孫鵬飛，張福艷，吳海靜，朱文眾*

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北衡水老白干釀酒集團(tuán)，河北 衡水 053000）

衡水老白干酒中產(chǎn)酸微生物的分離鑒定及性能研究

孫鵬飛1，張福艷2，吳海靜1，朱文眾1*

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北衡水老白干釀酒集團(tuán)，河北 衡水 053000）

有機(jī)酸是白酒的重要呈味物質(zhì)，也是香味成分的前驅(qū)物質(zhì)。利用氣相色譜和高效液相色譜檢測(cè)出衡水老白干酒中含有乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和乳酸等6種有機(jī)酸。經(jīng)試驗(yàn)在大曲、酒醅中分離得到69株產(chǎn)酸菌，其中具有代表性的醋酸菌1株，乳酸菌4株，丙酸菌2株。對(duì)其中一株主要產(chǎn)酸菌進(jìn)行了16S rDNA鑒定為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），并對(duì)其的產(chǎn)酸特性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，在初始pH值6.5，接種量7%，溫度32℃，培養(yǎng)36 h時(shí)乳酸產(chǎn)量最高，為7.12 mg/mL。

有機(jī)酸；產(chǎn)酸菌；分離鑒定；產(chǎn)酸性能

白酒的化學(xué)成分中98%～99%是水和乙醇，1%～2%是呈香呈味的微量組分［1-2］。微量組分主要包括有機(jī)酸、酯、醇、醛等［3］，由于它們?cè)诎拙浦械姆N類和含量的不同，就形成了不同風(fēng)格、不同香型、不同質(zhì)量的白酒［4-5］。

有機(jī)酸是白酒的重要呈味物質(zhì)，也是白酒香味成分的前驅(qū)物質(zhì)［6-7］，因此沒有酸就形不成酯。適量的酸能對(duì)白酒起到緩沖作用，能使酒體豐滿、協(xié)調(diào)、回味悠長(zhǎng)，在貯存過程中也可以形成酯［8-9］。白酒中的有機(jī)酸主要來自微生物代謝［10-11］。由于采用多菌種開放式發(fā)酵，代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸具有多樣性［12］，且不同類型白酒中有機(jī)酸的含量也不相同［13-14］。

衡水老白干酒中的乳酸和乙酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他酸類［15］，是衡水老白干酒具有的特征之一。衡水老白干酒釀酒大曲中的產(chǎn)酸菌主要來源于周圍環(huán)境、水和原料，并且釀酒過程中采用開放式發(fā)酵方式，因此就形成了與當(dāng)?shù)丨h(huán)境、水源相關(guān)的獨(dú)特產(chǎn)酸菌群，從而決定了衡水老白干酒中有機(jī)酸的含量以及比例與其他香型的不同，形成了老白干酒特有的風(fēng)格。

因此，本研究對(duì)老白干香型的代表衡水老白干酒中有機(jī)酸進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)大曲、酒醅中的產(chǎn)酸菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)主要產(chǎn)酸菌進(jìn)行了初步產(chǎn)酸特性研究。期望對(duì)衡水老白干酒生產(chǎn)中有機(jī)酸的利用以及產(chǎn)酸菌的應(yīng)用控制提供依據(jù)，并為進(jìn)一步研究有機(jī)酸對(duì)衡水老白干酒風(fēng)味的影響有所幫助。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來源

大曲、發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)期的酒醅由衡水老白干釀酒（集團(tuán)）有限公司提供。

1.1.2主要試劑

乳酸、乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、異戊酸、正己酸、辛酸（均為分析純）：天津市復(fù)光精細(xì)化工研究所。

1.1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 3 g，制霉素55 μg/mL。去離子水1 L，pH值調(diào)至7.0。

MRS培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，K2HPO41.5 g，檸檬酸二銨1.5 g，乙酸鈉2 g，吐溫-80 2 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，去離子水1 L，pH值調(diào)至6.2～6.4。

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母膏1 g，3%無水乙醇，去離子水100 mL。pH值調(diào)至7.0。

醋酸菌固體培養(yǎng)基：在醋酸菌液體培養(yǎng)基中加入幾滴溴甲酚紫指示劑并加入1.8%的瓊脂，制平板。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 6820氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；LRH-150B生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1衡水老干酒中有機(jī)酸的定性定量分析

通過氣相色譜直接進(jìn)樣法對(duì)衡水老白干酒中的有機(jī)酸進(jìn)行定性分析。氣相色譜條件：氫火焰離子檢測(cè)器，19091N-236 INNOWAX毛細(xì)管柱（0.25 mm×60 m），載氣（N2）流速為120 mL/min，干燥空氣流速為400 mL/min，氫氣流速為20 mL/min。柱溫采用程序升溫：70℃維持2 min，以4℃/min升溫至250℃維持5 min。進(jìn)樣口溫度為250℃，進(jìn)樣量1 μL。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)氣相色譜不能很好地利用直接進(jìn)樣法測(cè)定酒中的乳酸，因此另用高效液相色譜對(duì)衡水老白干酒中的主要有機(jī)酸進(jìn)行定量測(cè)定。高效液相色譜條件：紫外檢測(cè)器，選用Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm× 7.8 mm），以5 mmol硫酸為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫50℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2產(chǎn)酸菌的富集、分離

取大曲、酒醅各5 g分別加入95 mL無菌生理鹽水中浸泡30 min，振蕩均勻取上清液5 mL加入已滅菌并裝有95 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃恒溫培養(yǎng)36 h。連續(xù)富集2次。

將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于固體培養(yǎng)基上，以好氧和厭氧2種方式在37℃條件下恒溫培養(yǎng)，將由紫變黃變色圈的單菌落挑出，通過平板劃線分離法純化。

1.3.3產(chǎn)酸菌的鑒定

（1）產(chǎn)酸菌菌落形態(tài)鑒定

將分離到的產(chǎn)酸菌接種到固體培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)36 h觀察菌落特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察產(chǎn)酸菌的菌體形態(tài)。

（2）產(chǎn)酸菌的生理生化試驗(yàn)鑒定

依據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)分離到的產(chǎn)酸菌進(jìn)行過氧化氫酶測(cè)定、明膠液化試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣等生理生化試驗(yàn)。

（3）產(chǎn)酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸測(cè)定

將純種產(chǎn)酸菌接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h。取發(fā)酵液5 mL在離心機(jī)上4 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾。用高效液相色譜儀對(duì)產(chǎn)酸菌所產(chǎn)酸進(jìn)行檢測(cè)。

（4）主要產(chǎn)酸菌的16S rDNA鑒定

將主要產(chǎn)酸菌在平板上培養(yǎng)24 h，選取菌落生長(zhǎng)較好的平板，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。將得到的基因組作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR正向引物16SF1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物16SR1：AGAAAGGAGGTGATCCAGCC。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成測(cè)序。并將測(cè)序得到的16S rDNA序列通過NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4主要產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸性能研究

分別以不同的溫度、pH值、接種量為條件，將主要產(chǎn)酸菌接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，高效液相色譜測(cè)定產(chǎn)酸量。

2　結(jié)果與分析

2.1衡水老白干酒中有機(jī)酸定性定量檢測(cè)

通過氣相色譜對(duì)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，不同有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品及衡水老白干酒樣氣相色譜圖見圖1，保留時(shí)間見表1。

圖1　有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）及衡水老白干酒樣（B）氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of organic acids standards（A）and Hengshui LaobaiganBaijiusample（B）

表1　氣相色譜檢測(cè)不同有機(jī)酸保留時(shí)間Table 1 Retention time of different organic acids analysis by GC

通過對(duì)比表1的保留時(shí)間，可以判斷在氣相色譜中檢測(cè)出乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸5種有機(jī)酸。

由于氣相色譜不能很好的利用直接進(jìn)樣法測(cè)定酒中的乳酸，并且在測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)乙酸的重現(xiàn)也不好。因此另用高效液相色譜對(duì)衡水老白干酒中的主要有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。衡水老白干酒樣相色譜圖見圖2，各有機(jī)酸保留時(shí)間、回歸線方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

圖2　衡水老白干酒樣高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Hengshui LaobaiganBaijiusample

表2　高效液相色譜檢測(cè)不同有機(jī)酸保留時(shí)間、回歸線方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Retention times，regression equation and the correlation coefficient of different organic acids analysis by HPLC

由圖2及表2可知，高效液相色譜法檢測(cè)出了衡水老白干酒樣中乳酸、乙酸、丙酸3種有機(jī)酸，通過回歸線方程計(jì)算得乳酸、乙酸和丙酸的含量分別為110.34 mg/100 mL，38.03mg/100mL，1.64 mg/100 mL。由此可知，衡水老白干酒中乳酸含量較高，為主要有機(jī)酸。

2.2產(chǎn)酸菌分離

共分離出69株產(chǎn)酸菌，編號(hào)為1#～69#。其中：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上分離得到40株；MRS固體培養(yǎng)基上分離得到16株；醋酸菌培養(yǎng)基上分離得到13株。

2.3產(chǎn)酸菌鑒定

2.3.1產(chǎn)酸菌的菌落形態(tài)特征

根據(jù)菌落的形態(tài)特征和革蘭氏染色對(duì)菌體形態(tài)的顯微鏡觀察，至少篩選出7種不同形態(tài)的菌株，鏡檢結(jié)果如表3。其中3#、4#、5#3株在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上分離，26#、28#、36#3株在MRS固體培養(yǎng)基上分離，1#在醋酸菌培養(yǎng)基上分離。

表3　產(chǎn)酸菌的菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Table 3 Colony morphology and microscopic results of acid-producing bacteria

由表3的結(jié)果分析可知，7株產(chǎn)酸菌都符合細(xì)菌的形態(tài)特征，1#、4#菌革蘭氏染色為陰性，其他菌革蘭氏染色為陽性；3#、28#菌為球菌，其他為桿菌。

2.3.2產(chǎn)酸菌的生理生化試驗(yàn)鑒定

對(duì)7株產(chǎn)酸菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4　產(chǎn)酸菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of physiological biochemical tests of acid-producing bacteria

由表4的結(jié)果分析可知，1#菌過氧化氫酶陽性，產(chǎn)酸，革蘭氏染色陰性，好氧，符合醋酸菌的特征；4#菌過氧化氫酶陽性，明膠液化陽性，產(chǎn)酸，革蘭氏染色陰性，厭氧，產(chǎn)生大量氣體，符合丙酸菌特征；3#，26#，28#，36#菌過氧化氫酶陰性，產(chǎn)酸，革蘭氏染色陽性，厭氧，不產(chǎn)生氣體，無運(yùn)動(dòng)性，符合乳酸菌特征；5#菌革蘭氏染色陽性，產(chǎn)酸，厭氧，但有運(yùn)動(dòng)性，符合丙酸菌特征。

2.3.3產(chǎn)酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定

以7%的接種量將純種產(chǎn)酸菌接入到液體培養(yǎng)基中，32℃恒溫發(fā)酵48 h。通過高效液相色譜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為1#菌產(chǎn)生乙酸；3#、26#、28#、36#菌產(chǎn)生乳酸并產(chǎn)生少量乙酸；4#、5#菌產(chǎn)生丙酸和乙酸。其中26#菌產(chǎn)乳酸量最大，產(chǎn)酸量為7.08 mg/mL；1#菌產(chǎn)乙酸量最大，產(chǎn)酸量為2.26 mg/mL；4#菌產(chǎn)丙酸量最大，產(chǎn)酸量為0.45 mg/mL。由發(fā)酵液的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果，可以進(jìn)一步確定1#菌為醋酸菌；3#、26#、28#、36#菌為乳酸菌；4#、5#菌為丙酸菌。

2.3.4主要產(chǎn)酸菌的16S rDNA鑒定

選擇產(chǎn)乳酸量最高的26號(hào)菌株進(jìn)行16S rDNA序列鑒定。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將得到的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳條帶單一長(zhǎng)度大約為1 500 bp。

圖3　26#菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplified of strain 26#

16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成測(cè)序，結(jié)果得到1 106個(gè)堿基。將16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，26#菌株與食竇魏斯氏菌M.D.W.YAN2-10相似性為99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中同源關(guān)系近。因此可以鑒定26#乳酸菌為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。

圖4　26#菌株16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain 26#

2.5產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸特性的研究

衡水老干白酒的主要有機(jī)酸成分為乳酸，選產(chǎn)酸量最高的26#菌食竇魏斯氏菌進(jìn)行產(chǎn)酸特性研究。

2.5.1產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)曲線

圖5　產(chǎn)酸菌株26#的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of acid-producing strain 26#

以3%接種量接入液體培養(yǎng)基中，在37℃下靜置培養(yǎng)，每隔4 h取樣，在600 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定OD600nm值，同時(shí)測(cè)定乳酸生成量、pH值，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，該菌開始生長(zhǎng)緩慢，在4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，隨著菌體的迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)酸量迅速增加，pH值也迅速降低，在14 h后生長(zhǎng)基本進(jìn)入穩(wěn)定期，pH值也趨于穩(wěn)定，產(chǎn)酸量在24 h后基本不再變化。最終pH值保持在3.6左右，產(chǎn)酸量達(dá)到4.86 mg/mL。

2.5.2接種量對(duì)產(chǎn)酸量的影響

分別以1%、3%、5%、7%、9%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，在37℃下恒溫培養(yǎng)36 h。對(duì)不同的接種量的產(chǎn)酸情況進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，隨著接種量增加，產(chǎn)酸量先上升后下降，接種量在5%～7%時(shí)產(chǎn)酸量較大，在7%產(chǎn)酸量最大，乳酸含量為5.31 mg/mL。當(dāng)接種量＞7%時(shí)，可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基更多用于菌體生長(zhǎng)，減少了酸的生成。因此最適接種量為7%。

表5　接種量對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of inoculum on lactic acid yield

2.5.3初始pH值對(duì)產(chǎn)酸量的影響

用氫氧化鈉、鹽酸調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，以3%的接種量，在37℃下恒溫培養(yǎng)36 h。對(duì)產(chǎn)酸量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6　初始pH值對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響Table 6 Effect of initial pH on the lactic acid yield

由表6可知，初始pH值為6.5～7.0時(shí)產(chǎn)酸量較高，初始pH值為6.5時(shí)乳酸含量最高達(dá)到5.32 mg/mL。初始pH值≤6.0時(shí)產(chǎn)酸明顯減少，說明在酸性環(huán)境下對(duì)酸的生成有明顯抑制作用。因此最適初始pH值為6.5。

2.5.4溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響

以3%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于22℃、27℃、32℃、37℃、42℃下恒溫培養(yǎng)36 h。對(duì)產(chǎn)酸菌在不同的溫度下培養(yǎng)的產(chǎn)酸量情況進(jìn)行分析，結(jié)果見表7。

表7　溫度對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響Table 7 Effect of temperature on the lactic acid yield

由表7可知，在32～37℃時(shí)產(chǎn)酸量較高。溫度對(duì)產(chǎn)酸量具有明顯的影響，隨著溫度的升高產(chǎn)酸量先明顯升高，在32℃時(shí)乳酸含量達(dá)到最高，為5.10 mg/mL，37℃以上時(shí)隨溫度升高產(chǎn)酸量明顯下降。因此最適溫度為32℃。

2.626#菌株產(chǎn)酸特性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在初始pH值為6.5，接種量7%，溫度32℃條件下，對(duì)26#菌株產(chǎn)酸量進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，乳酸產(chǎn)量最高為7.12 mg/mL。

3　結(jié)論

檢測(cè)出衡水老白干酒中含有乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和乳酸等6種有機(jī)酸，并對(duì)主要的有機(jī)酸進(jìn)行了定量分析，乳酸含量為110.34 mg/100 mL，乙酸含量為38. 03 mg/100 mL，丙酸含量為1.64 mg/100 mL，其中乳酸含量較高，為主要有機(jī)酸。

從大曲、酒醅中分離純化得到69株產(chǎn)酸菌，其中具有代表性的醋酸菌1株，乳酸菌4株，丙酸菌2株。其中26#菌產(chǎn)乳酸量最大，1#菌產(chǎn)乙酸量最大，4#菌產(chǎn)丙酸量最大，產(chǎn)酸量分別為7.08 mg/mL，2.26 mg/mL，0.45 mg/mL。

對(duì)產(chǎn)酸量最高26#菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）。并對(duì)產(chǎn)酸特性進(jìn)行了初步研究，在初始pH值為6.5，接種量7%，溫度32℃時(shí)該菌乳酸產(chǎn)量最高，為7.12 mg/mL。

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Separation，identification and performances of acid-producing microorganism from Hengshui LaobaiganBaijiu

SUN Pengfei1，ZHANG Fuyan2，WU Haijing1，ZHU Wenzhong1*
（1.College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.Hengshui Laobaigan Distillery Group，Hengshui 053000，China）

Organic acids are important flavor components inBaijiu（Chinese liquor），and also the precursor of aroma components.Six kinds of organic acids（acetic acid，propionic acid，isobutyric acid，butyric acid，isovaleric acid and lactic acid）were determined by GC and HPLC.69 acid-production bacteria strains were separated and obtained fromDaquand fermented grains，in which the representative bacteria were 1 strain of acetic bacteria，4 strains of lactic acid bacteria and 2 strains of propionic acid bacteria.The main acid-producing bacteria were identified asWeissella cibariaby 16S rDNA，and its acid-production performance was researched preliminarily.The results showed that in the conditions of the initial pH 6.5，inoculum 7%，temperature 32℃and time 36 h，the lactic acid yield could reach up to the highest of 7.12 mg/ml.

organic acids；acid-producing bacteria；separation；identification；acid-production performance

TS262.3

0254-5071（2016）03-0036-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.009

2015-12-31

孫鵬飛（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楣虘B(tài)發(fā)酵技術(shù)。

朱文眾（1958-），男，教授，本科，研究方向固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。