劉程惠,胡文忠,王艷穎,田密霞,孫　錄

(大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

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鮮切生菜致腐霉菌的分離鑒定

劉程惠,胡文忠*,王艷穎,田密霞,孫錄

(大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

對引起鮮切生菜腐敗的霉菌進行分離鑒定。通過形態(tài)學鑒定方法,從鮮切生菜中分離出46株霉菌,其中青霉菌屬(Penicillium)28株,曲霉屬(Aspergillus)13株,枝孢屬(Cladosporium)3株,鐮孢屬(Fusarium)2株。根據(jù)不同屬在不同培養(yǎng)基上的性狀,通過在察氏瓊脂培養(yǎng)基(CA)、察氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)、查氏酵母浸出液加蔗糖培養(yǎng)基(CY20S)、25%甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N)和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)等鑒定培養(yǎng)基上的特征及顯微鏡觀察,將28株青霉菌屬鑒定為三種:橘灰青霉(P.aurantiogriseum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)、草酸青霉(P.oxalicum)。13株曲霉屬鑒定為兩種:泡盛曲霉(A.awamori)、蜂蜜曲霉(A.melleus)。枝孢屬鑒定為一種:枝孢樣枝孢霉(C.cladosporioides)。

鮮切生菜,霉菌,青霉,曲霉,鑒定

鮮切蔬菜(Fresh-cut vegetables)既可保持蔬菜產(chǎn)品的新鮮質(zhì)地和營養(yǎng)價值,又有方便和環(huán)保的特點,具有很大的開發(fā)潛力。但切割加工導致蔬菜原有的組織與細胞結(jié)構(gòu)受到破壞,營養(yǎng)成分隨著細胞液外流,容易招致微生物侵染引起腐敗。蔬菜的pH在5～7,營養(yǎng)成分很適合霉菌的生長,鮮切蔬菜中常見的腐敗霉菌有青霉(Penicillium)、灰色葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、鏈格孢霉屬(Alternaria)、曲霉(Aspergillus)等[1-2]。目前,大多數(shù)關(guān)于鮮切果蔬的研究都是從生理生化變化[3]、抑制褐變[4]和防腐保鮮[5]進行,但對微生物,尤其是致腐霉菌的研究較少。一般情況下致病菌在鮮切果蔬上很少存在,存在的大都是腐敗菌,腐敗菌引起的產(chǎn)品腐敗變質(zhì)會造成巨大的經(jīng)濟損失,也是嚴重制約鮮切產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。因此,對引起鮮切產(chǎn)品腐敗的主要致腐菌進行分離鑒定,研究它們的生長特性及侵染機理并進一步對其防治方法是很有必要的。本研究對鮮切生菜中的致腐霉菌進行分離鑒定,旨在為鮮切生菜的防腐保鮮技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

生菜大連新瑪特超市,選擇新鮮的,無損傷的生菜作為實驗材料。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、CA培養(yǎng)基、CYA培養(yǎng)基、G25N培養(yǎng)基、CY20s培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基,以上培養(yǎng)基的配方及配制方法參照《中國真菌志》[6-7]。

VS-1300超凈工作臺蘇州市蘇信凈化設(shè)備廠;OLYMPUS BX51偏光顯微鏡Philippines公司。

1.2實驗方法

表1　霉菌菌落及分生孢子結(jié)構(gòu)特征Table 1　Characteristics of mold colonies and conidium structure

1.2.1樣品處理新鮮生菜用自來水清洗,切成1 cm細絲,裝入保鮮盒中,保鮮膜封裝,常溫放置2～4 d,準備分菌。切割器具采用200 ppm的次氯酸鈉溶液浸泡10 min清洗消毒。保鮮盒及刀具全部經(jīng)高壓滅菌處理。

1.2.2鮮切生菜中霉菌的分離純化倒混菌平板法[8]:制備鮮切生菜菌懸液,進行10倍梯度稀釋,稀釋倍數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,分別取稀釋液1mL,與已融化并冷卻至50 ℃左右的無菌PDA(含抗生素)混合,搖勻后,倒入培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,制成實驗所需的平板。每個稀釋倍數(shù)做三個平行樣,在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。

平板劃線法:倒混菌平板法培養(yǎng)3～5 d后,用接種環(huán)挑取外觀為絲狀的單菌落,在無菌PDA平板上進行交叉劃線分離得到純菌種。稀釋平板法:28 ℃培養(yǎng)3～5 d。

用接種環(huán)挑取外觀是絲狀的單菌落,三點法接種到CA上進行純化培養(yǎng),重復接種三代。將純化菌種于4 ℃保存。

1.2.3屬的鑒定對純化得到的菌株進行插片培養(yǎng),28 ℃培養(yǎng)3～5 d后進行鏡檢觀察,結(jié)合菌落形態(tài)特征,依據(jù)鑒定文獻[9-11]進行鑒定。

1.2.4種的鑒定將所分離到的青霉菌點接種到CA、CYA、G25N培養(yǎng)基上,在25～28 ℃下培養(yǎng),CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察12 d,CYA、G25N培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察7 d。將分離到的曲霉用三點法接種到CA、CYA、CY20s三種培養(yǎng)基上,在CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察12 d,在CYA和CY20s培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察7 d;將枝孢屬用三點法接種到CA、CMA、CYA三種培養(yǎng)基上,在CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察12 d,在CYA和CMA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察7 d;將鐮孢屬用三點法接種到CA、CYA、CMA三種培養(yǎng)基上,在CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察12 d,在CYA和CMA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)觀察7 d。分別記錄不同菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落大小、顏色、質(zhì)地以及生長速度等特征,在顯微鏡(40倍)中觀察它的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),主要形態(tài)、分生孢子的位置、形狀等特征。

2　結(jié)果與討論

2.1分離純化結(jié)果

按照稀釋平板梯度篩選法,觀察選出46株不同菌落特征的菌株,依次編號,進行屬的鑒定。

2.2屬的鑒定結(jié)果

46株霉菌插片培養(yǎng),對玻片進行鏡檢觀察,結(jié)合菌落特征,參照真菌分類鑒定方法[6,11],分離到4個屬的霉菌,分別是28株青霉屬,13株曲霉屬,3株枝孢屬,2株鐮孢屬。見表1。

2.3青霉菌種的鑒定結(jié)果

依據(jù)Pitt[11]和孔華忠[6]的鑒定文獻,結(jié)合各菌株在CA、CYA、G25N培養(yǎng)基上的菌落特征和鏡檢觀察結(jié)果,根據(jù)菌種在不同培養(yǎng)基上的特性,將28株青霉菌鑒定為3種:橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)、鮮綠青霉(Penicilliumviridicatum)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。具體種的描述如下:

2.3.1橘灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)橘灰青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)見圖1。CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 d,直徑14～18 mm,有少量的放射狀皺紋,菌落近于平坦,質(zhì)地粉末狀兼絨狀,有少許顆粒狀,分生孢子呈藍綠色,中心面上有暗綠色,接近于暗橄欖綠,菌絲體為白色。反面為黃褐色,有褶皺。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑32～42 mm,菌落較平坦,中心有臍狀突起,有較少的放射狀皺紋,質(zhì)地為粉末狀和絨狀。有肉眼可見的幼齡孢梗束,分生孢子結(jié)構(gòu)較多,菌絲體為白色,有滲出液。菌落反面為黃褐色,有褶皺。

G25N培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑34～38 mm,菌落的中心較厚,且有臍狀突起,菌落外沿有少量放射狀,質(zhì)地呈絨狀偶有顆粒狀,分生孢子結(jié)構(gòu)較多,呈黃綠色和藍綠色,菌落背面呈黃褐色,有褶皺。

圖1　橘灰青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.1　Colony characteristic and conidium morphology of P.aurantiogriseum注:(a)、(b)、(c)分別為CA、CYA、G25N培養(yǎng)基上的菌落, (d)為分生孢子頭形態(tài),(e)為分生孢子形態(tài)，圖2，圖3同。

2.3.2鮮綠青霉(Penicilliumviridicatum)鮮綠青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)見圖2。CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 d,直徑16～20 mm,菌落有放射狀褶皺,偶有同心環(huán)紋,質(zhì)地為絨狀兼顆粒狀,分生孢子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生于菌落邊緣,黃綠色,菌絲體為白色,中部略呈黃白色,有少量透明滲出液,菌落背面為黃褐色,有褶皺。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑29～34 mm,菌落中間有臍狀突起,外沿接近平坦,質(zhì)地絨狀偶有顆粒狀,分生孢子結(jié)構(gòu)較多,綠色和黃綠色,菌絲體接近于白色,有大量的滲出液產(chǎn)生,菌落背面為黃褐色,有褶皺。

G25N培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑28～32 mm,菌落表面較為平坦,質(zhì)地為絨狀,也有少許的粉末狀。分生孢子結(jié)構(gòu)不多,呈黃綠色和藍綠色,沒有滲出液產(chǎn)生,菌落背面為黃綠色,無褶皺。

圖2　鮮綠青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.2　Colony characteristic and conidium morphologyof P.viridicatum

2.3.3草酸青霉(Penicilliumoxalicum)草酸青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)見圖3。CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 d,直徑10～14 mm,菌落表面較為平坦,分生孢子易脫落,質(zhì)地為絨狀偶有絮狀。分生孢子較多,呈灰綠色和暗綠色,菌絲體為微黃色,沒有滲出液,菌落背面為橙黃色。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑38～45 mm,菌落接近于平坦,中心有臍狀突起,外沿有少許放射紋,分生孢子易脫落,質(zhì)地為絨狀偶有絮狀,分生孢子結(jié)構(gòu)較多,呈暗綠色和灰綠色,菌絲體為白色和近于白色,也有的在表面中心呈灰黃色,幾乎沒有滲出液,菌落反面為綠褐色。

G25N培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑28～34 mm,菌落質(zhì)地為絨狀,中心有臍狀突起,其它部分較為平坦,偶有放射紋。分生孢子產(chǎn)量較大,呈暗綠色,沒有滲出液產(chǎn)生,菌落背面有部分粉黃色,略帶淡綠色。

圖3　草酸青霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.3　Colony characteristic and conidium morphologyof P.oxalicum

2.4曲霉菌種的鑒定結(jié)果

根據(jù)菌種在不同培養(yǎng)基上的特性[7],將13株曲霉菌歸為2種:泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)。

2.4.1泡盛曲霉(Aspergillusawamori)泡盛曲霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)見圖4。CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,菌落生長迅速,直徑達到35～38 mm左右,菌落有輻射狀溝紋,較為平坦。質(zhì)地為絮狀和絨狀,分生孢子產(chǎn)量很大,在菌落邊緣較密集,呈灰褐色近于黑色。分生孢子頭開始時呈輻射形,漸漸疏松且成為圓柱狀結(jié)構(gòu)。分生孢子呈球形,壁平滑,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層。菌落背面呈黃褐色,有明顯的褶皺。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑55～59 mm,生長速度很快,有很明顯的輻射狀溝紋,質(zhì)地為絨狀,分生孢子產(chǎn)量較大,呈深褐色和黑色,沒有滲出液產(chǎn)生,菌落背面中心呈紫褐色,四周是灰黃色。

CY20S培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑60～64 mm,菌落較為平坦,略有輻射狀溝紋,質(zhì)地為絨狀,分生孢子結(jié)構(gòu)產(chǎn)量很大,呈暗褐色和黑色,沒有氣味,沒有滲出液產(chǎn)生,菌落背面呈橙黃色和黃褐色。

圖4　泡盛曲霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.4　Colony characteristic and conidium morphologyof A.awamori注:(a)、(b)、(c)分別為CA、CYA、CY20S培養(yǎng)基上的菌落, (d)為分生孢子頭形態(tài),(e)為分生孢子形態(tài)，圖5、圖6同。

2.4.2蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)蜂蜜曲霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)見圖5。CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 d,直徑30～35 mm,質(zhì)地為顆粒狀和絮狀,氣生菌絲少,初為粉紅色,后成為黃色并有光澤。分生孢子結(jié)構(gòu)較少,中心相對較多,沒有滲出液產(chǎn)生,分生孢子頭近球形,直徑約200 μm,漸漸發(fā)展成柱狀體。頂囊為球形,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層。菌落背面為淺褐色,有明顯褶皺。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,直徑45～52 mm,質(zhì)地為顆粒狀兼絨狀。菌落有少量的放射狀溝紋,中心略有突起,產(chǎn)生大量菌核,呈紅褐色。分生孢子結(jié)構(gòu)很少,中心較多,為淺黃色。沒有氣味,沒有滲出液。菌落背面為紫紅色,有皺紋。

CY20S培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d,菌落中部較厚,直徑為50～60 mm,質(zhì)地為絮狀兼顆粒狀,分生孢子結(jié)構(gòu)較多,呈蜜黃色,邊緣的分生孢子逐漸減少。沒有滲出液,具有輕微霉味,菌落反面為黃褐色,有褶皺。

圖5　蜂蜜曲霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.5　Colony characteristic and conidium morphologyof A.melleus

2.5枝孢屬菌種的鑒定結(jié)果

根據(jù)菌種在不同培養(yǎng)基上的特性[12],將3株枝孢屬鑒定為枝狀枝孢(Cladosporiumcladosporioides),見圖6。

CA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 d,直徑15～20 mm,質(zhì)地絨狀和粉末狀。菌落呈淡綠色,由中間到外沿綠色逐漸加深。氣生菌絲比較暗,直徑約為4.5～8.2 um,菌落背面為黑綠色,無氣味,無滲出液。

CYA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d,直徑18～22 mm,質(zhì)地主要為粉末狀。菌落呈橄欖綠色,菌絲無色,直徑為5.5～8.5 μm,分生孢子不膨大,較平滑。沒有滲出液,沒有氣味,菌落背面呈黑綠色,有褶皺。

CMA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d,直徑17～19 mm,質(zhì)地為粉末狀,有少許絨狀。菌落呈橄欖綠色,氣生菌絲較暗,直徑約為4.2～8.5 μm,分生孢子梗不分枝,產(chǎn)孢后不再延伸,不膨大,具有孢痕。沒有滲出液,沒有氣味,菌落背面為黑綠色,有褶皺。

圖6　枝孢樣枝孢霉的菌落特征及分生孢子形態(tài)Fig.6　Colony characteristic and conidium morphologyof C.cladosporioides

3　結(jié)論

從鮮切生菜中分離鑒定得到青霉菌屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、鐮孢屬(Fusarium)四個屬,其中青霉菌占大多數(shù),分別為橘灰青霉(P.aurantiogriseum)、鮮綠青霉(P.viridicatum)、草酸青霉(P.oxalicum)。曲霉屬鑒定為兩種:泡盛曲霉(A.awamori)、蜂蜜曲霉(A.melleus)。枝孢屬鑒定為一種:枝孢樣枝孢霉(C.cladosporioides)。霉菌在蔬菜表面破損處繁殖,侵入蔬菜組織后,組織壁的纖維素先被破壞,進而果膠、蛋白質(zhì)、有機酸、糖類被分解,繼而酵母菌和細菌開始繁殖[13]。由于生菜經(jīng)過切割后,組織被破壞更容易招致霉菌侵染,霉菌大量繁殖導致蔬菜外觀有深色的斑點,組織變得松軟、發(fā)綿、凹陷、變形,逐漸變成漿液狀甚至水液狀,并產(chǎn)生霉腐氣味。因此,鮮切生菜霉菌的研究顯得更加重要,本實驗為鮮切生菜貯藏過程中微生物病害防治提供了參考依據(jù)。

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Isolation and identification of spoilage molds from fresh-cut lettuce

LIU Cheng-hui,HU Wen-zhong*,WANG Yan-ying,TIAN Mi-xia,SUN Lu

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600)

The spoilage molds which cause fresh-cut lettuce corruption were identified. According to morphological character method,46 strains of molds were isolated from fresh-cut lettuce,in which there were 28Penicilliumstrains,13Aspergillusstrains,3Cladosporiumstrains and 2Fusariumstrains. The different molds were identified by the cultivation characters and microscopic examination in different medium including CA,CYA,CY20S,G25N,and CMA. The results showed that 3 kinds ofPenicilliumwere identified,includingP.aurantiogriseum,P.viridicatum,P.oxalicum. 2 kinds ofAspergilluswereA.awamoriandA.melleus. 1 kind ofCladosporiumwasC.cladosporioides.

fresh-cut lettuce;mold;Penicillium;Aspergillus;identification

2015-06-05

劉程惠(1979-)，女，博士研究生，研究方向：食品科學與工程，E-mail:liuchenghui@dlnu.edu.cn。

胡文忠(1959-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資助項目(DC201502020402)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0135-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.020