王伍，紀松軍，黃招竹，盧彬彬，呂建新溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院 浙江省模式生物技術(shù)與應用重點實驗室，浙江 溫州 325000

環(huán)境生物技術(shù)

構(gòu)建一種檢測水中As3+的敏感型大腸桿菌

王伍*，紀松軍*，黃招竹，盧彬彬，呂建新
溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院 浙江省模式生物技術(shù)與應用重點實驗室，浙江 溫州 325000

王伍， 紀松軍， 黃招竹， 等. 構(gòu)建一種檢測水中As3+的敏感型大腸桿菌. 生物工程學報， 2016， 32（8）: 1081-1092.

Wang W， Ji SJ， Huang ZZ， et al. Construction of an Escherichia coli strain for sensitive detection of arsenite ion in water. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1081-1092.

為構(gòu)建一種敏感性強、特異性好的檢測砷離子的大腸桿菌熒光報告菌株，本研究利用基因敲除技術(shù)，敲除了大腸桿菌中負責向胞外轉(zhuǎn)運砷離子的arsB基因，構(gòu)建對As3+敏感的菌株；利用egfp基因作為報告基因，構(gòu)建融合檢測載體pET28b-Pars-arsR-egfp。然后將檢測載體pET28b-Pars-arsR-egfp轉(zhuǎn)化至arsB基因敲除菌中完成敏感型 As3+檢測菌株的構(gòu)建。接著對此微生物傳感器進行了檢測條件的優(yōu)化，以及線性檢測范圍、最低檢出限、特異性等性能的確定。研究結(jié)果表明，與利用野生大腸桿菌作為檢測宿主相比，此敏感型砷檢測菌株對檢測As3+的靈敏度有顯著提高，最適檢測As3+濃度范圍為0.013-42.71 μmol/L，最低檢出下限為5.13 nmol/L。因此，本研究利用基因敲除技術(shù)對大腸桿菌進行改造，成功地提高了砷檢測微生物傳感器的靈敏度，為重金屬微生物傳感器的優(yōu)化研究工作提供了有用方案。

As3+檢測，大腸桿菌，arsB基因，基因敲除，敏感性

砷 （As） 是環(huán)境中常見的污染物，能通過多種途徑進入人體，對人體的多種組織和器官都能造成明顯的損傷［1］。IARC （國際癌癥研究機構(gòu)）和WHO將砷列為人類致癌物。砷污染的主要來源是開采、焙燒、冶煉含砷礦石以及生產(chǎn)含砷產(chǎn)品過程中產(chǎn)生的含砷“三廢”排放，另外農(nóng)業(yè)上大量使用含砷農(nóng)藥也對環(huán)境造成威脅。砷的毒性主要取決于它的化學形態(tài)，形態(tài)不同毒性差異很大［2］，所以選擇適當、簡便和快速的測定方法是現(xiàn)代分析技術(shù)取得發(fā)展的必要條件。最常用的砷檢測分析技術(shù)，如原子熒光光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法 （GC-MS）［3］、高效液相相色譜分析-質(zhì)譜法 （HPLC-MS）［4-5］和電感耦合等離子體質(zhì)譜法 （ICP-MS）［6］等。這些傳統(tǒng)的分析方法雖然具備高精確度、低檢測限，但是均需要使用昂貴的儀器設備和專業(yè)操作人員，因此阻礙了大規(guī)模推廣應用。

全細胞微生物傳感器 （Whole-cell biosensor）是一種便捷、快速、低成本的環(huán)境重金屬檢測工具，它采用基因工程技術(shù)對活體微生物進行改造，使其能夠?qū)χ亟饘傥廴疚镞M行定量分析［7-8］。但是其特異性欠佳、靈敏度不高一直是限制其廣泛應用的瓶頸問題。靈敏度不高是因為細菌體內(nèi)存在一套對自我耐受保護機制，當重金屬進入細菌體內(nèi)以后，細菌會啟動表達“外排泵”基因以泵出重金屬，使菌體內(nèi)重金屬濃度維持在較低水平，導致檢測靈敏度不高。例如大腸桿菌體內(nèi)存在一套砷耐受操縱子 ars，表達ArsR、ArsB、ArsC三個相關蛋白，ArsR與As （III）結(jié)合后，從啟動子P ars位置處解離出來，從而啟動下游ArsB和A rsC的表達，其中ArsB屬于ATPase家族，能夠通過消耗 ATP，將胞內(nèi)As （III） 泵到胞外，A rsC負責將As （Ⅴ） 還原成As （III），并被A rsB泵出胞外［9-10］。

目前已經(jīng)報道的砷檢測微生物傳感器，大都是利用細菌體內(nèi)本身的砷耐受操縱子，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ArsR來控制報告基因的表達來響應亞砷酸鹽［11-12］。Stocker等構(gòu)建了帶有兩個啟動子的位點的檢測元件，降低了報告基因的本底表達，改善砷反應生物傳感器的靈敏度［12］。

本研究利用基因敲除技術(shù)［13］，獲得1株arsB基因敲除菌株，將 As3+檢測元件導入到敲除菌株中，構(gòu)建出特異性強、敏感性好的 As3+檢測大腸桿菌報告菌株。與利用野生型大腸桿菌作為檢測菌株相比，敲除菌株提高了對砷的敏感性，具有更低的檢測下限，其在亞砷酸鹽檢測實驗中表現(xiàn)出良好的性能，為目前重金屬微生物傳感器的優(yōu)化研究工作提供了有用方案。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

E. coli DH5α ［F-，λ-，endA1，hsdR17，hsdM+，supE44，thi1，recA1，gyrA96，relA1，Δ （argF，lacZYA），U169，φ80d，Δ （lacZ），M 15］，由本實驗室保存；E. coli MC4100 ［F-，araD139，Δ （argF-lac），U169，rspL150，relA1，flbB5301，fruA25，deoC1，pstF25］，由本實驗室保存。

1.1.2質(zhì)粒

pKD46［oriR101 repA101ts ParaB-gam-bet-exo Ampr］為同源重組的協(xié)助質(zhì)粒，阿拉伯糖誘導后表達Bet、Exo和Gam三個λ噬菌體重組酶，完成抗性基因與待敲除基因的替換，高于37 ℃該質(zhì)粒會丟失。

pKD3 ［oriRγ cat bla Cmr］，線性打靶載體模板，含氯霉素抗性基因 （cat） 和特異性同源重組位點 （FRT），為重組轉(zhuǎn)化體提供篩選標志，由本實驗室保存。

pCP20 ［Ampr，Cmr］ 為Flp重組酶的表達質(zhì)粒，復制子為溫度敏感型，42 ℃誘導Flp重組酶表達消除FRT位點間的氯霉素抗性基因，質(zhì)粒也逐漸丟失，由本實驗室保存。

pET28b ［Kanar］，含有His標簽和T7終止子，由本實驗室保存。

pEGFP，含有增強型綠色熒光蛋白基因，由本實驗室保存。

1.1.3LB培養(yǎng)基

1.1.4主要試劑

2×phanta，購于 Vazyme公司；DL 5 000 DNA ladder marker，購于寶生物工程 （大連） 有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購于寶生物工程 （大連）有限公司；NaAsO2、砷標準溶液，購于阿拉丁試劑網(wǎng)-上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無縫克隆反應試劑盒購于和元生物技術(shù) （上海）有限公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1PCR引物設計

用于同源重組的引物，5′端為50 bp的arsB基因兩側(cè)的同源臂，3′端為22 bp的用于擴增氯霉素抗性基因 （兩側(cè)有FRT位點） 的引物，以pKD3為模板，常規(guī)PCR方法擴增氯霉素抗性基因，產(chǎn)物片段長1 149 bp，膠回收后用于電轉(zhuǎn)化上游同源臂引物H1-P1。敲除后鑒定上游引物arsB-jianding-F位于arsB基因上游108 bp，下游引物 arsB-jianding-R位于 arsB基因下游101 bp。

啟動子和調(diào)節(jié)基因 arsR序列源于大腸桿菌E. coli MC4100，基因egfp［14］來源于Aequoreavictoria的水母 gfp的突變體根據(jù)文獻公布序列合成獲得，設計基因融合引物，具體引物信息見表1。

1.2.2arsB基因敲除菌株構(gòu)建

以pKD3質(zhì)粒為模板，利用P1和P2擴增含有arsB基因上下游50 bp同源臂的氯霉素基因片段，PCR反應體系為：2×phanta Taq 50 μL，正反引物各1.0 μL，模板1 μL，用dd H2O補齊到100 μL。PCR反應條件位：94 ℃4 min ；94 ℃40 s，50 ℃40 s，72 ℃1.5 m in ，35個循環(huán)；72 ℃ 10 m in，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進行膠回收。

細菌培養(yǎng)，電轉(zhuǎn)化方法參見文獻［15］，基因敲除方法參見文獻［13］和［16］。

表1　基因敲除和融合引物信息Table 1 Prim ers of gene knockout and fusion

1.2.3砷檢測元件及檢測菌株的構(gòu)建

以野生型E. coli MC4100和含egfp質(zhì)粒為模板，利用 P5和 P6擴增啟動子和調(diào)節(jié)基因Pars-arsR，P7和P8擴增增強型綠色熒光蛋白基因egfp，PCR反應體系為：2×phanta Taq 50 μL，正反引物各1.0 μL，模板1 μL，用dd H2O補齊到100 μL。PCR反應條件位：94 ℃4 m in ；94 ℃40 s，52 ℃40 s，72 ℃1 m in ，35個循環(huán)；72 ℃ 10 m in，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物以1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進行膠回收。

Pars-arsR、egfp膠回收片段分別測濃度，按照公式C1V1/bp1=C2V2/bp2，計算Pars-arsR和egfp加入的體積。因為設計引物時，Pars-arsR的反向引物P6含有egfp的5′端的同源臂單片段的同源臂序列，所以擴增的單片段Pars-arsR下游含有egfp上游同源臂序列，可通過不加引物PCR反應8個循環(huán)，將2個基因片段連接起來，交叉PCR反應體系為：2×phanta Taq 15 μL，模板Pars-arsR和egfp分別為1.5 μL和2.4 μL，用dd H2O補齊到30 μL。反應條件為：94 ℃ 3 m in；94 ℃40 s，55 ℃40 s，72 ℃1 m in ，8個循環(huán)；72 ℃、10 m in，4 ℃保存。

再以上述30 μL PCR產(chǎn)物為模板，再加入正反引物各0.5 μL和2×phanta Taq 10 μL，用dd H2O補齊到總體積為50 μL。PCR反應條件與擴增各元件單片段條件相同。產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收試劑盒進行膠回收。

膠回收的融合基因片段 Pars-arsR-egfp與pET28b載體進行無縫克隆連接后，轉(zhuǎn)化到超級感受菌株E. coli DH5α后挑取陽性克隆鑒定并測序 （上海桑尼生物科技有限公司），測序正確的克隆擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至野生型菌和arsB敲除菌，分別命名為pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB-和pET28b-Pars-arsR-egfp/MC4100。

1.2.4arsB基因敲除菌株的生長曲線和最低抑菌濃度 (M IC) 的測定

生長曲線的測定：取5-10 μL，-80 ℃保存的轉(zhuǎn)化有 pBAD空質(zhì)粒的 arsB基因敲除菌和MC4100野生菌 （pBAD/arsB–和pBAD/MC4100）接種于5 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，并分別加入終濃度為 100 μg/m L的氨芐青霉素，37 ℃、250 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。吸取過夜菌液稀釋10倍后取500 μL加入比色皿中，用空白LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，使用Beckman DU 730測定OD600值。按照公式 V=1/10×OD600，吸取適量菌液加入到15 m L LB液體培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，使起始菌液OD600值約為0.02。每種菌株各做 3個平行管，同時分別吸取菌液400 μL，測定OD600值，作為0 h OD600值。其余菌液于37 ℃、250 r/m in恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔1 h取400 μL菌液測定OD600值，監(jiān)測12 h內(nèi)濁度變化。對濃度大的菌懸液用LB液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，使其OD600值在1.0以內(nèi)，培養(yǎng)液實際的OD600值為稀釋后測得的OD600值乘以相應的稀釋倍數(shù)。實驗結(jié)果為 3次獨立實驗的±s，n=3。

最低抑菌濃度的測定：吸取適量過夜菌液pBAD/MC4100和 pBAD/arsB–加入到 50 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值為0.02，并分別加入氨芐青霉素，分裝 （5 m L/管），加入As3+溶液，使其終濃度分別為0.5、2、8、32、128、512、1 024、2 048、4 096、5 000 （×10-6mol/L），另加等體積無菌M illiQ H2O作為陰性對照，37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)，監(jiān)測其9 h內(nèi)濁度改變，測量各管菌液OD600值。重復試驗3次，每個濃度各做3個平行管。數(shù)據(jù)處理：匯總至少3次細菌對 As3+的敏感性結(jié)果，得出2種細菌各自的最小抑菌濃度 （M IC）。10 h后由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分耗盡，部分細菌吸光度有所下降，故以0-9 h作為細菌生長情況的監(jiān)測時段。并且規(guī)定：9 h后，使試驗管OD600值與對照管 OD600值之比不大于10%的最低As3+濃度為細菌的最低抑菌濃度 （M IC）。實驗結(jié)果為3次獨立實驗的±s，n=3。

1.2.5傳感器對As3+的孵育時間實驗

取pET28b-Pars-arsR-egfp/MC4100和pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB-過夜菌加入到50 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值為0.02，并分別加入終濃度為50 μg/m L的卡那霉素，擴大培養(yǎng)至 OD600值為 0.5左右 （OD600值為 0.5左右大腸桿菌處于對數(shù)生長期），加入As3+溶液使終濃度為0.1、1.0、5.0、10 （×10-6mol/L），每個濃度各做3個平行管，另加等體積無菌M illiQ H2O 作為陰性對照。將以上菌液于 37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4、5、6、7 h時間點收集菌液1 m L，8 000 r/m in離心2 m in，棄上清。收獲的菌體用蛋白純化脫鹽緩沖液 （Desalting buffer，DB） 重懸，然后取重懸菌液稀釋 20倍后 （根據(jù)菌液濃度稀釋不同倍數(shù)，使得 OD600值相差不大），分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。激發(fā)光波長為481 nm，發(fā)射光波長為511 nm。重復試驗3次，每個濃度各做3個平行管。

1.2.6傳感器檢測As3+的線性范圍確定

分 別 取pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB-和pET28b-Pars-arsR-egfp/MC4100過夜菌以1∶50接到新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/m in擴大培養(yǎng)至 OD600值為 0.5左右，分裝至試管0.99 m L/管，加入10 μL不同濃度的As3+溶液至各管菌液終濃度分別為 0、0.013×10-6、0.13×10-6、0.27×10-6、0.53×10-6、0.67×10-6、1.07×10-6、2.14×10-6、2.67×10-6、4.27×10-6、8.54×10-6、10.68×10-6、17.09×10-6、34.18×10-6、42.71×10-6mol/L，各做3個平行管。將以上菌液于37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)4 h后，進行樣品處理，處理步驟同上，完成傳感器對 As3+的檢測線性范圍的確定。

1.2.7傳感器對 As3+的最低檢測限 (The lim it of detection, LOD) 的確定

將pET28b-Pars-arsR-egfp/MC4100和pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB–過夜菌種子液加入到20 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值為0.02，37 ℃、250 r/m in擴大培養(yǎng)至OD600為0.5左右，分裝 （0.99 m L/管），每管加入10 μL無菌M illiQ H2O，做10個平行管，37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)3 h后，4 000 r/m in水平離心 10 m in，棄上清，收獲的菌體重懸于1 m L DB中，然后取50 μL重懸菌液20倍稀釋于0.95 m L DB中，混勻，分別測量其稀釋液熒光值與OD600值。實驗數(shù)據(jù)處理［17］：

1.2.8傳感器對As3+的特異性實驗

吸取 pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB–過夜菌加入到50 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液OD600值為0.02，37 ℃、250 r/m in擴大培養(yǎng)至OD600值為0.5左右，分裝至試管0.99 m L/管，分別加入 10 μL不同種類的金屬離子 （As3+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Hg2+、Ni2+、Co2+）使其終濃度分別為0.5、5、10 μmol/L，另加等體積無菌M illiQ H2O作為陰性對照，各做3個平行管。將以上菌液于37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)4 h 后 （Pb2+離子為避光孵育），處理步驟同上。

1.2.9傳感器對檢測樣品中As3+的回收實驗

從實驗室附近采集河水樣品，經(jīng)孔徑為0.22 μm的過濾器對雜質(zhì)和細菌進行過濾。用移液槍吸取計算好的pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB–過夜菌種子液加入到上述90 m L新鮮LB液體培養(yǎng)基中，使起始菌液 OD600值約為 0.5，分裝（0.9 m L/管），加入等體積不同濃度的砷單元素標準溶液至各管菌液，使其終濃度分別為0、0.13、1.07、4.27、10.68、17.09 μmol/L，然后再分別加入100 μL過濾后的湖水至每管菌液，每種濃度各做 3個平行管。將以上菌液于 37 ℃、250 r/m in振蕩培養(yǎng)4 h后，8 000 r/m in水平離心2 m in，棄上清，收獲的菌體重懸于1 m L DB中，然后取50 μL重懸菌液20倍稀釋于0.95 m L DB中，混勻，分別測量其稀釋液熒光值與 OD600值。然后根據(jù)上述標準曲線的回歸方程計算樣品中As3+的濃度，并利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 （ICP-MS） 對待測樣品溶液的 As3+進行驗證，最后計算加標回收率。實驗結(jié)果為 3次獨立實驗的±s，n=3。

2　結(jié)果與分析

2.1arsB基因敲除菌株的構(gòu)建

以E. coli MC4100基因組DNA為模板，用引物P3和P4擴增出arsB基因，以arsB::cat/MC4100基因組DNA為模板，用引物P3和P4擴增出arsB::cat基因和用引物P1和P2擴增出arsB::cat基因；以及以arsB-基因組DNA為模板，用引物P3和P4進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖 1所示，說明成功制備arsB基因敲除菌株arsB–。

2.2砷檢測元件及檢測菌株的構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果顯示，砷檢測元件已經(jīng)成功構(gòu)建，融合基因片段 Pars-arsR-egfp 大小為1 298 bp，堿基序列與理論完全匹配。挑取測序鑒定正確的質(zhì)粒 pET28b-Pars-arsR-egfp，轉(zhuǎn)化至E. coli MC4100和arsB-感受態(tài)細胞中，從而成功構(gòu)建As3+檢測菌株。

圖1　arsB基因敲除菌株的構(gòu)建過程及PCR鑒定Fig. 1 Construction and verification of arsB deletion mutant. Primers P1and P2were used to amplify the cat gene fragment w ith 50 bp extensions that are homologous to regions adjacent to the arsB gene （Lane 3: 1 115 bp）. Primers P3and P4were used for PCR verification. Lane 1: w ild-type （arsB gene， 1 505 bp）；Lane 2: arsB–mutant w ith cat gene （1 435 bp）； Lane 4: arsB–mutant in which the cat gene was elim inated.

2.3arsB基因敲除菌株的生長曲線和最低抑菌濃度 (M IC) 的測定

由于將砷外泵基因arsB敲除，為了驗證對其生長是否產(chǎn)生影響，我們首先進行了生長曲線測定。生長曲線結(jié)果如圖2A所示，在LB培養(yǎng)基中，arsB基因敲除菌與野生型生長速率一致，說明對大腸桿菌的arsB基因進行敲除不會影響其生長狀態(tài)和穩(wěn)定性。

為驗證arsB缺失以后，大腸桿菌對As3+的敏感性是否增強。我們對敲除菌進行了最低抑菌濃度的測定。如圖2B所示，我們發(fā)現(xiàn)arsB敲除菌株在培養(yǎng)基As3+濃度為125 μmol/L時，其生長已基本被抑制。而野生型菌株需要達到 4 mmol/L時才受到抑制。這表明arsB基因敲除后，大腸桿菌對培養(yǎng)基中As3+的敏感性顯著增強。

圖2　arsB基因敲除菌株的生長曲線和最小抑菌濃度測定Fig. 2 Comparison of grow th and m inimal inhibitory concentration between arsB mutant strain and w ild strain E. coli MC4100. （A） Comparison of grow th between arsB mutant strain and w ild strain. The arsB mutant （square） and the w ild strain E. coli MC4100 （circle） were grown in LB medium. The cell density of each was measured every other hour. （B） Determ ination of m inimal inhibitory concentration. The arsB mutant （square） and the w ild strain E. coli MC4100 （circle） were grown in LB medium containing various concentrations of arsenite. The cell density of each was measured after 9 hours and the OD values at 600 nm were plotted. The values±s） shown are the average of at least three independent measurements.

2.4檢測菌株對As3+的孵育時間實驗

蛋白表達和成熟需要經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾過程，而且熒光蛋白發(fā)出熒光信號需要經(jīng)過熒光信號的成熟過程，所以有必要對傳感器的最佳孵育時間進行摸索。用不同終濃度的 As3+溶液誘導此傳感器，在不同時間點測定EGFP熒光信號。圖3結(jié)果表明，在0-6 h內(nèi)，隨著誘導時間的延長，無論是低濃度還是高濃度的 As3+，其誘導的 EGFP熒光信號都逐漸增強，在6 h時基本達到最高點后，熒光強度逐漸減弱。由于傳感器在實際應用中檢測時間的長短是一個重要考慮因素，本研究采用4 h作為誘導時間，因為誘導4 h的熒光信號強度也已達到最強熒光信號的70%-80%以上，基本滿足檢測需求。

2.5檢測菌株檢測As3+的線性范圍確定

圖3　As3+檢測菌株的孵育時間實驗Fig. 3 Optim ization of incubation time for the strains induced by arsenite in LB medium.

arsB砷外排泵基因敲除之后，能夠減少細菌內(nèi)砷離子的主動胞外轉(zhuǎn)運，可以增加對砷的敏感性 （圖2B）。因此，我們進行檢測菌株檢測As3+的線性范圍的摸索和確定。如圖 4所示，以As3+濃度為橫坐標，AFU值為縱坐標作圖，并進行曲線擬合。結(jié)果顯示，經(jīng)過4 h誘導后，野生型砷檢測菌株的線性回歸方程為 y=664.66 + 619.43 log（x），R2= 0.993 5，此時檢測線性范圍為 0.13×10-6-42.71×10-6mol/L。相比之下，arsB基因敲除型檢測菌株的線性回歸方程為y=1 002.8 + 824.79 log（x），R2= 0.994 6，對應的線性檢測范圍為0.013×10-6-42.71×10-6mol/L。這表明在保證良好的線性擬合條件下，arsB基因敲除型檢測菌株具有更低的檢測下限。圖中也可以看出 arsB基因敲除型檢測菌株對 As3+具有更高的熒光信號響應度。

圖4　檢測菌株檢測As3+的線性范圍Fig. 4 The linear range of arsB mutant strain （circle）and w ild strain E. coli MC4100 （square） detecting arsenite ions. A fter 4 h incubation w ith various concentration of arsenite ions in LB medium， the linear equations and concentration range were obtained.

2.6檢測菌株對 As3+的最低檢測限 (LOD)的確定

為進一步驗證 arsB基因敲除的檢測菌株是否對 As3+具有更低的檢測極限 （LOD），我們檢測了兩種菌株的最低檢測限。根據(jù)實驗結(jié)果計算得出，pET28b-Pars-arsR-egfp/arsB–菌株對 As3+的LOD值為5.13×10-9mol/L或3.843×10-4mg/L，pET28b-Pars-arsR-egfp/MC4100 菌株對As3+的LOD值為126.1×10-9mol/L或94.47×10-4mg/L。如圖5所示，arsB基因敲除型檢測菌株對As3+具有更低的檢測下限，其最低檢測限大約只有野生型檢測菌株的 4%，證明 arsB基因敲除型檢測菌株在實際應用中能夠檢測到更低的 As3+濃度。

2.7檢測菌株對As3+的特異性實驗

圖5　檢測菌株的最低檢測限對比圖Fig. 5 Comparison of the lim it of detection between arsB mutant strain （white column） and w ild strain E. coli MC4100 （grey column） containing the arsenite induced egfp expression plasm id.

從以上結(jié)果得知，arsB基因敲除型檢測菌株對 As3+的檢測具有更低的檢測下限和響應度，具有更好的實際應用前景?？紤]到傳感器對待測物質(zhì)的特異性檢測是其實際應用的前提，為驗證我們構(gòu)建的 arsB基因敲除型檢測菌株是否具有較高的特異性，我們加入等體積 （10 μL）不同種類的金屬離子 （As3+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Hg2+、Ni2+、Co2+），終濃度分別為0.5、5、10 μmol/L，對構(gòu)建成功的檢測 As3+微生物傳感器進行誘導，并用等體積無菌 M illiQ H2O作為陰性對照，檢測其特異性。將 As3+的AFU值定義為 100%，并以其他各金屬離子的AFU值與As3+AFU值的百分比表示對各金屬離子選擇的特異性。結(jié)果表明 （圖 6），無論是高濃度還是低濃度的金屬離子，只有 As3+能誘導此傳感器產(chǎn)生熒光，其他金屬對其熒光表達的干擾性非常弱 （均低于10%），證明此傳感器特異性良好。

2.8傳感器對檢測樣品中As3+的回收實驗

微生物傳感器的構(gòu)建和優(yōu)化的最終目的是將其運用到實際應用中，所以我們將構(gòu)建的As3+檢測菌株進行了河水樣品的加標回收率評估實驗。表 2可以看出，以電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 （ICP-MS） 檢測的結(jié)果作為金標準，構(gòu)建的 As3+檢測菌株對河水樣品中的 As3+檢測回收率基本在 80%以上，表明此傳感器具有較為良好的檢測水體中砷離子的應用前景。

圖6　檢測菌株的特異性實驗Fig. 6 Specificity test of arsenite detecting strain. Fluorescence intensity of arsB mutant strain containing the arsenite induced egfp expression plasm id were measured after incubation w ith various metals at the concentration of 0.5， 5， 10 μmol/L for each. A ll of the cell numbers were normalized to OD600=0.2 before the tests.

表2　傳感器對檢測樣品中As3+的加標回收率Tab le 2 Spike-recovery tests of arsenite detecting strain

3　討論

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，水體中砷污染問題日趨嚴重，因此砷離子的檢測尤為重要。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法如ICP-MS、冷原子吸收法等，需要專業(yè)設備，成本高，且操作比較繁瑣，由于微生物傳感器因其簡便、快速、低廉、易推廣等優(yōu)點，近年來得到快速發(fā)展，例如檢測鉛［18］、砷［19］。本研究構(gòu)建的生物傳感器可通過熒光信號強度直觀、特異地反映水體中的 As3+濃度，操作簡便，是傳統(tǒng)檢測方法的一個有力補充。

近年來，研發(fā)理想的砷離子檢測微生物傳感器一直處于探索之中［19-20］，然而均存在敏感性差、檢測限高的瓶頸問題。Li等［20］通過將arsR操縱子突變和高通量篩選提高其活性，但其檢測下限較高。胡春霞等［20］以綠色熒光蛋白為報告基因構(gòu)建的環(huán)境砷離子生物檢測體系的檢測范圍為0.2-1.0 μmol/L，還有Huang等構(gòu)建的傳感器［21］，檢測范圍為 10-500 μg/L。Francisco等構(gòu)建了帶有兩個啟動子的位點的檢測元件，降低了報告基因的背景值，改善了砷反應生物傳感器的靈敏度［12］。

很多微生物具有一套消除重金屬毒害的抗性機制，如通過酶參與的氧化還原反應將重金屬轉(zhuǎn)化為毒性較弱的形態(tài) （如借助細胞質(zhì)汞還原酶的催化將汞離子還原成毒性較弱的金屬汞）［22］。但是微生物對砷的利用是通過氧化還原反應將其從砷酸鹽轉(zhuǎn)化為毒性更強的亞砷酸鹽，然后借助特殊的砷轉(zhuǎn)運蛋白將其從細胞中轉(zhuǎn)運出去，導致野生型大腸桿菌對砷離子檢測的敏感度不高［10］。本研究通過基因敲除技術(shù)將大腸桿菌基因組上合成砷外排泵的基因 arsB敲除，從而使進入菌體內(nèi)的砷離子不能有效排出，其敏感性提高了30多倍 （圖2B）。而且，利用arsB敲除菌株作為砷檢測元件的宿主菌體，其對 As3+的最低檢出下限是野生型菌株最低檢出限的1/25，可低至5.13×10-9mol/L （3.843×10-4mg/L）。

自然界水體環(huán)境中，砷離子主要以三價砷（As3+） 和五價砷 （As5+） 的形式存在，其中三價砷的毒性更大［23］，故本文主要采用 As3+為檢測對象，對構(gòu)建的砷離子傳感器進行優(yōu)化和評估。事實上，本文構(gòu)建的砷離子傳感器同樣能夠?qū)s5+進行有效檢測 （數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），只是達到最高熒光信號強度的孵育時間比 As3+略久。這主要是因為進入菌體中的As5+需要先通過ArsC還原成 As3+才能被砷離子檢測元件檢測到。我們將進一步對其檢測 As5+或總砷的條件和參數(shù)進行優(yōu)化和確定，使其能得到更廣泛的應用。

本研究構(gòu)建的 As3+檢測傳感器的線性檢測范圍為0.013-42.71 μmol/L。相比以往的砷檢測微生物傳感器，此傳感器檢測限更低，檢測范圍更寬，準確性良好，在檢測重度砷污染環(huán)境具有較大優(yōu)勢，呈現(xiàn)出較好的應用前景。后續(xù)還需不斷的深入探索，對該傳感器進行進一步優(yōu)化，比如在已經(jīng)構(gòu)建好的質(zhì)粒上，進行多個完整檢測元件的串聯(lián)，以極大提高傳感器檢測靈敏度，從而進一步縮短相應的檢測時間，以推進微生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測領域的應用。

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（本文責編 陳宏宇）

Construction of an Escherichia coli strain for sensitive detection of arsenite ion in water

Wu Wang*, Songjun Ji*, Zhaozhu Huang, Binbin Lu, and Jianxin Lü

Zhejiang Provincial Key Laboratory for Technology and Application of Model Organisms， School of Laboratory Medicine and Life Science， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， Zhejiang， China

In order to construct an Escherichia coli strain with high sensitivity and specificity to detect arsenic ion using fluorescence as reporter， a sensitive strain to arsenic ion was obtained by knocking out the gene arsB that acts as an arsenicefflux pump. The pET28b vector containing arsenite detecting cassette Pars-arsR-egfp was constructed and then transformed into arsB deleted mutant. Measuring conditions of this constructed whole-cell biosensor were optimized and its linear concentration range， limit of detection and specificity were determined. This modified biosensor was much more sensitive than that using w ild-type strain as host. The optimal detection range of As3+concentration was 0.013 to 42.71 μmol/L， and the lim it concentration of detection was as low as 5.13 nmol/L. Thus we successfully improved the sensitivity of arsenite detecting biosensor by modification of E. coli genome， which may provide useful strategies for development and optimization of microbial sensors to detect heavy metals.

January 7， 2016； Accepted: March 24， 2016

Jianxin Lü. Tel/Fax: +86-577-8668-9805； E-mail: jxlu313@163.com

arsenite ion detection， Escherichia coli， arsB gene， gene knock-out， sensitivity

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China （863 Program） （No. 2014AA06A514）， Special Research Fund for Non-profit Sector of Zhejiang Province （No. 2016C33027）.

*These authors contributed equally to this study.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 （863計劃） （No. 2014AA06A514），浙江省公益技術(shù)研究項目 （No. 2016C33027） 資助。