任海月，董彬，樊振川，2，3，孟德梅，2，3

1 天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3004572 天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全和藥物化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，天津 3004573 天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457

生物技術(shù)與方法

萊茵衣藻纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT46的原核表達(dá)純化及其多克隆抗體的制備

任海月1，董彬1，樊振川1，2，3，孟德梅1，2，3

1 天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457
2 天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全和藥物化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，天津 300457
3 天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457

任海月， 董彬， 樊振川， 等. 萊茵衣藻纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?IFT46的原核表達(dá)純化及其多克隆抗體的制備. 生物工程學(xué)報(bào)，2016， 32（8）: 1124-1132.

Ren HY， Dong B， Fan ZC. Prokaryotic expression and purification of Chlamydomonas reinhardtii intraflagellar transport protein 46 （IFT46） and preparation of polyclonal antibody. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1124-1132.

IFT46是纖毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍譏FT復(fù)合物B （IFT-B） 的一個(gè)重要組分，對(duì)于纖毛的組裝、運(yùn)動(dòng)和感知發(fā)揮著重要作用。為深入研究IFT46的作用機(jī)制，利用ift46基因全序列分別構(gòu)建了帶有GST和MBP標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 （DE3） 誘導(dǎo)表達(dá)，以15% SDS-PAGE鑒定，分別獲得了分子量為70、86 kDa的重組GST/MBP-IFT46融合蛋白。將親和純化的GST-IFT46融合蛋白 （純度95%以上） 免疫新西蘭大白兔，采集第5次免疫后血清用ELISA測(cè)定效價(jià)為1∶256 000。抗血清依次經(jīng)Protein A和固定在MBP-IFT46純化后，用Western blotting 和免疫熒光檢測(cè)抗體特異性，結(jié)果表明制備的多克隆抗體能很好地識(shí)別萊茵衣藻中的IFT46，而且發(fā)現(xiàn)IFT46絕大部分定位在纖毛基體，極少部分沿纖毛呈點(diǎn)狀分布，為繼續(xù)開(kāi)展 IFT46在肥胖癥、糖尿病、多囊腎病等纖毛相關(guān)疾病中作用機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

萊茵衣藻，纖毛，IFT46，原核表達(dá)，蛋白純化，多克隆抗體

萊茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii是一種單細(xì)胞真核藻類，其細(xì)胞一側(cè)兩條等長(zhǎng)的纖毛賦予了其游動(dòng)的能力［1-2］。纖毛是一種細(xì)胞表面突起的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要組成部分為細(xì)胞微管，是一種從原生生物到脊椎動(dòng)物都存在的保守細(xì)胞器［3］。纖毛不僅在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用［4-5］，而且在信號(hào)傳導(dǎo)方面也起著重要作用，如脊椎動(dòng)物的視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)和嗅覺(jué)都依賴于纖毛的調(diào)控［6-7］。多項(xiàng)研究報(bào)道，纖毛的結(jié)構(gòu)或功能障礙會(huì)導(dǎo)致許多疾?。?-9］，如多囊腎病、視網(wǎng)膜變性、腦積水和不孕等。然而，纖毛的組裝與功能的發(fā)揮依賴于纖毛內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制。

纖毛內(nèi)運(yùn)輸 （Intraflagellar transport，IFT）是發(fā)生在纖毛膜和纖毛軸絲之間，從纖毛基部到頂部的一種蛋白質(zhì)復(fù)合體雙向運(yùn)輸過(guò)程［10-11］，主要由 IFT顆粒、順行的馬達(dá)蛋白和逆行的馬達(dá)蛋白［12］3個(gè)部分完成。其中，IFT顆粒由IFT-A 和IFT-B兩個(gè)蛋白復(fù)合物組成［13］。研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，IFT-A和IFT-B蛋白組分突變均可引發(fā)纖毛相關(guān)疾病，如 Bardet-Biedl綜合癥、Joubert綜合癥等［16］。IFT46是IFT-B的一個(gè)重要組分，在有纖毛的生物中是高度保守的，也是纖毛組裝所必需的成分。多項(xiàng)研究報(bào)道，IFT46不僅在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［17］，而且無(wú)脊椎動(dòng)物中ift46基因的突變或缺失也會(huì)導(dǎo)致纖毛組裝缺陷［18-19］。因此，利用萊茵衣藻這種模式生物來(lái)研究ift46在纖毛組裝中的作用機(jī)制，將對(duì)于其他生物中纖毛組裝機(jī)制的闡明奠定重要理論基礎(chǔ)。

制備高特異性和靈敏性的萊茵衣藻 IFT46抗體，是順利完成 IFT46在纖毛組裝中發(fā)揮功能和發(fā)揮部位的確定及作用機(jī)制闡明的重要前提。因此，本實(shí)驗(yàn)室采用簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的原核表達(dá)方法制備了高特異性的 IFT46抗體，并運(yùn)用多種方法對(duì)抗體純化以提高抗體特異性。此外，利用 Western blotting、免疫熒光等方法檢測(cè)了抗體的特異性，從而為全面鑒定 IFT46在纖毛裝配中的作用機(jī)制，并為最終理解纖毛病的致病機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli XL1-blue、BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞和 pGAD-ift46質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA分子量Marker和蛋白Marker等均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Glutathione SepharoseTM4B和Dextrin SepharoseTMHigh Performance蛋白純化介質(zhì)以及Protein A SepharoseTMCL-4B抗體純化介質(zhì)均購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare 公司；NC膜購(gòu)自北京索來(lái)寶公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體及熒光標(biāo)記 （A lexa Fluor 488） 的羊抗兔抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；AP標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔2只，體重1.5-2.0 kg，由天津歐陽(yáng)實(shí)驗(yàn)種兔場(chǎng)提供。

1.2方法

1.2.1pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以 pGAD-ift46質(zhì)粒為模板，用上游引物5′-AT GGATCC ATGGATGACTCTATGG-3′ （斜體部分為 Bam HⅠ限制性酶切位點(diǎn)）、下游引物5′-CT AAGCTT TCACAAGCCCAGCACA-3′ （斜體部分為 Hin d Ⅲ限制性酶切位點(diǎn)） 進(jìn)行 ift46基因擴(kuò)增。然后再用Bam HⅠ和Hin d Ⅲ將回收的目的基因、pGEX-2T和pMAL-C2X載體進(jìn)行雙酶切，然后將目的基因分別與兩個(gè)載體用 T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化入E. coli XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2GST-IFT46融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將正確的重組質(zhì)粒pGEX-2T-ift46轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 （DE3），挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中 （含120 μg/m L氨芐青霉素） 過(guò)夜培養(yǎng)，再以1∶20的比例放大培養(yǎng)至OD為0.6-0.8，加入0.2 mmol/L IPTG，28 ℃下誘導(dǎo)6 h使蛋白大量表達(dá)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組即不加 IPTG誘導(dǎo)組。離心收集菌體并超聲裂解獲得全蛋白，全蛋白經(jīng)4 ℃離心 （12 000 r/m in，15 m in） 收集上清和沉淀。取全蛋白、上清和沉淀分別與 2×蛋白上樣緩沖液混合后進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.3GST-IFT46融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲波破碎后，離心 （4 ℃、12 000 r/m in 15 m in），取上清用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后加入到預(yù)先平衡好的Glutathione SepharoseTM 4B純化柱中，37 ℃結(jié)合 1 h后使樣品流經(jīng)純化柱，用洗滌緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L M gCl2，pH 7.4） 洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L還原型谷胱甘肽，pH 7.4） 洗脫并收集目的蛋白。將洗脫出的目的蛋白進(jìn)行15%的SDS-PAGE分析。

1.2.4多克隆抗體的制備

取 2 mg純化后的 GST-IFT46融合蛋白與2 m L弗氏佐劑混合后乳化完全，免疫新西蘭大白兔，采用頸背部多點(diǎn)注射法，初次免疫使用弗氏完全佐劑且免疫前耳動(dòng)脈采血［20］作為陰性對(duì)照血清。后每10天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用弗氏不完全佐劑，一共加強(qiáng)免疫 4次，最后一次加強(qiáng)免疫后耳動(dòng)脈采血，利用間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，效價(jià)合格后，股動(dòng)脈采血，4 ℃靜置過(guò)夜后收集血清，分裝凍存。

1.2.5多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，以MBP-IFT46融合蛋白作為包被抗原，用5%的脫脂乳粉封閉后，以所得的抗血清為一抗，辣根過(guò)氧化物酶 （HPR） 標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，然后經(jīng)過(guò)TMB （3′，3′，5′，5′-四甲基聯(lián)苯胺）顯色，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450處的吸光值，并計(jì)算出抗血清的效價(jià)，實(shí)驗(yàn)組血清 OD450/陰性對(duì)照血清 OD450≥2.0為陽(yáng)性，其最高稀釋度即為抗血清的效價(jià)。

1.2.6多克隆抗體的純化

分離完的抗血清首先使用Protein A SepharoseTMCL-4B親和純化專一性吸附IgG，去除 IgG之外的其他抗體分子，純化條件為：結(jié)合緩沖液C （12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液C （0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7），流速0.5 m L/m in。收集吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，用1 mol/L Tris-HCl （pH 9.0） 將洗脫液 pH 值調(diào)至中性。然后將 Protein A SepharoseTM純化完的抗體采用MBP-IFT46免疫親和純化法進(jìn)一步純化［21］：首先將MBP-IFT46融合蛋白固定到瓊脂糖凝膠樹(shù)脂上，使其專一性吸附IFT46的抗體，隨后再將抗體洗脫下來(lái)，Western blotting檢測(cè)顯示還會(huì)有一些非特異性吸附的抗體，因此本實(shí)驗(yàn)又采用了將MBP-IFT46融合蛋白固定在硝酸纖維素膜親和純化法［22］進(jìn)一步純化，經(jīng)Western blotting檢測(cè)多克隆抗體的特異性。

1.2.7免疫印跡及免疫熒光法檢測(cè)多克隆抗體的特異性

免疫印跡：取6 μL處理后的萊茵衣藻上清［23］，加入1.5 μL 5×上樣緩沖液混勻，進(jìn)行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)印后，衣藻蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉；多克隆抗體稀釋度1∶1 000，二抗分別為堿性磷酸酶 （AP） 和辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋度為1∶5 000，然后加入顯色液使底物顯色 （即AP法） 或曝光壓片顯影 （即ECL法）［24］。免疫熒光法：首先收集狀態(tài)良好的萊茵衣藻細(xì)胞，經(jīng)處理后固定到載玻片上并加入甲醇通透［23］，然后加入 5%的BSA封閉，之后依次用制備的多克隆抗體和熒光標(biāo)記的二抗 （A lexa Fluor 488 goat anti-rabbitIgG 稀釋度 1∶400） 孵育，最后經(jīng)封片干燥后用顯微鏡拍照［25］。

2　結(jié)果與分析

2.1pGEX-2T-ift46和pM AL-C2X-ift46原核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增獲得約1 035 bp的片段 （圖1A），與ift46預(yù)期大小一致。將構(gòu)建的 pGEX-2T-ift46 和pMAL-C2X-ift46重組表達(dá)載體進(jìn)行Bam HⅠ和Hin d Ⅲ雙酶切驗(yàn)證如圖1B所示，均獲得條帶大小約為1 035 bp的目的片段，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列完全正確，說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2GST-IFT46和M BP-IFT46融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

在IPTG的誘導(dǎo)下，含有pGEX-2T-ift46和pMAL-C2X-ift46質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21 （DE3）菌株會(huì)大量表達(dá)目的蛋白，菌體經(jīng)超聲破碎后獲得全蛋白，所得全蛋白經(jīng)低溫高速離心分離上清和沉淀，然后經(jīng)電泳、染色、脫色后分別在約70 kDa和86 kDa處可以看到目的蛋白大量表達(dá)，且蛋白的表達(dá)主要在上清中，其表達(dá)結(jié)果如圖2所示，其中圖2A為GST-IFT46融合蛋白的表達(dá)，圖2B為MBP-IFT46融合蛋白的表達(dá)。

圖1　ift46的PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig. 1 PCR amplication of ift46 and the identification of recombinant expression plasm id by restriction enzyme digestion. （A） PCR verification of ift46 gene. 1: PCR product of ift46 gene； M: 1 kb marker. （B）Restriction digestion analysis of pGEX-2T-ift46 and pMAL-C2X-ift46. M: 1 kb marker； 1: pGEX-2T-ift46 digested w ith Bam HⅠand Hin d Ⅲ； 2: pMAL-C2X-ift46 digested w ith Bam HⅠand Hin d Ⅲ.

圖2　SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白在E. coli BL21 (DE3) 中的表達(dá)Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21 （DE3）. （A） Expression of the recombinant protein GST-IFT46. 1: the total protein of BL21 lysates w ith GST-IFT46 before induced； 2: the supernatant of BL21 lysates w ith GST-IFT46 before induced； 3: the sediment of BL21 lysates w ith GST-IFT46 before induced； 4: the total protein of BL21 lysates w ith GST-IFT46 induced w ith IPTG； 5: the supernatant of BL21 lysates w ith GST-IFT46 induced w ith IPTG； 6: the sediment of BL21 lysates w ith GST-IFT46 induced w ith IPTG； M: protein marker. （B） Expression of the recombinant protein MBP-IFT46. 1: the total protein of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 before induced； 2: the supernatant of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 before induced； 3: the sediment of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 before induced； 4: the total protein of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 induced w ith IPTG； 5: the supernatant of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 induced w ith IPTG； 6: the sediment of BL21 lysates w ith MBP-IFT46 induced w ith IPTG； M: protein marker.

2.3GST-IFT46融合蛋白的純化

由上述可知 GST-IFT46融合蛋白的表達(dá)主要在上清中，因此將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體經(jīng)超聲破碎以及高速離心后取上清，于含有Glutathione SepharoseTM4B填料的重力柱中進(jìn)行親和純化，由于融合蛋白所含有的GST標(biāo)簽?zāi)軌蛱禺愋耘c上述填料結(jié)合，因此經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫等步驟即得到純度達(dá) 95%以上的目的蛋白 （圖 3），可作為免疫動(dòng)物所用抗原。

2.4抗血清效價(jià)的檢測(cè)

用純化得到的 GST-IFT46融合蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈少量采血，室溫靜置2 h 或4 ℃過(guò)夜后獲得析出血清，以間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450處的吸光值后計(jì)算出抗血清的效價(jià)，結(jié)果如圖 4所示，以實(shí)驗(yàn)組血清OD450與陰性對(duì)照血清OD450的比值大于 2即為陽(yáng)性，其最高稀釋度即為抗血清的效價(jià)，由圖4可知1號(hào)兔抗血清的效價(jià)大于128 000，2號(hào)兔抗血清效價(jià)大于256 000，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖3　SDS-PAGE檢測(cè)親和純化后GST-IFT46重組蛋白Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified GST-IFT46 recombinant protein by affinity adsorption purification. 1: the flow-through fraction contains most of the non-target proteins from BL21； 2-4: the fraction of the first， second and third time washed by washing buffer，respectively； 5-9: the fraction of the first， second， third，fourth and fifth time eluted by elution buffer，respectively； M: protein marker.

2.5抗血清靈敏度和特異性檢測(cè)

所得的抗血清由于含有多種抗體分子因此需要進(jìn)行純化，本研究首先進(jìn)行Protein A純化，結(jié)果如圖 5所示。然后利用免疫親和純化通過(guò)MBP-IFT46融合蛋白作為抗原，將其偶聯(lián)到對(duì)應(yīng)的基質(zhì)上使其特異性吸附抗體，再經(jīng)過(guò)洗滌、洗脫等步驟即可得到純度較高的抗體。但是仍可存在少量雜帶，因此又采用MBP-IFT46固定到硝酸纖維素膜親和法進(jìn)一步純化。AP顯色結(jié)果 （圖6A） 和ECL曝光法 （圖6B） 均顯示，抗血清能夠正確的與46 kDa大小的IFT46蛋白特異結(jié)合，證明所制備的多克隆抗體具有很好的特異性，可與免疫原專一性結(jié)合。

2.6免疫熒光法檢測(cè)IFT46的定位及抗體的活性

圖4　間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)Fig. 4 ELISA test of anti-IFT46 polyclonal antiserum.

免疫熒光技術(shù)即以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)，基于抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，將不影響抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體上，與其相應(yīng)的抗原結(jié)合后在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用的是間接法即將熒光色素標(biāo)記在第二抗體上，來(lái)研究IFT46在萊茵衣藻中的定位，結(jié)果如圖7所示，由圖可以看到 IFT46的抗體能夠與萊茵衣藻 IFT46蛋白特異性結(jié)合，且結(jié)合處主要位于纖毛的基體，表明 IFT46蛋白主要定位在纖毛基體，少部分沿纖毛呈點(diǎn)狀分布，與 IFT復(fù)合物B組分的定位結(jié)果相一致。由于IFT是一種雙向運(yùn)輸機(jī)制，包括纖毛基部到頂端的正向運(yùn)輸和頂端到基部的逆向運(yùn)輸，而 IFT復(fù)合物 B主要在正向運(yùn)輸中發(fā)揮作用，且其定位在基體，因此它的缺失或突變會(huì)引起復(fù)合物B的不穩(wěn)定，進(jìn)而影響纖毛的組裝使纖毛形成缺陷，從而使纖毛的運(yùn)動(dòng)存在缺陷。

圖5　IFT46的抗體經(jīng)Protein A純化Fig. 5 The anti-IFT46 was purified by Protein A. The first peak represents other antibodies besides IgG； the second peak represents IgG antibodies.

圖6　W estern blotting驗(yàn)證抗體特異性-AP顯色法(A) 和ECL曝光法 (B)Fig. 6 The antibody specificity was detected by Western blotting through AP method （A） and ECL method （B）. （A） AP method. M is protein marker， the w ild-type flagella extract was probed w ith the affinity-purified anti-IFT46 antibody w ith a single band detected and the ift46 mutant flagella extract was probed w ith the affinity-purified anti-IFT46 antibody w ith no band detected. （B） ECL method. The w ild-type flagella extract was probed w ith the affinity-purified anti-IFT46 antibody w ith a single band detected and in contrast the w ild-type flagella extract was probed w ith pre-immune serum w ith no specific band.

3　結(jié)論與討論

圖 7 免疫熒光檢測(cè) IFT46蛋白在萊茵衣藻纖毛中的定位Fig. 7 Immunofluorescence analysis the flagella localization of IFT46. It showed that IFT46 is concentrated at basal body regions and is localized along the entire length of the flagellum as punctuated dots. The insets show enlargements of the basal body region and the flagella.

纖毛是真核細(xì)胞表面的重要結(jié)構(gòu)，盡管近年來(lái)人們對(duì)纖毛的研究逐漸加深，無(wú)論從其結(jié)構(gòu)的研究到其組裝與解聚，從其功能到其各組分間的相互作用研究都取得了一定進(jìn)展，但纖毛在多種生命活動(dòng)中都發(fā)揮重要功能，其復(fù)雜而保守的調(diào)控機(jī)制還未完全清楚，尤其是纖毛相關(guān)基因的變異會(huì)造成其結(jié)構(gòu)缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致纖毛相關(guān)疾病的發(fā)生［26-27］，因此纖毛研究的必要性和緊迫性已成為科學(xué)界的共識(shí)，纖毛的研究將對(duì)人類認(rèn)知生命的過(guò)程和健康事業(yè)的發(fā)展做出巨大貢獻(xiàn)。

本文研究的ift46基因的變異也會(huì)導(dǎo)致纖毛的形成缺陷［19］，為了在蛋白水平和細(xì)胞水平研究其作用機(jī)制，我們制備了高特異性和高靈敏度的IFT46抗體。首先在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)IFT46，然后用多步純化獲得高純度（95%以上） 的 GST-IFT46融合蛋白，并作為抗原免疫新西蘭大白兔獲得抗血清。由于本研究使用的是ift46基因的全序列，包含所有抗原表位，因此所制備的抗體用途廣泛。且經(jīng)過(guò)親和純化后抗體的特異性和靈敏度極高，尤其是通過(guò)ECL曝光的方法更加肯定了所制備多克隆抗體的特異性和靈敏度。不僅如此，本實(shí)驗(yàn)所制備的IFT46抗體可以很好地用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 IFT46抗體能夠?qū)Ｒ恍缘嘏c萊茵衣藻IFT46蛋白結(jié)合，且發(fā)現(xiàn)IFT46蛋白絕大部分定位在纖毛基體，極少部分沿纖毛呈點(diǎn)狀分布，與相關(guān)研究結(jié)果一致［18］。該部分結(jié)果表明IFT46是IFT復(fù)合物B的一個(gè)組分，它的缺失或突變會(huì)引起復(fù)合物 B的不穩(wěn)定，進(jìn)而影響纖毛的組裝使纖毛形成缺陷，導(dǎo)致萊茵衣藻運(yùn)動(dòng)存在缺陷。該抗體對(duì)進(jìn)一步研究 IFT46蛋白在纖毛的組裝和解聚機(jī)制、與其他 IFT蛋白的相互作用以及纖毛病的發(fā)病機(jī)理都具有重要的意義。

REFERENCES

［1］ Lucker BF， M iller MS， Dziedzic SA， et al. Direct interactions of intraflagellar transport complex B proteins IFT88， IFT52， and IFT46. J Biol Chem，2010， 285（28）: 21508-21518.

［2］ Li JC， Peng SQ， Hu ZL. Expression and immunological activity of enterotoxin C2 from Staphylococcus aureus in Chlamydomonas reinhardtii. J Shenzhen Univ: Sci Eng， 2012， 29（2）: 159-164 （in Chinese）.

李建成， 彭世清， 胡章立. SEC2在萊茵衣藻中的表達(dá)及免疫學(xué)活性分析. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào): 理工版，2012， 29（2）: 159-164.

［3］ Wheatley DN， Wang AM， Strugnell GE. Expression of primary cilia in mammalian cells. Cell Biol Int， 1996， 20（1）: 73-81.

［4］ Nonaka S， Tanaka Y， Okada Y， et al. Random ization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extra embryonic fluid in m ice lacking KIF3B motor protein. Cell， 1998， 95（6）: 829-837.

［5］ Salathe M. Regulation of mammalian ciliary beating. Annu Rev Physiol， 2007， 69: 401-402.

［6］ Axelrod JD. Basal bodies， kinocilia and planar cell polarity. Nat Genet， 2008， 40（1）: 10-11.

［7］ Schneider L， Clement CA， Teilmann SC， et al. PDGFRαα signaling is regulated through the primary cilium in fibroblasts. Curr Biol， 2005，15（20）: 1861-1866.

［8］ Narasimhan V， Roy S. Cilia: organelles at the heart of heart disease. Curr Biol， 2015， 25 （13）: 559-562.

［9］ Schm idts M， Vodopiutz J， Sonia C S， et al. M utations in the gene encoding IFT dynein complex component WDR34 cause jeune asphyxiating thoracic dystrophy. Am J Hum Genet，2013， 93 （5）: 932-944.

［10］ Rosenbaum JL， W itman GB. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol， 2002， 3（11）: 813-825.

［11］ Scholey JM. Intraflagellar transport. Annu Rev Cell Dev Biol， 2003， 19: 423-443.

［12］ Fan ZC， Behal RH， Geimer S， et al.Chlamydomonas IFT70/CrDYF-1 is a core component of IFT particle complex B and is required for flagellar assembly. Mol Biol Cell，2010， 21（15）: 2696-2706.

［13］ Cole DG， Diener DR， Himelblau AL， et al. Chlamydomonas kinesin-II-dependent intraflagellar transport （IFT）: IFT particles contain proteins required for ciliary assembly in Caenorhabditis elegans sensory neurons. J Cell Biol， 1998， 141（4）: 993-1008.

［14］ Badano JL， M itsuma N， Beales PL， et al. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet， 2006，7: 125-148.

［15］ Hildebrandt F， Benzing T， Katsanis N. Ciliopathies. N Engl J Med， 2011， 364（16）: 1533-1543.

［16］ Ishikawa H， Ide T， Yagi T， et al. TTC26/DYF13 is an intraflagellar transport protein required for transport of motility-related proteins into flagella. eLife， 2014， 3（3）: e01566.

［17］ Gouttenoire J， Valcourt U， Bougault C， et al. Knockdown of the intraflagellar transport protein IFT46 stimulates selective gene expression in mouse chondrocytes and affects early development in Zebrafish. J Biol Chem， 2007， 282（42）: 30960-30973.

［18］ Hou YQ， Qin HM， Follit JA， et al. Functional analysis of an individual IFT protein: IFT46 is required for transport of outer dynein arms into flagella. J Cell Biol， 2007， 176（5）: 653-665.

［19］ Lee MS， Hwang KS， Oh HW， et al. IFT46 plays an essential role in cilia development. Dev Biol， 2015，400（2）: 248-257.

［20］ Tian SJ， Li F， Wu YG. A new method of auricular arteriae blood sampling in rabbit for attaining immune serum of polyclonal antibodies. Sichuan J Zool， 2008， 27（5）: 931 （in Chinese）.

田樹(shù)娟， 李芬，武玉光. 多克隆抗體兔免疫血清取血新方法. 四川動(dòng)物， 2008， 27（5）: 931.

［21］ Barton DE， Yang Feng TL， M ason A J， et al. Mapping of genes for inhibit subunits α， βA， and βBon human and mouse chromosomes and studies of jsd m ice. Genom ics， 1989， 5（1）: 91-99.

［22］ Luo AL， Liang Z， Ku MSB. A method for purification of antibodies w ith protein immobilized on nitrocellulose membrane. Acta Botan Sin， 1997，39（6）: 534-536 （in Chinese）.

駱愛(ài)玲， 梁崢， Ku MSB. 用硝酸纖維素膜親和法純化抗體. 植物學(xué)報(bào)， 1997， 39（6）: 534-536.

［23］ Pazour G J， W ilkerson C G， and W itman G B. 1998. A dynein light chain is essential for the retrograde particle movement of intraflagellar transport （IFT）. J. Cell Biol， 1998， 141: 979-992.

［24］ Valcourt U， Gouttenoire J， Aubert-Foucher E， et al. A lternative splicing of type II procollagen pre-mRNA in chondrocytes is oppositely regulated by BMP-2 and TGF-β1. FEBS Lett， 2003， 545（2/3）: 115-119.

［25］ Zhang P， Xing W J， Bao XH， et al. Cloning and prokaryotic expression of rat RVLG and preparation of mouse anti-RVLG polyclonal antibody. Chin J Biotech， 2008， 24（11）: 1981-1987 （in Chinese）.

張平， 邢萬(wàn)金， 包曉紅， 等. 大鼠 RVLG cDNA的克隆、原核表達(dá)和小鼠抗 RVLG 蛋白多克隆抗體的制備. 生物工程學(xué)報(bào)， 2008， 24（11）: 1981-1987.

［26］ Pan JM. Cilia and ciliopathies: from Chlamydomonas and beyond. Sci China Ser C: Life Sci， 2008， 51（6）: 479-486.

潘俊敏. 衣藻、纖毛與“纖毛相關(guān)疾病”. 中國(guó)科學(xué)C輯: 生命科學(xué)， 2008， 51（6）: 479-486..

［27］ Cao MQ， Pan JM. Cilia and ciliopathies. Chin J Cell Biol， 2012， 34（9）: 849-856 （in Chinese）.

曹木青， 潘俊敏. 纖毛及纖毛相關(guān)疾病研究進(jìn)展.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 34（9）: 849-856.

（本文責(zé)編 郝麗芳）

November 10， 2015； Accepted: January 19， 2016

Prokaryotic expression and purification of Chlamydomonas reinhardtii intraflagellar transport protein 46(IFT46) and preparation of polyclonal antibody

Haiyue Ren1, Bin Dong1, Zhenchuan Fan1,2,3, and Demei M eng1,2,3

1 Key Laboratory of Food Nutrition and Safety， Ministry of Education， College of Food Science and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China
2 International Research Center of Tianjin for Food Nutrition and Safety and Medicinal Chemical， Tianjin 300457， China
3 The New Rural Development Research Institute of Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457， China

IFT46 is one of the important components of intraflagellar transport complex B in Chlamydomonas reinhardtii，and plays important roles in the assembly， movement and perception of ciliary. To study its functional mechanism， a GST-tagged and an MBP-tagged prokaryotic expression plasm id， pGEX-2T-ift46 and pMAL-C2X-ift46 were constructed，respectively， by inserting ift46 into the pGEX-2T and pMAL-C2X vector， and then transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） for protein expression. SDS-PAGE （15%） analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein GST-IFT46 and MBP-IFT46 were 70 kDa and 86 kDa， respectively. We used the fusion protein GST-IFT46 purified by affinity adsorption purification （more than 95% purity） for immunity to New Zealand white rabbits. The 5th immune serum was collected and the antibody titer was determ ined to be 256 000 by ELISA. The antiserum was purified by Protein A affinity adsorption purification and immobilized MBP-IFT46 purification， and the specificity of polyclonal antibodies was evaluated by Western blotting and immunofluorescence. Results showed that the polyclonal antibody prepared could specifically and precisely bind IFT46 in C. reinhardtii， and IFT46 was mainly concentrated at basal body regions and few localized along the entire length of the flagellum as punctuated dots， which w ill make a foundation to further study the mechanism of IFT46 in cilia related diseases such as obesity， diabetes and polycystic kidney disease.

Chlamydomonas reinhardtii， flagellar， IFT46， prokaryotic expression， protein affinity purification， polyclonal antibody

Supported by: Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology （No. 13JCYBJC41900）， Tianjin University of Science & Technology Foundation for Returned Scholars （No. 20130420）， ICGEB Research Grants 2015 （No. CRP/CHN15-01）.

Corresponding authors: Demei Meng. Tel: +86-22-60912418； Fax: +86-22-60602419； E-mail: mengdm@tust.edu.cn

Zhenchuan Fan. Tel/Fax: +86-22-60912419； E-mail: fanzhen@tust.edu.cn

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃 （No. 13JCYBJC41900），天津科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)費(fèi) （No. 20130420），聯(lián)合國(guó)國(guó)際遺傳工程與生物技術(shù)中心 （ICGEB） 研究項(xiàng)目 （No. CRP/CHN15-01） 資助。