林美珍，蔣梅琴，李水琴，林妍，黃義德

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室，福建 福州 350108

生物技術(shù)與方法

人牙本質(zhì)涎磷蛋白啟動子驅(qū)動LacZ報告基因在人牙胚間充質(zhì)細胞中表達

林美珍，蔣梅琴，李水琴，林妍，黃義德

福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室，福建 福州 350108

林美珍， 蔣梅琴， 李水琴， 等. 人牙本質(zhì)涎磷蛋白啟動子驅(qū)動 LacZ報告基因在人牙胚間充質(zhì)細胞中表達. 生物工程學(xué)報， 2016， 32（8）: 1133-1144.

Lin MZ， Jiang MQ， Li SQ， et al. Expression of the reporter LacZ driven by human dentin sialophosphoprotein promoter in human dental mesenchymal cells. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1133-1144.

牙本質(zhì)涎磷蛋白 （DSPP） 的表達是細胞向成牙本質(zhì)細胞分化的標志。試圖分析人 DSPP啟動子及構(gòu)建人DSPP啟動子驅(qū)動的LacZ基因表達的報告體系，從而方便快捷檢測細胞是否向成牙本質(zhì)細胞分化。為了建立能表達DSPP的細胞體系，分離了人牙胚間充質(zhì)細胞，并用地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，該誘導(dǎo)培養(yǎng)液能有效地誘導(dǎo)人牙胚間充質(zhì)細胞DSPP基因的表達。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對4段人DSPP基因5′上游區(qū)域 （-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54） 進行分析，結(jié)果顯示-2 500-+54區(qū)域的啟動子活性最高。5′上游區(qū)從-2 500 bp延長到-4 000 bp時，啟動子活性下降；5′上游區(qū)從-2 500 bp縮短至-1 447 bp時，啟動子活性下降；再次將-1 447 bp縮短至-1 027 bp時，啟動子活性進一步下降。結(jié)果暗示在-4 000 bp至-2 500 bp區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄抑制元件，-2 500 bp至-1 027 bp區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄激活元件。用-2 500-+54啟動子區(qū)域和LacZ基因構(gòu)建phDSPP-LacZ慢病毒報告載體，并分別在人牙胚間充質(zhì)細胞和永生化人牙胚間充質(zhì)細胞系ihEDMC4上檢測phDSPP-LacZ報告載體的功能，通過X-Gal染色，結(jié)果顯示在2種細胞牙向分化過程中均可檢測到LacZ基因的表達。研究構(gòu)建的phDSPP-LacZ慢病毒報告載體可為誘導(dǎo)人源細胞牙向分化、牙齒發(fā)育、牙齒再生工程等研究中DSPP的表達檢測提供一種更加便捷的手段。

牙本質(zhì)涎磷蛋白，啟動子，人牙胚間充質(zhì)細胞，LacZ基因

牙本質(zhì)中的大部分非膠原蛋白和膠原纖維是由成牙本質(zhì)細胞分泌，在牙本質(zhì)基質(zhì)中，非膠原蛋白可占牙有機成分的 90%，它們提供礦化模板，控制晶體形核和生長［1-2］。非膠原蛋白主要包括牙本質(zhì)磷蛋白 （Dentin phosphoprotein DPP）、牙本質(zhì)涎蛋白 （Dentin sialoprotien DSP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 （DMP1）、骨鈣素 （OC）、骨橋素 （OPN） 等，其中DSP和DPP是牙本質(zhì)胞外基質(zhì) （Extracellular matrix） 的主要成分蛋白，由牙本質(zhì)涎磷蛋白 （Dentin sialophosphoprotein DSPP） 割裂加工產(chǎn)生［3-5］。DSPP起先認為只特異表達于成牙本質(zhì)細胞，后來研究發(fā)現(xiàn) DSPP也表達于骨［6-7］、牙骨質(zhì)［8-9］和某些非礦化的組織中［10］。

在細胞牙向分化的研究中，目前未找到只唯一表達在成牙本質(zhì)細胞中的特異基因，因此，依然將 DSPP基因表達作為細胞牙向分化的重要標志之一。目前所用檢測DSPP表達的方法主要有 RT-PCR或 Real-time PCR、免疫組化和Western印跡，這些方法操作耗時費力。如能構(gòu)建一個以人 DSPP啟動子驅(qū)動的 LacZ報告體系，將可以快速方便地檢測在人源細胞牙向分化研究中DSPP的表達情況。雖然在小鼠中找到了活性較強的 DSPP啟動子成分［3］，但人類DSPP啟動子的結(jié)構(gòu)尚未見報道。為了構(gòu)建人DSPP啟動子驅(qū)動的LacZ報告體系，我們應(yīng)用熒光素酶報告系統(tǒng)對不同長度的人 DSPP基因上游序列進行分析，尋找啟動子活性最高的序列。利用活性最高的DSPP -2 500-+54區(qū)的啟動子序列構(gòu)建LacZ表達載體，并在人牙胚間充質(zhì)細胞和永生化人牙胚間充質(zhì)細胞系 ihEDMC4［11］體外誘導(dǎo)牙向分化過程中檢測LacZ的表達。

1　材料與方法

1.1道德倫理申明

本研究所使用的人源性樣本取自福建省福州市東南女子醫(yī)院患者自愿藥物流產(chǎn)的胎兒并得到患者的知情同意。本研究得到福建師范大學(xué)動物倫理委員會的許可并且嚴格遵守其相關(guān)規(guī)定。

1.2材料

載體pEGFP-N1、pNL-IRES-EGFP、pAd/CMV/ V5-GW/LacZ及三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)中的質(zhì)粒pVSVG、pHelper、293T細胞和人牙胚間充質(zhì)永生化細胞系ihEDMC4［11］由本實驗室保存；雙熒光酶報告載體pGL3-Basic和CMV-Renilla購自Promega公司；克隆中所用到的限制性內(nèi)切酶和修飾酶均購自大連TaKaRa公司；熒光酶檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System和轉(zhuǎn)染試劑TransFast? Transfection Reagent購自Promega公司；地塞米松和β-甘油磷酸酯鈉購自Sigma公司；L-抗壞血酸磷酸酯購自日本W(wǎng)ako公司；α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清購自Hyclone公司；引物由生工生物工程 （上海） 公司合成。

1.3人牙胚間充質(zhì)細胞分離培養(yǎng)及 DSPP基因誘導(dǎo)表達

人19周下磨牙牙胚用DispaseⅡ （2 U/m L）消化，使牙間充質(zhì)與牙上皮互相分離。然后向牙間充質(zhì)組織中加入適量的 CD酶 （3 mg/m LⅠ型膠原酶和4 mg/m L DispaseⅡ），37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行消化30 m in左右，期間每隔10 m in左右吹打消化的組織。消化下來細胞在含10%胎牛血清 （FBS） 的α-MEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng) 10 d，中間不換細胞培養(yǎng)液。10 d后換半液再繼續(xù)培養(yǎng)4 d，之后換成新鮮培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。待細胞的匯合度達 90%左右時對細胞進行傳代。傳至第 3代細胞用于實驗。在誘導(dǎo)牙間充質(zhì)細胞表達DSPP實驗中，當牙間充質(zhì)細胞傳代24 h后，更換成地塞米松a-MEM （10% FBS） 誘導(dǎo)培養(yǎng)液 （100 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸酯鈉，50 μg/m L L-抗壞血酸磷酸酯） 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，期間每隔 2 d換一次液。通過 Real-time PCR檢測DSPP表達情況，擴增上游引物：5′-GCCATTC CAGTTCCTCAAAGC-3′，下游引物：5′-CATGC ACCAGGACACCACTT-3′。

1.4pGL3-DSPP-Luc載體的構(gòu)建

從人基因組DNA中克隆出4段DSPP啟動子擬區(qū)域序列，序列位置分別為：-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54，擴增引物見表1。-1 447-+54和-1 027-+54片段通過SalⅠ位點克隆到含有螢火蟲熒光素酶基因的pGL3-Basic載體上，重組載體分別命名為pGL3-DSPP （-1 447-+54）-Luc 和pGL3-DSPP （-1 027-+54）-Luc。-4 000-+54和-2 500-+54片段通過 KpnⅠ和SacⅠ位點克隆到pGL3-Basic載體上，重組載體分別命名為 pGL3-DSPP （-4 000-+54）-Luc和pGL3-DSPP （-2 500-+54）-Luc。

表1　PCR擴增所用的引物Tab le 1 Primers for PCR am p lification

1.5DSPP啟動子活性檢測

采用雙報告熒光素酶檢測 DSPP各區(qū)段的啟動子活性。按Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega公司） 試劑盒操作說明進行，簡要如下：在15 m L離心管中用2 m L無血清α-MEM培養(yǎng)液分別將2.5 μg pGL3-hDSPP （-4 000-+54）-Luc、pGL3-hDSPP （-2 500-+54）-Luc、pGL3-hDSPP （-1 447-+54）-Luc和pGL3-hDSPP （-1 027-+54）-Luc重組質(zhì)粒和2.5 μg CMV-Renilla質(zhì)粒混勻。加入15 μL TransFast? Transfection Reagent （Promega公司），混勻后室溫靜置15 m in。吸棄地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后的人牙胚間充質(zhì)細胞培養(yǎng)液，并加入上述質(zhì)粒 DNA/TransFast?Transfection Reagent混合液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育結(jié)束后，向6 cm培養(yǎng)皿加入4 m L含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集并裂解細胞。細胞裂解液用GloMax?-Multi JR檢測儀 （Promega公司） 分別檢測DSPP啟動子活性。

1.6phDSPP-LacZ慢病毒載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建phDSPP-LacZ慢病毒載體，首先以pAd/CMV/V5-GW/LacZ載體為模板，設(shè)計LacZ上下游引物 （表1），通過PCR擴增得到LacZ基因，LacZ基因的5′和3′端通過引物引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位點。用酶 SmaⅠ和 NotⅠ雙酶切去除pEGFP-N1質(zhì)粒上EGFP序列，回收pEGFP-N1骨架并與用酶SmaⅠ和NotⅠ雙酶切LacZ片段連接，將LacZ基因克隆到pEGFP-N1質(zhì)粒EGFP位置上。以pGL3-hDSPP （-2 500-+54）-Luc質(zhì)粒為模板，擴增-2 500-+54的h DSPP啟動子序列，并在5′和 3′端分別引入 SalⅠ和 KpnⅠ酶切位點。用SalⅠ和KpnⅠ雙酶切上述構(gòu)建的含有LacZ基因的pEGFP-N1重組質(zhì)粒，并與SalⅠ和KpnⅠ雙酶切的h DSPP （-2 500-+54） 片段連接。通過設(shè)計h DSPP （-2 500-+54） 上游引物和SV40終止子下游引物 （表1），PCR擴增含有h DSPP （-2 500-+54）、LacZ基因和 SV40終止子序列片段，并在片段的上下游引入XbaⅠ酶切位點。用XbaⅠ分別酶切上述片段和慢病毒載體pNL-IRES-EGFP，并將它們連接構(gòu)建phDSPP-LacZ重組載體。

1.7phDSPP-LacZ慢病毒生產(chǎn)

phDSPP-LacZ慢病毒的生產(chǎn)按文獻［12］進行，方法簡要如下：用含10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 293T細胞，待細胞豐度達到75%-85%時，采用磷酸鈣法將 15 μg phDSPPLacZ、6 μg pVSVG和7 μg pHelper三個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到293T細胞中。12 h后終止轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染的細胞表達綠色熒光蛋白情況。終止轉(zhuǎn)染24 h后，收集含有病毒的培養(yǎng)液，并更換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔12-18 h收集1次病毒上清液，并添加新鮮培養(yǎng)液，直至293T細胞死亡。收集的病毒上清液用Am icon U ltra-15 Centrifugal Filter Units超濾管 （M illipore） 進行濃縮。病毒濃縮液進行滴度測定，分裝，-80 ℃保存。

1.8LacZ表達檢測

人牙胚間充質(zhì)細胞和永生化人牙胚間充質(zhì)細胞 ihEDMC4分別轉(zhuǎn)染 phDSPP-LacZ和pNL-IRES-EGFP空載慢病毒，36 h后吸去培養(yǎng)液終止感染，并用地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d。用PBS對細胞洗滌2次。用0.5%戊二醛于室溫中固定細胞10 m in，細胞固定后用含1 mmol/L MgCl2的PBS緩沖液洗滌3次。用含X-Gal的染色液 （于PBS中配制1 mg/m L X-Gal，5 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O，5 mmol/L K3Fe（CN）6和2 mmol/L MgCl2）對細胞進行染色。

2　結(jié)果與分析

2.1人牙胚間充質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)

用Dispase II酶對人牙胚組織進行消化分離牙間充質(zhì)組織和牙上皮組織。人牙胚間充質(zhì)組織用 CD酶進行消化，消化后的單細胞進行培養(yǎng)。圖 1是人牙胚間充質(zhì)細胞培養(yǎng)不同時間的形態(tài)圖，從圖中可以看出，人牙胚間充質(zhì)細胞形態(tài)呈長梭形。對分離的人牙胚間充質(zhì)細胞進行連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)其可連續(xù)生長到P28代左右，表明人牙胚間充質(zhì)細胞具有很強的增殖能力。

2.2體外誘導(dǎo)人牙胚間充質(zhì)細胞DSPP表達

用地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液對 P3代人牙胚間充質(zhì)細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 d后，用Real-time PCR檢測細胞DSPP基因表達情況。結(jié)果顯示地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液能有效地誘導(dǎo)人牙胚間充質(zhì)細胞DSPP的表達，與未誘導(dǎo)組相比，誘導(dǎo)組DSPP表達量大約上升了63倍左右 （圖2）。

圖1　分離培養(yǎng)的人牙胚間充質(zhì)細胞形態(tài)Fig. 1 Morphology of isolated human embryonic dental mesenchymal cells in culture. Primary cells were isolated from human molar and cultured in α-MEM medium w ith 10% FBS. The morphology of the cells at days 1， 3， 10 and 20 were presented. Scale bars represent 100 μm.

圖 2 地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)人牙胚間充質(zhì)細胞DSPP表達Fig. 2 Induction of DSPP by dexamethasone in primary embryonic dental mesenchymal cells. Human embryonic dental mesenchymal cells at P3 were cultured in media w ith or w ithout dexamethasone for 14 d before RNA extraction. The DSPP mRNA expression were detected using real-time PCR.

2.3人DSPP近端啟動子分析

對人DSPP轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 553 bp堿基序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果如圖3所示。人DSPP啟動子沒有CG島。在近轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域 （-89到-75 bp和-29到-15 bp） 有 2個TBP （TATA框結(jié)合蛋白） 結(jié)合位點，其中-89到-75 bp處有1個TATA框。除靠近轉(zhuǎn)錄起始位點處有2個TBP結(jié)合位點和1個TATA框外，序列中還存在另外 7個 TBP結(jié)合位點和 6個TATA框，并且6個TATA框都在TBP結(jié)合位點中。在分析的區(qū)域中存在1個CAAT框、1個GC框、4個Runx2位點、9個Msx1位點、4個TCF-1位點、2個NF-Y位點、7個GATA-1位點、3個C/EBP β位點和2個SP1位點 （圖3）。

2.4DSPP啟動子活性檢測

從人基因組中PCR擴增出4段DSPP擬啟動子區(qū)域，區(qū)域包括DSPP基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游序列和部分下游序列 （-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54）。將4段DSPP擬啟動子區(qū)域分別插入pGL3-Basic質(zhì)粒熒光素酶基因的上游，以驅(qū)動熒光素酶的表達（圖4A）。重組載體pGL3-hDSPP （-4 000-+54）-Luc、pGL3-hDSPP （-2 500-+54）-Luc、pGL3-hDSPP （-1 447-+54） -Luc 和 pGL3-hDSPP （-1 027-+54）-Luc以及載體pGL3-Basic分別轉(zhuǎn)染經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的人牙胚間充質(zhì)細胞。48 h后對細胞裂解液進行熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示，在 4個檢測的DSPP擬啟動子區(qū)域中，-2 500- +54區(qū)域活性最強（圖4B）。

2.5phDSPP-LacZ報告載體的構(gòu)建及其功能

為了方便分析細胞在牙向分化過程中DSPP的表達情況，我們利用h DSPP啟動子活性最高的區(qū)域 （-2 500-+54） 來驅(qū)動LacZ基因的表達。-2 500-+54 h DSPP啟動子和LacZ基因序列一起克隆到pNL-IRES-EGFP慢病毒載體上，構(gòu)建成phDSPP-LacZ報告載體 （圖5A）。利用293T細胞成功生產(chǎn)出phDSPP-LacZ 病毒 （圖5B），超濾管濃縮后病毒滴度約為5.8×106TU/m L。

phDSPP-LacZ報告載體是利用LacZ作為報告基因，一旦細胞表達DSPP，DSPP啟動子即可啟動LacZ基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶通過作用底物X-Gal，可生成不溶性藍色產(chǎn)物并沉積在細胞周圍。因此通過 X-Gal染色就可方便地判斷細胞或組織中 DSPP表達情況。感染phDSPP-LacZ病毒的人牙胚間充質(zhì)細胞和人牙胚間充質(zhì)永生化細胞系ihEDMC4經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，X-Gal染色可以檢測到LacZ基因的表達 （圖6）。

圖3　人DSPP近端啟動子區(qū)域分析Fig. 3 Analysis of human DSPP proximal promoter region. The DNA sequence of the 2.5 kb 5′ flanking region and parts of downstream sequence of the human DSPP gene are shown. Nucleotides are numbered on the left. +1 corresponding to the transcription start of the promoter. The potential response element of Runx2， Msx1， TCF-1， NF-Y， GATA-1， C/EBP β and SP1 are underlined and labeled. TATA box， CAAT box and GC box sequences are shown w ith the box.

圖5　phDSPP-LacZ報告載體的示意圖及包裝慢病毒Fig. 5 Construction of phDSPP-LacZ vector for lentivirus production. （A） Diagram of phDSPP-LacZ vector. （B）HEK293T cells were co-transfected w ith phDSPP- LacZ， pVSVG and pHelper using calcium phosphate method and left to grow for 12 h before the culture media was replaced w ith fresh media. The expression of GFP protein were detected using fluorescent m icroscope 24 h post transfection. Scale bars represent 10 μm.

圖4　DSPP啟動子活性檢測Fig. 4 Analysis of h DSPP promoter activity. （A） Diagram of pGL3- hDSPP- Luc vectors containing four different regions of hDSPP promoter upstream of the luciferase gene. （B） The four reporter vectors and pGL3-Basic were respectively transfected into the induced human embryonic dental mesenchymal cells by dexamethasone. The expression of luciferase in each group was then exam ined using GloMax?-Multi JR 48 h post transfection.

圖6　體外檢測phDSPP-LacZ載體功能Fig. 6 Exam ination of phDSPP-LacZ reporter function in vitro. （A） Human embryonic dental mesenchymal cells （hEDMCs） at P3 and immortalized human embryonic dental mesenchymal cell line ihEDMC4 at P78 were both transduced w ith phDSPP-LacZ or pNL-IRES-EGFP and left to grow for 36 h before the culture media was replaced w ith fresh media containing dexamethasone. To observe transduction efficiency， the GFP expression was exam ined using inverted fluorescence m icroscope. （B） A fter 7 d induction by dexamethasone， the cells from （A） were fixed and stained w ith X-gal. Scale bars represent 10 μm.

3　討論

在牙齒發(fā)育的過程中，靠近內(nèi)釉上皮細胞的牙乳頭細胞被誘導(dǎo)形成成牙本質(zhì)細胞，成牙本質(zhì)細胞表達分泌各種牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白，礦化后形成牙本質(zhì)［13-14］。在牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白中，來源于DSPP的DSP和DPP蛋白是其主要成分蛋白。因此，DSPP被作為是細胞牙向分化的最重要標志蛋白之一。在許多研究中，如利用干細胞進行的牙再生研究、牙齒的發(fā)育研究等經(jīng)常要檢測 DSPP基因的表達情況。而目前還沒有一種方便快捷的方法用于檢測對人類細胞牙向分化過程中DSPP的表達。

在大鼠DSPP表達研究中，Ritchie等將LacZ基因連接于大鼠 DSPP啟動子后，通過 X-Gal染色，可以方便地做到在原位檢測哪些細胞表達DSPP［15］，相似的方法也可以用于人類細胞牙向分化過程中DSPP的檢測。為了建立這種檢測手段，首先必須對人類DSPP啟動子進行分析。DSPP啟動子并非組成型的啟動子，不是在所有牙源性的細胞中都有表達，只有在細胞牙向分化過程中形成牙本質(zhì)細胞才會得以表達。研究發(fā)現(xiàn)，牙源性的干細胞通過適當?shù)恼T導(dǎo)可以向成牙本質(zhì)細胞分化［16-19］。研究人員用含有地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸按照一定比例添加到培養(yǎng)液中配成誘導(dǎo)培養(yǎng)液，可以促進人牙髓干細胞和永生化的牙乳頭細胞向成牙本質(zhì)樣細胞分化，表達 DSPP蛋白［20-22］。我們也采取這種方法對分離的人牙胚間充質(zhì)細胞進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液也可以有效地誘導(dǎo)人牙胚間充質(zhì)細胞DSPP基因的表達。

建立可表達DSPP細胞體系后，我們克隆了4段包括轉(zhuǎn)錄起始位點不同長度的上游和部分下游序列：-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54 和-1 027-+54。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，分別檢測這4段序列的啟動子活性，發(fā)現(xiàn)克隆的4段DSPP啟動子序列中-2 500-+54活性相對最高，其次是-1 447-+54，而-1 027-+54和-4 000-+54相對比較低。將人DSPP基因5′上游區(qū)域從-2 500 bp延長至-4 000 bp時，啟動子活性出現(xiàn)明顯的下降，表明在-4 000 bp到-2 500 bp區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄抑制元件。啟動子區(qū)域從-2 500 bp縮短至-1 447 bp時和從-1 447 bp縮短至-1 027 bp時，啟動子活性都出現(xiàn)下降，表明這2個區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄激活元件。對人DSPP近端的啟動子分析表明在-2 500至-1 447間存在1個NF-Y位點、4個M xs1位點以及1個CAAT框和1個GC框。在-1 447 bp至-1 027 bp間存在2個Runx2位點和4個M sx1位點。在-1027至轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)間也存在著2個Runx2位點。NF-Y，也稱為CBF或CP1，是CCAAT結(jié)合因子，在許多真核生物的啟動子上有結(jié)合位點，與啟動子結(jié)合后可以激活基因的轉(zhuǎn)錄。在小鼠的DSPP表達研究中發(fā)現(xiàn)，CCAAT結(jié)合因子位點突變后，其啟動子活性出現(xiàn) 5倍的下降，表達CCAAT結(jié)合因子可以激活DSPP的表達［23］。Bmp2上調(diào)DSPP的表達也是通過誘導(dǎo)NF-Y在核中聚集，從而刺激DSPP表達［24］。M sx1是牙齒發(fā)育最重要的調(diào)節(jié)蛋白之一，M sx1敲除小鼠牙齒發(fā)育失敗［25］。Runx2對于成骨細胞和成牙本質(zhì)細胞分化很重要，在成牙本質(zhì)細胞系MO6-G3研究中發(fā)現(xiàn)Runx2可抑制DSPP的表達［26］。人DSPP啟動子從-1 447延伸到-2 500 bp時，啟動子活性增加，可能與其在這個區(qū)間存在正調(diào)控因子NF-Y、M xs1和調(diào)節(jié)序列CAAT框和 GC框相關(guān)。而-1 447到+54，以及再從-1 447 bp截短到-1 027 bp，啟動子活性都出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，可能 Runx2參與了對 DSPP表達的抑制。在人 DSPP啟動子上，這些因子具體結(jié)合到哪個位置并如何調(diào)控其表達還有待于進一步的研究。有趣的是，在對人 DSPP啟動子分析時發(fā)現(xiàn)，除轉(zhuǎn)錄起始位點附近處有TATA框和 TBP結(jié)合位點外，在更上游的地方還分布著多個 TATA框和 TBP結(jié)合位點，人DSPP基因具體由哪一個TATA框起始轉(zhuǎn)錄或者是否存在多個轉(zhuǎn)錄起始位點目前還是未知。

LacZ基因是生物學(xué)研究中常用的報告基因之一［27-28］。LacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶通過分解無色的底物 X-Gal產(chǎn)生不溶性藍色產(chǎn)物，可以觀察表達 β-半乳糖苷酶的細胞，其作為報告蛋白最大的優(yōu)點是易于在組織水平上觀測原位表達，并且不受組織特別是鈣化組織自發(fā)熒光的影響。為了使構(gòu)建的報告體系除了可用于培養(yǎng)的細胞檢測外，還可方便用于重組的組織塊或是器官發(fā)育過程中DSPP的檢測，我們選擇LacZ基因作為研究的報告基因。研究中將活性最高的 DSPP啟動子區(qū)域（-2 500-+54）克隆到LacZ基因上游，構(gòu)建phDSPP-LacZ慢病毒報告載體。將該載體感染人牙胚間充質(zhì)細胞和永生化人牙胚間充質(zhì)細胞系ihEDMC4，細胞經(jīng)牙向分化誘導(dǎo)后，均能檢測到LacZ基因表達。表明我們構(gòu)建的phDSPP-LacZ慢病毒載體可為誘導(dǎo)人源細胞牙向分化、牙齒發(fā)育和牙齒再生工程等研究中 DSPP的表達檢測提供一種更加便捷的手段。

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（本文責(zé)編 郝麗芳）

November 18， 2015； Accepted: March 24， 2016

Yide Huang. Tel/Fax: +86-591-22860592； E-mail: ydhuang@fjnu.edu.cn

Expression of the reporter LacZ driven by human dentin sialophosphoprotein promoter in human dental mesenchymal cells

M eizhen Lin, M eiqin Jiang, Shuiqin Li, Yan Lin, and Yide Huang

Fujian Key Laboratory of Developmental and Neural Biology， College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou 350108，F(xiàn)ujian， China

The expression of dentin sialophosphoprotein （DSPP） is the marker for cells differentiated into odontoblasts. This study attempted to analyze the DSPP promoter and build the reporter LacZ expression system driven by this promoter，which allow s convenient and quick detection of odontoblast cells. First， we separated the human dental mesenchymal cells in which the expression of DSPP can be effectively induced by dexamethasone. Second， four 5′ flanking regions of human DSPP gene （- 4 000-+54， -2 500-+54， -1 447-+54 and -1 027-+54） were analyzed， the results showed that the highest promoter activity lied in the -2 500-+54 region. The promoter activity is reduced when the 5′ flanking region was extended from -2 500 to -4 000 bp upstream from the transcription start site； The promoter activity are also decreased when the 5′flanking regions were shorted from -2 500 to -1 447 bp and from -1 447 to -1 027 bp， indicating that potential suppresser elements are lied in the region between -4 000 and -2 500 bp and potential activator elements are lied in the region between -2 500 and -1 027 bp. Then we constructed the lentiviral report vector phDSPP-LacZ containing the -2 500-+ 54 promoter region in front of the LacZ gene. The expression of LacZ was detected using X-Gal staining in both human dental mesenchymal cells and immortalized human dental mesenchymal cells infected w ith phDSPP-LacZ. The phDSPP-LacZ lentiviral vector may provide a more convenient method to detect the expression of DSPP in human odontogenic differentiation， tooth development and tooth regeneration studies.

dentin sialophosphoprotein （DSPP）， promoter， human dental mesenchymal cells， LacZ gene

Supported by: Foundation of Fujian Educational Committee （No. JA12061）.

福建省教育廳重點項目 （No. JA12061） 資助。