李慧芝，康振，李江華，周景文，堵國(guó)成

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 2141222 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

生物育種與工藝優(yōu)化

常壓室溫等離子體誘變扭脫甲基桿菌AM1高產(chǎn)吡咯喹啉醌

李慧芝1，2，康振1，2，李江華1，2，周景文1，2，堵國(guó)成1，2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122
2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

李慧芝， 康振， 李江華， 等. 常壓室溫等離子體誘變扭脫甲基桿菌 AM1高產(chǎn)吡咯喹啉醌. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1145-1149.

Li HZ， Kang Z， Li JH， et al. Heterologous expression and characterization of Klebsiella oxytoca lysine decarboxylase. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1145-1149.

吡咯喹啉醌 （Pyrroloquinoline quinone，PQQ） 作為一種新型的氧化還原酶輔酶，在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。為改善扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquens AM1 PQQ生產(chǎn)性能，采用常壓室溫等離子體 （Atmospheric and room temperature plasma， ARTP） 進(jìn)行誘變，結(jié)合高通量快速篩選方法，得到以PQQ產(chǎn)量為指標(biāo)的正向突變株。ARTP誘變的菌株正突變率為31.6%，篩選得到的較優(yōu)正突變株M. extorquens AM1 （E-F3），PQQ產(chǎn)量達(dá)到54.0 mg/L，是出發(fā)菌株的近3倍。系統(tǒng)的高通量方法篩選ARTP誘變菌為后續(xù)進(jìn)一步提高M(jìn). extorquens AM1菌株P(guān)QQ的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)，亦為改善菌株生產(chǎn)性能提供了新思路。

常壓室溫等離子體，吡咯喹啉醌，高通量篩選，正向突變

吡咯喹啉醌 （Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸之后發(fā)現(xiàn)的第 3類氧化還原酶的輔酶［1-2］，能通過(guò)參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)酶的活性［3］。PQQ是高水溶性、熱穩(wěn)定性分子，具有強(qiáng)大的抗氧化活性［4］，是當(dāng)今科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

誘變育種是菌種改良的重要手段［5］，針對(duì)傳統(tǒng)誘變方法的低突變率和操作安全性不足等問(wèn)題［6］，研究人員發(fā)展了新型常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma， ARTP）誘變技術(shù)［7］。目前ARTP誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于40多種微生物，包括細(xì)菌、真菌及微藻等［8-9］。

扭脫甲基桿菌M. extorquens AM 1的PQQ合成能力強(qiáng)［10］，且具備已知的全基因組序列信息，對(duì)于菌株P(guān)QQ合成的代謝工程研究具有重要意義。目前生物發(fā)酵法是PQQ合成的主要研究方向［11］，因此篩選PQQ高產(chǎn)菌株是實(shí)現(xiàn)PQQ工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的前提。本研究以M. extorquens AM 1為研究對(duì)象，結(jié)合高通量篩選手段，建立快速篩選PQQ高產(chǎn)誘變株的方法，為今后逐步實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)PQQ奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

扭脫甲基桿菌M. extorquens AM 1為本研究的出發(fā)菌株；M. extorquens AM 1 （E-F3） 為本研究獲得的誘變株。

1.1.2培養(yǎng)基

Mex培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g/L，K2HPO42.12 g/L，Methylamine·HCl 6.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl2·2H2O 10 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 0.5 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L。

改良LB培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中按照Mex培養(yǎng)基添加相同濃度 MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、 FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O。

1.1.3主要試劑和儀器

Methylamine·HCl購(gòu)自Sigma A ldrich公司；其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

本研究所用儀器主要有：ARTP誘變育種儀（無(wú)錫源清天木生物科技有限公司）；QPix 420微生物篩選系統(tǒng) （Molecular Devices公司）；BioTek Cytation 3酶標(biāo)儀 （美國(guó)BioTek公司）。

1.2培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)條件：M. extorquens AM 1進(jìn)行菌種活化后挑取單菌落接種于Mex培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)72 h。

搖瓶發(fā)酵條件：取種子培養(yǎng)物接種于Mex培養(yǎng)基中，接種量為 10% （V/V），30 ℃、220 r/m in發(fā)酵培養(yǎng)6-7 d。

發(fā)酵罐發(fā)酵條件：3 L發(fā)酵罐裝液量1.5 L，接種量10% （V/V），攪拌轉(zhuǎn)速600 r/m in，通氣比1 vvm，30 ℃發(fā)酵7-8 d。

1.3ARTP誘變方法

誘變菌液制備和預(yù)處理方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［5］。

1.4高通量篩選

將誘變單菌落轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中的Mex培養(yǎng)基中，900 r/m in、30 ℃培養(yǎng)72 h；再以10%接種量轉(zhuǎn)接到48孔深孔板中，900 r/min、30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)4-5 d。

1.5分析方法

1.5.1菌體生長(zhǎng)情況測(cè)定

取1 m L發(fā)酵液，測(cè)定吸光值OD600。

1.5.2胞外PQQ測(cè)定

檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［12］。

1.5.3誘變致死率和突變率計(jì)算

致死率及突變率計(jì)算方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［5］和［8］。

1.5.4遺傳穩(wěn)定性分析

為分析正向突變株的遺傳穩(wěn)定性，分別進(jìn)行4代和6代傳代培養(yǎng)，并分析正突變株的菌體生長(zhǎng)情況和PQQ產(chǎn)量變化。

2　結(jié)果與分析

2.1ARTP誘變致死率曲線測(cè)定

如圖1所示，ARTP處理85 s后致死率趨于穩(wěn)定達(dá)到100%，但處理65 s出現(xiàn)致死率下降的折點(diǎn)。故本研究在避開(kāi)折點(diǎn)的前提下選擇致死率在 95%以上的處理時(shí)間，即80-95 s處理菌株，以方便后續(xù)的高通量篩選。

2.2高通量快速初篩突變株

圖1　扭脫甲基桿菌的致死率曲線Fig. 1 The lethal rate curve of the M. extorquens AM 1.

圖2　基于48孔板的高通量篩選結(jié)果 （*A1為野生菌，圖中字母A-I分別編碼48孔深孔板初篩結(jié)果的熱圖，每個(gè)小圖中字母A-H為孔板豎排編號(hào)，數(shù)字1-6為孔板橫排編號(hào)）Fig. 2 Results of high-throughput prelim inary screening.

表1　較優(yōu)正突變株初篩結(jié)果Table 1 Prelim inary screening results of excellent positive mutant strains

初篩結(jié)果如圖2所示，其中較優(yōu)正突變株初篩結(jié)果見(jiàn)表1。以PQQ產(chǎn)量為指標(biāo)，對(duì)近500株誘變菌的初篩結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌株突變率為49.8%，其中正突變率為31.6%?？梢?jiàn)ARTP誘變方法得到的菌株正突變率較高。由表 1可知，對(duì)M. extorquens AM 1首次嘗試ARTP誘變初篩效果良好，較優(yōu)菌株P(guān)QQ產(chǎn)量提高在120%以上。根據(jù)圖2選擇PQQ產(chǎn)量提高較明顯的7株突變株進(jìn)行后續(xù)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.3較優(yōu)正突變株搖瓶復(fù)篩

誘變菌株的搖瓶復(fù)篩結(jié)果如圖3所示。由圖可知，正突變株P(guān)QQ產(chǎn)量均比出發(fā)菌株高，其中E-F3 的 PQQ產(chǎn)量提高最明顯，PQQ搖瓶產(chǎn)量達(dá)到6.3 mg/L，比出發(fā)菌株提高142.3%。

2.4遺傳穩(wěn)定性分析

為分析正突變株的遺傳穩(wěn)定性，選擇上述得到的較優(yōu)正突變株E-E2和E-F3進(jìn)行傳代發(fā)酵 （表2）。從表2可知，從菌體生長(zhǎng)情況看，上述兩株誘變菌進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中期的時(shí)間較野生菌長(zhǎng)，可能是ARTP誘變的不定向性，引起的負(fù)面影響。以PQQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)誘變得到的M. extorquens AM 1突變株P(guān)QQ產(chǎn)量波動(dòng)幅度較小，能保持良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5正突變株E-F3分批發(fā)酵

M. extorquens AM 1野生菌和正突變株E-F3發(fā)酵結(jié)果分別如圖4A和圖4B所示。

比較圖4A和圖4B，發(fā)現(xiàn)M. extorquens AM 1出發(fā)菌株在發(fā)酵156 h，發(fā)酵液中PQQ積累量達(dá)到最大值，約為18.0 mg/L；E-F3發(fā)酵168 h達(dá)到最大值，約為54.0 mg/L，是出發(fā)菌株的3倍?？梢?jiàn)，經(jīng)ARTP誘變后，PQQ產(chǎn)量有明顯提高。

圖3　較優(yōu)正突變株復(fù)篩結(jié)果 （*虛線代表野生菌產(chǎn)量值）Fig. 3 PQQ yield of excellent positive mutant strains.

表2　突變菌的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of mutant strains

圖4　M. extorquens AM 1野生菌 （A） 和正突變株E-F3 （B） 的分批發(fā)酵結(jié)果Fig. 4 Batch fermentation of M. extorquens AM 1 （A） and E-F3 （B）.

3　討論

據(jù)報(bào)道食甲基營(yíng)養(yǎng)菌Methylovorus sp. MP688［11］、生絲微菌TH205［13］和假單胞桿菌Pseudomonas sp. 0813［14］產(chǎn)PQQ最高水平分別可達(dá)到 15 mg/L、26.6 mg/L和 448 mg/L?？梢?jiàn)，M. extorquens AM 1菌株在PQQ產(chǎn)量提升方面還有很大進(jìn)步空間。首先，可以嘗試從多次累積誘變或者發(fā)酵工藝優(yōu)化方面來(lái)進(jìn)一步提高 PQQ產(chǎn)量。其次，研究表明，在氧化葡萄糖酸桿菌Gluconobacter oxydans 621H中 過(guò) 量 表 達(dá)pqq ABCDE基因簇，PQQ產(chǎn)量提高了近30倍［15］。由此啟發(fā)我們，可以嘗試調(diào)節(jié)PQQ基因簇中某個(gè)基因的比例或過(guò)量表達(dá)PQQ合成基因簇來(lái)進(jìn)一步提高PQQ產(chǎn)量。最后，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以嘗試將PQQ高產(chǎn)誘變菌中基因的改變，與PQQ生物合成途徑相關(guān)聯(lián)，以進(jìn)一步促進(jìn)PQQ的合成。

REFERENCES

［1］ Duine JA. Cofactor diversity in biological oxidations: implications and applications. Chem Rec， 2001， 1（1）: 74-83.

［2］ Matsushita K， Toyama H， Yamada M， et al. Quinoproteins: structure， functions and biotechnological applications. Appl M icrobiol Biotechnol， 2002， 58（1）: 13-22.

［3］ Kasahara T， Kato T. Nutritional biochemistry: a new redox-cofactor vitamin for mammals. Nature， 2003， 422（6934）: 832.

［4］ Pandey S， Singh A， Kumar P， et al. Probiotic Escherichia coli CFR 16 producing pyrroloquinoline quinone （PQQ）ameliorates 1，2-dimethylhydrazine-induced oxidative damage in colon and liver of rats. Appl Biochem Biotechnol， 2014，173（3）: 775-786.

［5］ Wang FF， Sun PY， Yin HJ， et al. Mutation of alcohol-producing yeast using atmospheric room temperature plasma and the mutant strain characteristic. China Brew， 2013， 32（10）: 117-119 （in Chinese）.

王方方， 孫沛勇， 銀會(huì)娟， 等. 常壓室溫等離子體快速誘變酒精酵母及其突變株的特性研究. 中國(guó)釀造， 2013， 32（10）: 117-119.

［6］ Kurowska M， Labocha-Paw?owska A， Gnizda D， et al. Molecular analysis of point mutations in a barley genome exposed to MNU and gamma rays. Mutat Res， 2012， 738-739: 52-70.

［7］ Wang LY， Huang ZL， Li G， et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitil is using an atmospheric pressure glow discharge plasma. J Appl M icrobiol， 2010，108（3）: 851-858.

［8］ Jin LH， Fang MY， Zhang C， et al. Operating conditions for the rapid mutation of the oleaginous yeast by atmospheric and room temperature plasmas and the characteristics of the mutants. Chin J Biotech， 2011， 27（3）: 461-467 （in Chinese）.

金麗華， 方明月， 張翀， 等. 常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性. 生物工程學(xué)報(bào)， 2011，27（3）: 461-467.

［9］ Zhang X， Zhang XF， Li HP， et al. Atmospheric and room temperature plasma （ARTP） as a new powerful mutagenesis tool. Appl M icrobiol Biotechnol， 2014， 98（12）: 5387-5396.

［10］ Stoddard SF. Bacterial strains for the production of pyrroloquinoline quinone: US， 6511820. 2003-01-28.

［11］ Zhong SS， Liu H， Ge XZ， et al. Optimization of fermentation conditions for pyrroloquinoline quinone expression by Pseudomonas 0813. J Beijing Univ Chem Technol: Nat Sci，2013， 40（5）: 88-92 （in Chinese）.

鐘杉杉， 劉輝， 葛喜珍， 等. 吡咯喹啉醌生產(chǎn)菌的發(fā)酵條件優(yōu)化. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版， 2013， 40（5）: 88-92.

［12］ Gao LL， Du GC， Zhou JW， et al. Characterization of a group of pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenases that are involved in the conversion of L-sorbose to 2-keto-L-gulonic acid in Ketogulonicigenium vulgare WSH-001. Biotechnol Progr， 2013， 29（6）: 1398-1404.

［13］ Xiong XH， Zhi JJ， Yang L， et al. Complete genome sequence of the bacterium Methylovorus sp. strain MP688， a high-level producer of pyrroloquinolone quinone. J Bacteriol， 2011，193（4）: 1012-1013.

［14］ Yin F， Lu B， Chen GH， et al. Study on the production of pyrroloquinoline quinone by using methanol-utilizing bacteria. J East China Univ Sci Technol， 2004， 30（2）: 227-229， 233 （in Chinese）.

尹芳， 陸兵， 陳國(guó)豪， 等. 甲醇利用型細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的培養(yǎng)條件. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 30（2）: 227-229，233.

［15］ H?elscher T， G?erisch H. Knockout and overexpression of pyrroloquinoline quinone biosynthetic genes in Gluconobacter o xydans 621H. J Bacteriol， 2006， 188（21）: 7668-7676.

（本文責(zé)編 郝麗芳）

Mutagenesis of Methylobacterium extorquens AM1 for increasing pyrroloquinoline quinone production by atmospheric and room temperature plasma

Huizhi Li1，2， Zhen Kang1，2， Jianghua Li1，2， Jingwen Zhou1，2， and Guocheng Du1，2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China
2 School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China

As a novel cofactor of oxidoreductase， pyrroloquinoline quinone （PQQ） has a great potential of application in medicine， food industries. In order to improve the efficiency of the PQQ production by Methylobacterium extorquens AM1，the strain was treated by atmospheric and room temperature plasma （ARTP）. Positive mutants with changes in PQQ yield were obtained based on a high-throughput screening approach. After ARTP treatment， analysis data show that the positivemutation rate was 31.6%. Furthermore， we obtained an excellent positive mutant M. extorquens AM 1 （E-F3） w ith the yield of 54.0 mg/L PQQ， which was approximately 3 times as much compared w ith that of the w ild-type strain. The robust high-throughput screening method for mutagenesis by ARTP improves PQQ production. In addition， this method also provides a new strategy for further strain improvement.

December 9， 2015； Accepted： March 24， 2016

Guocheng Du. Tel: +86-510-85918309； E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

atmospheric and room temperature plasma， pyrroloquinoline quinone， high-throughput screening， positive mutation

Supported by： National High Technology Research and Development Program of China （863 Program） （No. 2012AA022103）， National Basic Research Program of China （973 Program） （No. 2014CB745100）， Program for New Century Excellent Talents in University （No. NCET-12-0876）.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 （863計(jì)劃） （No. 2012AA022103），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 （973計(jì)劃） （No. 2014CB745100），新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 （No. NCET-12-0876）資助。