劉　佳,　張勻華,　孟慶林,　石鳳梅,馬立功,　李易初,　劉春來(lái),　左豫虎

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶　163319; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 哈爾濱　150086)

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黑龍江地區(qū)向日葵核盤(pán)菌致病性分化研究

劉佳1,2,張勻華2,孟慶林2,石鳳梅2,馬立功2,李易初2,劉春來(lái)2,左豫虎1*

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶163319; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 哈爾濱150086)

本文對(duì)黑龍江省的100株向日葵核盤(pán)菌(39個(gè)親和組)的致病力、菌落生長(zhǎng)速率、草酸產(chǎn)量及總酸產(chǎn)量(pH)進(jìn)行了測(cè)定,并分析了菌株致病力與菌落生長(zhǎng)速率、草酸產(chǎn)量及總酸產(chǎn)量(pH) 3個(gè)因子的相關(guān)性。結(jié)果表明: 菌株的致病力與草酸產(chǎn)量成正相關(guān)(r=0.758,P<0.01);與總酸產(chǎn)量(pH)之間成負(fù)相關(guān)(r=-0.794,P<0.01);草酸產(chǎn)量與總酸產(chǎn)量(pH)之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.639,P<0.01)。

核盤(pán)菌;致病性;向日葵;相關(guān)性

(1.HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China; 2.InstituteofPlantProtection,HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)

核盤(pán)菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)deBary]是一種世界性分布的病原真菌,寄主范圍非常廣,能對(duì)油菜、向日葵、大豆、胡蘿卜、擬南芥等超過(guò)400種作物造成不同程度的危害[1]。歷史上菌核病曾導(dǎo)致中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)向日葵[2]、愛(ài)爾蘭馬鈴薯[3]、加拿大豆類作物[4]大面積受侵染,尤其是1985年-1987年間,我國(guó)黑龍江省的一般地塊向日葵菌核病發(fā)病率達(dá)到30%～60%,嚴(yán)重地塊達(dá)到90%以上,甚至絕產(chǎn)[5],造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2009年—2014年,黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所對(duì)黑龍江省向日葵產(chǎn)區(qū)菌核病的發(fā)生情況進(jìn)行了連續(xù)6年的實(shí)地調(diào)查,結(jié)果顯示菌核病的年平均發(fā)病率在30%～50%,有些地塊發(fā)病率達(dá)到80%以上。對(duì)于這種具有廣泛地理分布的病原菌種群內(nèi)是否存在致病性分化,前人已有一些研究,有報(bào)道表明不同核盤(pán)菌菌株的致病性沒(méi)有質(zhì)的分化,也有學(xué)者認(rèn)為該病原菌種群內(nèi)不同菌株間存在致病性分化[6-9]。本研究?jī)H對(duì)黑龍江省內(nèi)的100株核盤(pán)菌(39個(gè)親和組)的致病力、菌落生長(zhǎng)速率、草酸及總酸含量進(jìn)行測(cè)定,并探討菌株致病力與菌落生長(zhǎng)速率、草酸產(chǎn)量及總酸產(chǎn)量(pH)3個(gè)因子間的相關(guān)性,明確黑龍江省內(nèi)核盤(pán)菌種群內(nèi)是否存在致病性分化,以及這種分化與菌株來(lái)源是否有關(guān),從而為黑龍江省向日葵菌核病的防治和抗病育種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1核盤(pán)菌菌株致病力測(cè)定

1.1.1供試向日葵品種

抗病品種‘豐葵雜1號(hào)’,由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所免疫室提供 。

1.1.2供試菌株

對(duì)采自黑龍江省10個(gè)地區(qū)29個(gè)市縣5種寄主的100個(gè)菌株經(jīng)過(guò)菌絲融合群試驗(yàn)進(jìn)行了親和分組測(cè)定,共分成39個(gè)親和組(見(jiàn)表1)。

1.1.3菌株培養(yǎng)

將活化好的核盤(pán)菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基上,放于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),待菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑的80%時(shí)備用。

1.1.4離體葉片法測(cè)定核盤(pán)菌對(duì)‘豐葵雜1號(hào)’的致病性

取長(zhǎng)方形塑料盤(pán),用75%乙醇棉擦拭盤(pán)面,在盤(pán)底部鋪兩層滅菌的濕潤(rùn)濾紙。取苗齡為30d、長(zhǎng)勢(shì)及面積較為一致的‘豐葵雜1號(hào)’葉片,自來(lái)水沖洗干凈,用吸水濾紙吸干葉片上多余水分,然后將葉片均勻地置于塑料盤(pán)內(nèi)濕潤(rùn)濾紙上,葉片背面朝上。用打孔器在菌落的邊緣打取直徑4mm的菌絲塊接種在葉片主葉脈的兩側(cè),每處理3個(gè)葉片,每個(gè)葉片接種1個(gè)菌絲塊,以沒(méi)有接菌的瓊脂塊作為對(duì)照。接種后,用保鮮膜封住塑料盤(pán),置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(23～25℃)。48h后觀察發(fā)病情況并拍照,用十字交叉法量取病斑直徑大小。數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析。

表1　親和組所含菌株及來(lái)源Table 1　Strains in mycelial compatibility groups and its source

1.2核盤(pán)菌的不同親和組菌落生長(zhǎng)速率測(cè)定

將純化的菌株接入含50mg/L溴酚藍(lán)(BPB)的PDA平板上,培養(yǎng)2～3d后,于菌落邊緣打取7mm的菌碟,轉(zhuǎn)至含50mg/LBPB的PDA平板的中央,接種后的培養(yǎng)皿用封口膜封好,放于恒溫培養(yǎng)箱中 23～25℃黑暗培養(yǎng)48h后,測(cè)量菌落直徑,各菌株重復(fù)3次,以確定不同菌落生長(zhǎng)速率的差異。

1.3菌株產(chǎn)草酸(OA)能力和pH測(cè)定

于菌落邊緣打取7mm的菌碟,轉(zhuǎn)至30mLPDB中(含2%葡萄糖和0.4%馬鈴薯汁),室溫靜止培養(yǎng)3d。真空抽濾,得到的菌絲體在鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重,并測(cè)得菌絲體的干重。上清液用于OA和pH(用pH計(jì))的測(cè)定。

反應(yīng)液的配制:0.2mL樣品液,0.11mLBPB(1mmol/L),0.198mL硫酸(1mol/L),0.176mL重鉻酸鉀(100mmol/L),4.8mL蒸餾水。

將混合物放入60℃的水浴鍋中,10min后,用0.5mL(1.0mol/L)氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。測(cè)定600nm處的吸光值,以PDB溶液作為對(duì)照。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出OA含量(μg草酸/mg干菌絲)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同親和組核盤(pán)菌致病力測(cè)定結(jié)果

利用菌碟貼接離體向日葵葉片,經(jīng)保濕培養(yǎng),12h后在葉片上出現(xiàn)明顯的水浸狀病斑,隨保濕時(shí)間的延長(zhǎng)病斑生長(zhǎng)迅速。如表2所示,侵染48h后MCG27(46.2mm)和MCG39(45.1mm)的病斑直徑較大;MCG28(37.5mm)和MCG1(34.4mm)的病斑直徑居中;而MCG21(10.8mm)和MCG31(9.0mm)的病斑直徑較小,不同親和組間病斑直徑的變化范圍為9.0～46.2mm,最大差幅達(dá)到37.2mm。經(jīng)過(guò)方差分析可知MCG27和MCG39顯著高于MCG28,及病斑直徑小于MCG28的所有親和組,極顯著高于MCG1,及病斑直徑小于MCG1的所有親和組。另外，通過(guò)測(cè)定結(jié)果可以看出不同親和組間致病力的差異與菌株的地理來(lái)源無(wú)關(guān)。

表2　不同親和組核盤(pán)菌菌株在向日葵葉片上產(chǎn)生的病斑直徑(48 h)1)Table 2　Lesion diameters produced by different MCGs Sclerotinia sclerotiorumstrains on the sunflower leaves 48 hours after inoculation

1) 同列不同小寫(xiě)英文字母代表在0.05水平有顯著差異,不同大寫(xiě)字母代表在0.01水平有極顯著差異;下同。Differentlowercaselettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceat0.05level;differentcapitallettersindicateextremelysignificantdifferenceat0.01level.Thesamebelow.

2.2核盤(pán)菌不同親和組菌落平均生長(zhǎng)速率的差異

供試菌株親和組在PDA(含BPB)培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,菌絲均生長(zhǎng)迅速,但不同親和組之間存在較大差異。如表3所示,培養(yǎng)48h后,MCG24(86.6mm)和MCG26(85.7mm)的菌落直徑較大;MCG32(74.7mm)和MCG19(71.7mm)的菌落直徑居中;而MCG21(22.7mm)和MCG36(23.1mm)的菌落直徑較小,不同親和組群間菌落直徑的差別范圍是22.7～86.6mm,最大差幅達(dá)到63.9mm。經(jīng)過(guò)方差分析可知MCG24和MCG26顯著高于MCG32及菌落直徑小于其的所有親和組;極顯著高于MCG19及菌落直徑小于MCG19的所有親和組。同時(shí)通過(guò)測(cè)定結(jié)果可以看出不同親和組間菌落生長(zhǎng)速率的差異與菌株的地理來(lái)源無(wú)關(guān)。

表3　不同親和組核盤(pán)菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后菌落平均直徑Table 3　Colony diameters of different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs cultured on PDA for 48 hours

2.3菌株親和組產(chǎn)草酸(OA)能力和pH

如表4所示,從菌株親和組間看,MCG31產(chǎn)草酸量最小,為3.84μg/mg干菌絲,MCG39產(chǎn)草酸量最大,為27.56μg/mg干菌絲。親和組間草酸產(chǎn)生能力差別較大,其中MCG39、MCG30、MCG27、MCG22的產(chǎn)草酸量都超過(guò)了20μg/mg干菌絲;MCG36、MCG9、MCG38、MCG31的產(chǎn)草酸量都低于5μg/mg干菌絲。方差分析結(jié)果表明各不同親和組之間存在顯著差異。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生草酸能力的差異不僅出現(xiàn)在親和組間,也出現(xiàn)在親和組內(nèi)。

表4　不同親和組核盤(pán)菌菌株在PDB培養(yǎng)液中草酸產(chǎn)量Table 4　Oxalic acids production produced by different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs in PDB media

菌株在液體培養(yǎng)的過(guò)程中除產(chǎn)生草酸外,還可能產(chǎn)生其他未知酸類物質(zhì),致使培養(yǎng)液的pH產(chǎn)生很大的變化。由表5可知,接入菌后培養(yǎng)液的pH最小達(dá)到了3.64(MCG39),最高為4.83(MCG31),經(jīng)測(cè)定未接入菌碟前原始培養(yǎng)液(CK)的平均pH為5.03。如果利用pH的變化來(lái)衡量親和組間產(chǎn)生的總酸產(chǎn)量時(shí),在不同親和組間總酸的產(chǎn)量也呈現(xiàn)出顯著性差異,方差分析結(jié)果表明，MCG31、MCG9、MCG38和MCG10的pH顯著高于MCG1及pH小于MCG1的所有親和組;極顯著高于MCG26及pH小于MCG26的所有親和組。

表5　不同親和組核盤(pán)菌菌株在PDB培養(yǎng)液中產(chǎn)生的總酸量Table 5　Total acid production produced by different Sclerotinia sclerotiorum strains of MCGs cultured in PDB media

2.4與致病力有關(guān)的3個(gè)因子的相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)與致病力有關(guān)的菌落生長(zhǎng)速率、草酸產(chǎn)量及總酸產(chǎn)量(pH)3個(gè)因子進(jìn)行相關(guān)性分析表明,菌株的致病力與草酸產(chǎn)量成正相關(guān)(r=0.758,P<0.01);與總酸產(chǎn)量(pH)之間成負(fù)相關(guān)(r=-0.794,P<0.01);草酸產(chǎn)量與總酸的pH之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.639,P<0.01),證明了 S.sclerotiorum分泌的總有機(jī)酸里主要成分是草酸。

表6　不同菌絲親和組間病斑直徑、菌落生長(zhǎng)速率、草酸量、總酸的相關(guān)性分析1)Table 6　Correlation analysis among lesion diameter of Sclerotinia sclerotiorum isolates, colony growth rate,oxalic acid production and total acid from different MCGs

1)*代表相關(guān)顯著性水平P<0.05;**代表相關(guān)顯著性水平P<0.01。

*: P<0.05;**: P<0.01.

3　結(jié)論與討論

病原物在與寄主共進(jìn)化的過(guò)程中,其致病性也在不斷分化,到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小麥銹菌、黑粉菌、白粉菌,水稻稻瘟病菌等存在致病性分化,而對(duì)于核盤(pán)菌種群內(nèi)有無(wú)致病性分化,迄今尚無(wú)肯定的結(jié)果[10-11]。Anderson等人對(duì)阿根廷160個(gè)S.sclerotiorum菌株的50 個(gè)MCGs在離體芹菜莖接種測(cè)定其致病性的研究中發(fā)現(xiàn),菌絲親和組之間的致病力沒(méi)有差異[12-13];劉春來(lái)對(duì)采集于內(nèi)蒙古和黑龍江省不同地區(qū)的20個(gè)向日葵核盤(pán)菌分離物進(jìn)行了致病性測(cè)定,結(jié)果表明不同來(lái)源核盤(pán)菌菌株間致病性存在著顯著差異,且這種致病性分化與菌株來(lái)源沒(méi)有明顯的相關(guān)性[14],也有學(xué)者指出向日葵核盤(pán)菌菌株在不同寄主上的致病特異性應(yīng)該是它與寄主長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果,它們相互作用的時(shí)間越長(zhǎng),其特異性可能越明顯,同時(shí)在同一寄主上的菌株其致病性也存在分化現(xiàn)象[7]。王玉杰對(duì)不同親和組核盤(pán)菌致病性與草酸、總酸、多聚半乳糖醛酸酶及菌落生長(zhǎng)速率進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明菌株致病力與草酸、多聚半乳糖醛酸酶成正相關(guān),與總酸的pH成負(fù)相關(guān),而與菌落生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)[15]。

本文對(duì)采自黑龍江省10個(gè)地區(qū)29個(gè)市縣5種寄主的100個(gè)菌株(39個(gè)親和組)進(jìn)行了比較研究,親和組間菌落的生長(zhǎng)速率達(dá)到了顯著性差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于同一地區(qū)間、不同地區(qū)間及親和組內(nèi)的菌株菌落生長(zhǎng)速率的差異很大,說(shuō)明菌株的生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出多樣性,并與地理來(lái)源無(wú)關(guān),親和組間致病力的差異未發(fā)現(xiàn)與菌株的地理來(lái)源有關(guān)。通過(guò)相關(guān)性分析表明,菌株的致病力與草酸產(chǎn)量呈正相關(guān),與總酸產(chǎn)量(pH)之間呈負(fù)相關(guān),與菌落的生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān);草酸產(chǎn)量與總酸的pH之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

DifferentiationinpathogenicityofSclerotinia sclerotiorum

onsunflowerinHeilongjiangProvince

LiuJia1,2,ZhangYunhua2,MengQinglin2,ShiFengmei2,MaLigong2,LiYichu2,LiuChunlai2,ZuoYuhu1

Thepathogenicity,colonygrowthrate,oxalicacidproductionandtotalacid(pH)of100sunflowerSclerotinia sclerotiorumstrainsbelongto39mycelialcompatibilitygroupsfromdifferentregionsofHeilongjiangProvinceweremeasured.Thecorrelationbetweenpathogenicityandcolonygrowthrate,oxalicacidproduction,totalacid(pH)wereanalyzed.Theresultsshowedthatlesiondiameterofsunflowerleavesafterinoculationhadapositivecorrelationwithoxalicacid(r=0.758, P<0.01),buthadanegativecorrelationwiththetotalacid(pH)value(r=-0.794, P<0.01).Oxalicacidproductionalsowasnegativelycorrelatedtothetotalacid(pH)value(r=-0.639, P<0.01).

Sclerotinia sclerotiorum;pathogenicity;sunflower;correlation

2014-11-17

2014-12-22

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(向日葵)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-16)

E-mail:zuoyhu@163.com

S435.655

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.021