的OTU數目和稀釋曲線的影響。實驗結果表明，食糜樣品的OTU數目隨著擴增循環(huán)數的增加而顯著增加，而土壤樣品的OTU數目在擴增循環(huán)數為 25時最高；當擴增循環(huán)數增加至 30，其OTU數目反而有所下降，但仍較擴增循環(huán)數為20時的OTU數目多 （圖2A）。S-20c、S-25c、S-30c的OTU數目分別為5 524、11 852和8 172；C-20c、C-25c、C-30c的OTU數目分別為1 737、2 663和7 233。每個樣品的稀釋曲線基本都呈逐漸平緩的趨勢 （圖2B），說明測序數據基本能夠覆蓋目前狀態(tài)下的微生物種類。

圖1　土壤和食糜樣品DNA膠圖Fig. 1 Electrophoretogram of DNA extracted from soil and chyme samples. S: soil； C: chyme； M: 1 kb DNA marker.

2.3不同擴增循環(huán)數對微生物數量和種類的影響

實驗結果表明，隨著擴增循環(huán)數的增加，微生物數量都呈上升趨勢。但土壤樣品和食糜樣品的情況略有不同，土壤樣品在擴增至25個循環(huán)時，微生物數量最多，當循環(huán)數增加至 30時，微生物的數量改變不大。如圖3所示，S-20c、S-25c和S-30c獲取的微生物數目分別是：49 475、169 257和147 895。而對于食糜樣品，微生物的數量隨著擴增循環(huán)數的增加而呈逐漸上升的趨勢，但擴增循環(huán)數為30時，較擴增循環(huán)數為25時的微生物數量上升緩慢。如圖 3所示，

C-20c、C-25c和C-30c獲取的微生物數目分別是：17 631、44 788和56 492。

圖2　不同擴增循環(huán)數對測序數據OTU和稀釋曲線的影響Fig. 2 Effect of different amplification cycles on OTU and Rarefaction curves. （A） Effect of different amplification cycles on OTU in soil and chyme samples. （B） Effect of different amplification cycles on Rarefaction curves in soil and chyme samples.

圖3　不同擴增循環(huán)數對微生物數量的影響Fig. 3 Effect of different amplification cycles on m icrobial population.

從微生物多樣性分析的結果來看，物種較為豐富的土壤樣品，當擴增循環(huán)數為25時，其微生物種類為16 263，基本達到飽和程度；當擴增循環(huán)數為30時，樣品中的微生物種類為14 188，微生物的種類沒有增加，反而有一定程度的降低 （表 2）。而對于食糜樣品，隨著擴增循環(huán)數的增加，捕獲到的微生物種類呈遞增趨勢。如表2所示，C-20c/25c/30c捕獲的微生物種類分別是2 202、3 908和8 030。

在門水平上對樣品中微生物的群落組成進行分析的結果表明，并非擴增循環(huán)數越多，樣品中微生物的群落組成越豐富。對于物種含量較豐富的土壤樣品來說，3個不同的擴增循環(huán)數對于豐度較高菌門的微生物捕捉是一致的，但對豐度較低菌門的微生物捕捉差別較大。當擴增循環(huán)數為25時，微生物的種類最多；而當擴增循環(huán)數為30時，微生物的種類反而會減少，尤其是豐度較低的菌門微生物，很多在擴增循環(huán)數為 25時捕捉到的微生物種類缺失，如BHI80-139、H-178、LD1、AncK 6等，組成比例也相應地變化較大 （圖4A）。而對于物種含量較少的食糜樣品，總體來看，隨著擴增循環(huán)數的增加，物種含量也相應增多。但當擴增循環(huán)數為30時，其優(yōu)勢菌門的微生物含量比例變化較大 （圖4B）。因此，從2種樣品的分析結果來看，當擴增循環(huán)數為25時，物種的豐富度和群落組成比例更為合理。

3　討論

高通量測序技術通過對高質量樣品的快速測序，以一種更為便捷經濟的方式，可以獲得樣品中全面、準確、無偏的數據信息。也正因如此，利用高通量測序技術的微生物多樣性測序［12-14，16］和宏基因組測序［15，20-21］越來越得到研究者的重視和青睞，其應用范圍也越來越廣。

表2　不同擴增循環(huán)數對微生物種類的影響Tab le 2 Effect of different am p lification cycles on m icrobial species

圖4　不同擴增循環(huán)數對微生物門水平群落組成的影響Fig. 4 Effect of different amplification cycle number on m icrobial community composition. （A） Effect of different amplification cycle number on m icrobial community composition in soil samples. （B） Effect of different amplification chloroflexi cycle number on m icrobial community composition in chyme samples.

高通量測序技術對樣品的要求較高，不合格的樣品質量將造成后續(xù)數據分析的巨大偏差。土壤中富含腐殖酸等化合物［22］，因此提取的DNA純度往往不能令人滿意，影響后續(xù)PCR反應和DNA測序［23］。存在于動物和人體中的食糜樣品，無論是取自胃部還是腸道，其中所含微生物種類對于健康［24］、養(yǎng)殖［13］、發(fā)酵［25］等領域均具有重要的理論意義。在此研究中，我們選取環(huán)境樣品中較難處理的土壤樣品和應用范圍較廣的食糜樣品，旨在得到一套可用于指導高通量測序前期樣品DNA提取及擴增條件的技術參數。

從DNA的提取結果來看，不論是土壤樣品，還是食糜樣品，DNA的質量均符合要求。我們選取25 ng DNA作為模板成功地進行后續(xù)PCR擴增，然后將擴增產物用于建庫、測序及數據分析。從數據產生的OTU來看 （圖2A），土壤樣品獲得的OTU數目遠遠多于食糜樣品，這暗示土壤中所含的細菌種類較多，而食糜樣品中種類較少。此外，土壤中所含的細菌數量也遠遠高于食糜樣品 （圖 3）。這些數據均表明，土壤樣品中微生物的復雜程度遠遠高于食糜樣品。因此在擴增循環(huán)數的選擇上也有所不同。

就土壤樣品而言，當擴增循環(huán)數達到25時，其細菌種類和數量均達到最高值。再增加循環(huán)數，二者均會有所降低 （圖 3和表 2）。同時，從群落組成的結果來看，擴增循環(huán)數為25時，土壤中微生物的組成比例最優(yōu) （圖4A）。不但保持擴增循環(huán)數為20時的優(yōu)勢菌門種類和比例，同時最大程度增加了劣勢菌門的種類。而當擴增循環(huán)數為30時，不但會丟失低擴增循環(huán)數下捕捉到的劣勢菌，如BHI80-139，并且增加的劣勢菌種類也遠遠不及擴增循環(huán)數為 25時的結果。

在食糜樣品中，隨著擴增循環(huán)數的增加，細菌種類和數量都呈上升趨勢。其中，細菌的種類隨著擴增循環(huán)數的增加，上升趨勢顯著 （表2）；而擴增循環(huán)數為30時，細菌的數量只比擴增循環(huán)數為25時的有小幅提升 （圖3），說明當擴增循環(huán)數為25時，細菌的數量已經趨于飽和。這些數據表明，從擴增循環(huán)數25增加至30，擴增的產物總量變化不大，而種類發(fā)生了變化。從食糜樣品的群落組成來看，當擴增循環(huán)數為30時，4個優(yōu)勢菌，如擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、軟壁菌門 Tenericutes、變形菌門Proteobacteria，其比例組成較擴增循環(huán)數為20和25時均有大幅變化。而劣勢菌得到了大幅擴增，不但種類更多，同時組成比例也相應增大 （圖4B）。

因此，對于食糜這類微生物含量較低的樣品而言，如果要關注優(yōu)勢菌的種類和比例，選擇擴增循環(huán)數為25會更有利于結果分析；如果要關注其中的劣勢菌，則選擇擴增循環(huán)數為 30會更有利。對于土壤這種微生物含量豐富的樣品，擴增循環(huán)數選擇 25是最優(yōu)的。這與利用DGGE法分析微生物多樣性，所選用的擴增循環(huán)數有所不同。DGGE技術主要是利用梯度變性膠來分離DNA片段。其原理是不同堿基組成的DNA雙螺旋，在線性梯度變性劑中發(fā)生解鏈的位置不同，從而造成在變性膠中涌動的位置不同而達到分離的目的。因此，在進行電泳前，樣品的擴增產物要滿足兩個條件：一個是盡可能保持擴增產物的穩(wěn)定性以增加電泳時間，達到精確分離的目的；一個是盡量增加擴增產物量以保證每個分離條帶的可辨性。因此，DGGE一般會在引物的5′端添加30 bp左右的GC夾子，同時擴增循環(huán)數一般不低于 30個循環(huán)。DGGE方法中關于PCR條件的優(yōu)化有很多研究報道，但主要集中在PCR技術的選擇上［17-19，26］，如普通PCR、降落PCR、巢式PCR或其他技術改進。這一方面與GC夾子的引入有關，一方面與擴增產物的量必須達到相對較高的水平有關。

不論是利用高通量測序技術還是DGGE技術，在分析微生物的多樣性組成時，都涉及DNA樣品的PCR擴增，即均需要對樣品進行富集。一般情況下，擴增循環(huán)數越少，越能反應樣品的真實情況；但擴增循環(huán)數越少，能夠捕捉到的樣品信息也會越少。為了平衡樣品的真實性和信息的全面性，我們比較了20、25、30三個擴增循環(huán)數對微生物群落組成的影響。從分析結果來看，無論是土壤樣品還是食糜樣品，當擴增循環(huán)數為25時，細菌的群落組成與擴增循環(huán)數為20時的群落組成最接近，即最接近真實狀態(tài)，同時其在物種多樣性上較擴增循環(huán)數為20時的物種多樣性更高。如果要最大程度地反映樣品的真實性，可以選擇宏基因組測序技術［15，20-21］，即直接對環(huán)境樣品中的DNA進行打斷和測序，不需要進行PCR擴增。這樣在進行數據分析時，可以通過拼接 16S rDNA的全長基因實現微生物的種類鑒定。

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（本文責編 陳宏宇）

Influence of PCR cycle number on microbial diversity analysis through next generation sequencing

Yunhe An1,2, Lijuan Gao1,2, Junbo Li1,2, Yanjie Tian1,2, Jinlong Wang1,2, Xuejuan Zheng1,2, and Huijuan Wu1,2

1 Beijing Center For Physical and Chemical Analysis， Beijing 100089， China
2 Beijing Engineering Technique Research Center for Gene Sequencing & Function Analysis， Beijing 100094， China

Using of high throughput sequencing technology to study the microbial diversity in complex samples has become one of the hottest issues in the field of microbial diversity research. In this study， the soil and sheep rumen chymesamples were used to extract DNA， respectively. Then the 25 ng total DNA was used to amplify the 16S rRNA V3 region w ith 20， 25， 30 PCR cycles， and the final sequencing library was constructed by m ixing equal amounts of purified PCR products. Finally， the operational taxonom ic unit （OUT） amount， rarefaction curve， m icrobial number and species were compared through data analysis. It was found that at the same amount of DNA template， the proportion of the community composition was not the best w ith more numbers of PCR cycle， although the species number was much more. In all， when the PCR cycle number is 25， the number of species and proportion of the community composition were the most optimal both in soil or chyme samples.

October 23， 2015； Accepted: January 6， 2016

Huijuan Wu. Tel: +86-10-58711817； Fax: +86-10-58717638； E-mail: sunnywhj@126.com

PCR cycle number， high throughput sequencing， m icrobial diversity analysis

Supported by: Beijing Academy of Science and Technology 2015 Youth Backbone Project （No. 201522）.

北京市科學技術研究院2015年青年骨干項目 （No. 201522） 資助。

網絡出版時間：2016-03-17 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160317.1018.001.html