韓忠安，羅信旭，楊春艷，吳擁軍*

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

豆豉中生物胺含量的動態(tài)變化研究

韓忠安，羅信旭，楊春艷，吳擁軍*

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

采用高效液相色譜法對豆豉中生物胺含量進行動態(tài)檢測。結(jié)果表明，純種強化發(fā)酵和自然發(fā)酵豆豉樣品中均檢測出色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。純種強化發(fā)酵條件下生物胺總含量在前、后發(fā)酵時期都呈先上升后下降的趨勢，而自然發(fā)酵條件下均呈緩慢上升趨勢，且前發(fā)酵總生物胺含量高于后發(fā)酵時期。兩種發(fā)酵條件下，酪胺和亞精胺為主要生物胺，苯乙胺存在純種發(fā)酵中。純種強化發(fā)酵豆豉總生物胺含量高于自然發(fā)酵，酪胺和苯乙胺的含量分別高出2倍和4倍，與生產(chǎn)環(huán)境中糞腸球菌的污染關(guān)聯(lián)性較大。豆豉發(fā)酵過程和成品中總生物胺含量均＜250 mg/kg，短期內(nèi)不存在食品安全問題。

高效液相色譜；生物胺；細菌型豆豉

生物胺（biogenic am ines，BAs）是一類具有生物活性含氮的低分子質(zhì)量有機化合物的總稱，是生物體（包括人體）內(nèi)的正?；钚猿煞郑谏锘钚约毎写龠M生長和代謝、增強腸道系統(tǒng)免疫活性，并在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮活性，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用［1］。但當人體攝入過量的生物胺（尤其是同時攝入多種生物胺）時，可能導致血壓升高、臉色漲紅、頭痛，惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂，甚至出現(xiàn)皮疹等過敏反應(yīng)，嚴重的還會危及生命［2-3］。

生物胺存在于多種食品中，尤其是發(fā)酵食品，食物中存在的生物胺主要有：組胺、酪胺、酪胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、精胺、亞精胺等［4］。目前對食品中生物胺的研究主要集中在酒類、魚類、肉類、醬油、發(fā)酵香腸、發(fā)酵蔬菜、豆腐乳等［5-11］。在腐乳研究中，王穎等［12］用雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）發(fā)酵腐乳中主要以尸胺和酪胺為主，含量分別達到460.1 mg/kg、318.5 mg/kg，而少孢根霉（Rhizopusoligosporus）發(fā)酵腐乳中尸胺含量為668 mg/kg。胡鵬等［13］以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中生物胺的含量進行測定，結(jié)果表明，常見的8種生物胺總含量的范圍為101.07～427.19 mg/kg；近年來，有報道稱豆豉中生物胺含量已超標，檢測到湖南曲霉型豆豉中苯乙胺含量為87.88 mg/kg，廣東曲霉型豆豉中苯乙胺和組胺含量分別為83.44 mg/kg和64.45 mg/kg；在永川豆豉制曲第8天和第11天中苯乙胺含量分別為44.98 mg/kg和52.02 mg/kg；蘇悟等［14］細菌型豆豉在自然發(fā)酵過程中48～120 h期間，酪胺含量范圍在151～488mg/kg，苯乙胺含量從36.6mg/kg上升至190mg/kg。

鑒于細菌型豆豉中生物胺含量存在潛在危害，本研究擬對其細菌型豆豉生產(chǎn)過程中的生物胺種類和含量進行動態(tài)研究，從而對其食用安全性進行評價；同時針對生物胺高產(chǎn)階段對其發(fā)酵工藝進行理論指導和改進，從而控制細菌型豆豉中生物胺含量，提高食品安全。對豆豉中生物胺含量進行檢測不僅為發(fā)酵豆制品中生物胺安全評估具有借鑒和指導意義，同時對不同人群進行安全營養(yǎng)配餐提供實驗數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆豉樣品：2015年11月17-27日采自貴陽市某風味食品廠，每次采集上、中、下層合計約100 g，送實驗室-20℃保存，待全部樣品采集完畢后批次進行檢測。前發(fā)酵是自然發(fā)酵和接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ 3-2的純種強化發(fā)酵豆豉樣品分別每隔6 h采集一次，各采集12次；后發(fā)酵是加入調(diào)味料后裝瓶控溫（37℃）后發(fā)酵，每隔1 d采集一次，各7次。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）BJ3-2：本實驗室保藏。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯（純度≥98%）：美國Sigma公司；氫氧化鈉、碳酸氫鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；高氯酸（分析純）：天津市東方化工廠；鹽酸、丙酮（分析純）：重慶川東化工（集團）有限公司；氨水（分析純）、乙腈（色譜純）：成都金山化學試劑有限公司；三蒸水：實驗室自制。

1.2儀器和設(shè)備

Agilent 1260 infinit高效液相色譜儀（含紫外檢測器）：美國Agilent公司；2-16 k高速冷凍離心機、Research移液槍：德國Eppendorf公司；EL-2005電子分析天平：西特傳感技術(shù)有限公司；0.22 μm針頭微孔濾膜過濾器（一次性）：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品預處理

樣品預處理按照胡鵬等［13］的方法略加修改而成。將不同發(fā)酵時期豆豉樣品用研缽研磨均勻，稱取5 g豆豉樣品置于50 m L具塞離心管中，加入20 m L 0.4 mol/L高氯酸，混勻，振蕩提取30 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。沉淀如上述方法再加入20 m L高氯酸提取一次，合并兩次上清液，用0.4 mol/L高氯酸定容至50 m L。取0.5 m L上清液按照1.3.3方法進行衍生。

1.3.2生物胺標準溶液的制備

標準溶液的制備參照國標GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》［15］。

1.3.3樣品衍生

參考王穎等［12，16］的方法并有所進行改進。取0.5 m L標準生物胺溶液于5m L離心管中，依次加入100μL 2m ol/L氫氧化鈉溶液，150 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖，振蕩數(shù)秒，再加入1 m L丹磺酰氯衍生劑（5mg/m L，溶劑為丙酮），振蕩混勻，在60℃黑暗條件下保溫30 min，隔15 min振蕩一次；加入50 μL 25%氨水終止反應(yīng)，靜置30 min，加入700 μL乙腈溶液，振蕩混勻，用0.22 μm有機濾頭過濾，于4℃避光保存，用于HPLC測定。樣品稀釋溶液的衍生與標準工作液衍生條件及方法相同。

1.3.4高效液相色譜色譜條件

參考王穎等［12］的方法并有所進行改進。色譜柱為Agilent XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長為254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流動相A為乙腈，流動相B為水，流速為0.8 m L/min。洗脫梯度程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient e lution program

2　結(jié)果與分析

2.1生物胺混合標準品HPLC色譜分析

采用梯度洗脫程序，首先分別對每種生物胺進行定性檢測，確定每種生物胺的出峰時間，再對8種生物胺混合標準品進行測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，各種生物胺在20 min內(nèi)能夠全部出峰，其出峰順序分別為色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。8種生物胺之間的分離度分別為2.47、7.19、3.44、1.88、2.71、9.00、6.28、6.01，且分離度都＞1，由此可見各種生物胺標準品能夠有效分離。

圖1　生物胺混合標準品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of m ix standard o f biogenic amines

2.2標準曲線的回歸方程和精密度試驗

配制標準工作液進行線性試驗，在1.25～80 mg/L范圍得到每種生物胺的線性回歸方程及其線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2　標準曲線的回歸方程及其精密度實驗結(jié)果Tab le 2 Regression equations of standa rd curves and precision experiments results

由表2可見，8種生物胺的回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均＞0.990 0，說明標準曲線呈良好的線性關(guān)系，滿足檢測要求。對質(zhì)量濃度為80 m g/L衍生完成的生物胺混合標準工作液，連續(xù)進樣7次，得到8種生物胺的標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍在0.11%～1.06%，均＜2%，說明該儀器具有較好的精密度，符合檢測要求。

2.3不同發(fā)酵條件下豆豉樣中總生物胺含量的變化

圖2　不同發(fā)酵條件下總生物胺含量變化曲線Fig.2 Changing curves of biogenic am ines content in different fermentation conditions

在整個發(fā)酵過程中，純種強化發(fā)酵條件下總生物胺含量遠大于自然發(fā)酵條件下的（見圖2），純種強化發(fā)酵條件下，前發(fā)酵過程中總生物胺含量隨發(fā)酵時間的推移而呈上升趨勢，在36 h后呈略下降，而后又呈上升趨勢；在后發(fā)酵中，總生物胺含量在1～6 d呈上升趨勢，在第7天下降。自然發(fā)酵條件下，總生物胺含量在兩個發(fā)酵時期都是呈平緩上升趨勢。SANTOS M H S［3］認為攝入總生物胺含量超過1 000 mg/kg會嚴重危害人體健康，而由圖2看出，兩種發(fā)酵條件下各階段總生物胺含量都＜250 mg/kg。

2.4不同發(fā)酵條件豆豉樣品中8種生物胺含量的變化

選取不同發(fā)酵時間梯度對豆豉中生物胺含量進行測定，結(jié)果見圖3～圖4。

圖3　純種強化發(fā)酵條件下8種生物胺含量變化曲線Fig.3 Changing curves of eight biogenic am ines contents in pure-culture fermentation

圖4　自然發(fā)酵條件下8種生物胺含量變化曲線Fig.4 Changing curves of eight biogenic am ines content in natural fermen tation

在2種豆豉發(fā)酵條件下都能夠檢測出8種生物胺，分別是色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。不同發(fā)酵時期生物胺的含量和種類有差異，這可能與豆豉豆豉中微生物菌群變化有關(guān)。

由圖3可知，在純種強化發(fā)酵條件下，酪胺含量在豆豉發(fā)酵整個過程中遠遠高于別的生物胺含量，前發(fā)酵時期含量高于后發(fā)酵時期的。在前發(fā)酵過程中酪胺含量先大幅度上升，在36 h后略下降，再度緩慢上升，到60 h時含量最高，后發(fā)酵時期酪胺含量低于前發(fā)酵時期。在整個純種發(fā)酵過程中，苯乙胺在后發(fā)酵先呈緩慢上升后下降的趨勢，其他的生物胺含量較低，且變化不大。

由圖4可知，自然發(fā)酵條件下，亞精胺含量在整個發(fā)酵過程中變化不大，并且在前發(fā)酵時期比別的生物胺中含量都高，而在后發(fā)酵時期其含量低于酪胺含量。酪胺在前發(fā)酵48 h后呈上升趨勢，在后發(fā)酵時期從第2天起呈緩慢上升趨勢，且含量是最高。

2.5豆豉成品中生物胺含量的測定

不同發(fā)酵條件下豆豉成品中各類生物胺含量見表3。

表3　純種強化和自然發(fā)酵下豆豉成品的生物胺的含量Table 3 Biogenic am ines con tent of Douchi produc ts w ith pure-culture fermentation and natural fermentation mg/kg

由表3可知，純種強化發(fā)酵條件下，主要的生物胺有酪胺、苯乙胺和亞精胺，它們的含量分別為63.25 mg/kg、13.82 mg/kg、8.75 mg/kg，占生物胺總含量的88%以上；自然發(fā)酵條件下，主要的生物胺是酪胺和亞精胺，它們占生物胺總含量的62%以上。兩種發(fā)酵條件下相比，純種發(fā)酵條件下苯乙胺和酪胺的含量比自然發(fā)酵條件分別高出4倍多和2倍多，腐胺含量則相反；而其他生物胺含量相近。

在兩種發(fā)酵條件下，精胺和亞精胺的含量在自然發(fā)酵條件下略高于純種強化發(fā)酵條件，且精胺和亞精胺含量在兩個條件下相差不大，說明精胺和亞精胺在豆豉中一直存在，枯草芽孢桿菌BJ 3-2對其影響不大。生物胺含量相差最大的是酪胺，其次是苯乙胺和腐胺。在純種強化發(fā)酵和自然發(fā)酵條件下，酪胺和苯乙胺的含量差別較大，有可能是由于工廠發(fā)酵室受到污染的原因。本實驗室采用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電脈（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）法在豆豉的發(fā)酵過程中檢測到糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）的存在，而接種的枯草芽孢桿菌與糞腸球菌有相互促進生長作用［17］，導致糞腸球菌的快速繁殖。舒蕊華等［18］報道糞腸球菌和屎腸球菌（Enterococcus faecium）產(chǎn)有較強的產(chǎn)酪胺和苯乙胺的微生物；在李志軍［19］的研究中發(fā)現(xiàn)糞腸球菌和屎腸球菌也能夠產(chǎn)生大量的酪胺。因此，使純種發(fā)酵條件下酪胺含量高于自然發(fā)酵條件。李蕊婷等［20］從新疆熏馬腸中分離出具產(chǎn)腐胺的能力較強的粘質(zhì)沙雷氏菌。在純種強化發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌BJ 3-2是優(yōu)勢菌群，抑制了粘質(zhì)沙雷氏菌的生長，自然發(fā)酵條件下粘質(zhì)沙雷氏菌不受限制。所以自然發(fā)酵條件下腐胺含量比純種強化發(fā)酵條件下腐胺的含量要高。

亞精胺和精胺的含量很低，并且這兩種生物胺對人體沒有直接的毒性。對人體有直接傷害的生物胺有苯乙胺、組胺和酪胺等3種。有文獻稱［21］組胺的毒性極限在8～40 mg是屬于輕微中毒，40～100mg為中度中毒，超過100mg就會嚴重中毒；人體攝入酪胺含量超過100 mg/kg會引起偏頭痛；苯乙胺含量在30 mg/kg以上［22］危害人體健康。根據(jù)文獻報道［23］，美國食品藥品監(jiān)督局（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量低于50 mg/kg，食品中組胺含量應(yīng)低于500 m g/kg，酪胺含量低于100 mg/kg；歐盟規(guī)定鯖科魚中組胺含量應(yīng)低于100 mg/kg，其他食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，酪胺不得超過100 mg/kg，就可對人體構(gòu)成潛在的危險。按照對25%的日本人每天食用的豆制品在100～200 g的調(diào)查［24］，以豆豉樣品中的酪胺最高含量來進行估算，每天攝入的酪胺含量為30 mg以下，對人體健康不具傷害作用。由表3可以看出，細菌型豆豉在發(fā)酵過程中苯乙胺、組胺、酪胺等生物胺的含量低于危害對人體健康的范圍。

在整個發(fā)酵過程中，純種強化發(fā)酵條件下總生物胺含量遠大于自然發(fā)酵條件下的，這是因為酪胺含量和苯乙胺含量在純種發(fā)酵條件下遠高于自然發(fā)酵條件的含量；在后發(fā)酵過程中，總生物胺含量遠低于前發(fā)酵條件生物胺總量，最主要的原因是由于加入調(diào)料（食鹽、老姜、花椒）和水稀釋了生物胺含量。但隨著發(fā)酵時間的推移，豆豉中pH逐漸上升，使生物胺氨基酸脫羧酶陽性細菌快速生長，導致生物胺的積累。對于非殺菌的水豆豉，隨著保質(zhì)期的延長，生物胺含量可能會持續(xù)增加，其安全性問題還需進一步研究。

3　結(jié)論

豆豉發(fā)酵各階段中酪胺和組胺的含量沒有超過FDA和歐盟規(guī)定的范圍，苯乙胺含量也沒有超過傷害人體健康的范圍，其總生物胺含量均＜250 mg/kg，理論上不存在食用安全問題。但細菌性豆豉在自然條件的后發(fā)酵過程中一直是呈緩慢上升趨勢，細菌型豆豉在自然發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度，且在集裝運輸過程中溫度不宜超過37℃，否則可能會由于在高溫條件下酪胺含量的升高而帶來安全隱患。此外，細菌型豆豉在發(fā)酵過程中受到環(huán)境污染，從而增強了酪胺的含量。因此對發(fā)酵廠房進行徹底殺菌來控制糞腸球菌，防止污染，否則可能導致酪胺苯乙胺含量成倍增加，導致生物胺超標。因此豆豉生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)嚴格控制前發(fā)酵過程中的衛(wèi)生環(huán)境條件才能控制生物胺的含量。本研究對于豆豉企業(yè)對細菌型豆豉中生物胺含量控制具有指導意義。

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Dynamic changes of biogenic am ines content in Douchi

HAN Zhongan，LUO Xinxu，YANG Chunyan，WU Yongjun*
（College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The content of biogenic am ine in Douchi was detected dynamically by HPLC.The results showed that tryptam ine，phenylethylam ine，putrescine，cadaverine，histamine，tyram ine，sperm idine and sperm ine were found in pure-culture fermentation and natural bacteria-fermented Douchi samples.In pure-culture pre-fermentation and post-fermentation，the variation trend of the total biogenic amines content first increased，then decreased.While the biogenic amines content increased slow ly in natural fermentation.The total biogenic amines content in pre-fermentation was higher than that in post-fermentation.Under two fermentation conditions，the primary biogenic amines were tyram ine and sperm idine，phenylethylam ine mainly existed in pure-culture fermentation.The total biogenic am ines content in pure-culture fermentation was higher than that in natural fermentation.The tyramine content of bacteria-fermented Douchi was two times higher and phenylethylam ine content was four times higher than that in natural bacteria-fermented Douchi products，which might be related to the pollution of Enterococcus faecalis in the environment.The total biogenic amines content was less than 250 mg/kg in the fermentation process and in the product，which indicated no food safety problem in a short time.

HPLC；biogenic amine；bacteria-fermented Douchi

TS214．2

0254-5071（2016）05-0060-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．013

2016-03-17

國家自然科學基金項目（31260394/C200207）

韓忠安（1990-），男，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物學。

吳擁軍（1971-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。