謝柱彬，袁鏡樂，殷進(jìn)方，黃育浩，盧偉昌，張險朋（.東莞市東坑鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 5960；.東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 5960；.東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 5086）

應(yīng)用間接ELISA方法檢測馬鼻疽抗體

謝柱彬1，袁鏡樂2，殷進(jìn)方3，黃育浩3，盧偉昌1，張險朋3
（1.東莞市東坑鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523960；2.東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523960；3.東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

為了驗證間接ELISA方法檢測馬鼻疽抗體的可行性，在東莞市4個馬場采集馬血清，應(yīng)用間接ELISA方法進(jìn)行檢測，同時對這些馬匹進(jìn)行鼻疽菌素滴眼反應(yīng)檢疫。結(jié)果為間接ELISA陽性對照血清和陰性對照血清結(jié)果均成立，采集51份馬血清馬鼻疽抗體均為陰性，鼻疽菌素滴眼反應(yīng)檢疫結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，應(yīng)用間接ELISA方法檢測馬鼻疽抗體可行，東莞市的馬匹未發(fā)現(xiàn)有馬鼻疽的感染。

馬鼻疽；間接ELISA；滴眼反應(yīng)；馬

馬鼻疽是由鼻疽伯氏菌（Burkholderia mallei）所引起的馬、驢和騾等馬屬動物的一種接觸性傳染性致死性傳染病，俗稱“吊鼻”、“串槽”。該病主要發(fā)生在成年馬匹的皮膚、淋巴系統(tǒng)和呼吸道系統(tǒng)，臨床癥狀主要表現(xiàn)為在鼻腔或皮膚形成特異性的鼻疽結(jié)節(jié)、潰瘍或在肺臟、淋巴結(jié)等臟器出現(xiàn)結(jié)節(jié)。病馬是該病的主要傳染源，主要通過被污染的飼料和飲水經(jīng)消化道感染。病馬和健康馬之間互相接觸，舔，咬病變部分泌物及污染的用具，也可被感染，潛伏期較長，數(shù)周到數(shù)月。OIE將該病列為B類病，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定為二類動物疫病。1949年解放以后，該病曾在我國北方大范圍暴發(fā)流行，給養(yǎng)馬業(yè)帶來巨大的損失，嚴(yán)重影響人類的健康，危害公共衛(wèi)生安全。為了驗證間接ELISA檢測馬鼻疽抗體的可行性，在東莞市采集了51份馬血清進(jìn)行檢測，并用馬鼻疽滴眼反應(yīng)檢疫結(jié)果相比較，現(xiàn)將試驗結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1馬血清

共51份，采自東莞市4個馬場。頸靜脈采血，以3500r/min離心15min分離獲得待檢血清，-20℃保存?zhèn)錂z。

1.2試劑和儀器

馬鼻疽抗體ELISA試劑盒：購自美國Bioo Scientific公司，批號為ss02102016。馬鼻疽菌素：購自中國獸藥監(jiān)察所。SUNRISE酶標(biāo)儀購自TECAN公司。

1.3間接ELISA方法

1.3.1使用前，所有的試劑組分回復(fù)到室溫（21℃±5℃）至少1h，此試驗為雙孔試驗，每個樣品和對照都需做雙孔。

1.3.2吸取100μL陽性對照到酶標(biāo)板上，吸取100μL陰性對照到酶標(biāo)板上；加入100μL 200倍稀釋后的待檢血清，封板室溫孵育60min。

1.3.3倒掉板孔中的液體，每孔加250μL稀釋后的洗滌液，浸泡1min，洗板6次，最后拍干。每孔加入100μL稀釋后的酶標(biāo)二抗，封板室溫孵育30min。

1.3.4倒掉板孔中的液體，按照上述方法洗板6次，拍干。每孔加入100μL底物，封板室溫孵育10min，加入100μL終止液，混勻后450nm讀數(shù)。

1.3.5結(jié)果判定Cut off等于陰性對照平均OD值加上2倍陰性對照標(biāo)準(zhǔn)差，陽性對照的平均OD值大于CO值，結(jié)果成立。樣品平均OD值大于CO值，馬鼻疽抗體判為陽性，樣品平均OD值小于CO值，馬鼻疽抗體判為陰性。

1.4鼻疽菌素滴眼反應(yīng)

馬匹滴眼前仔細(xì)檢查馬匹眼睛，結(jié)膜正常才可滴眼，同時檢查頜下淋巴結(jié)，皮膚及有無流鼻等，并詳細(xì)記錄。一般情況下滴左眼，左眼有問題可滴右眼，應(yīng)記錄。在左眼中滴入鼻疽菌素原液3～4滴。在滴眼后3、6、9h，共檢查3次，在24h再檢查一次。滴眼后無反應(yīng)的馬匹，或結(jié)膜微充血及流淚的馬匹判為陰性；結(jié)膜潮紅，輕度腫脹，分泌物為灰白色漿液性及粘液性的馬匹判為可疑；結(jié)膜發(fā)炎，腫脹明顯，分泌物為膿性的馬匹判為陽性。

2　結(jié)　果

2.1間接ELISA檢測結(jié)果

結(jié)果為陰性對照平均OD值為 0.2375，Cut off值為0.2875，陽性對照平均OD值為2.6245，間接ELISA結(jié)果成立。在檢測的51份馬血清中，結(jié)果均為陰性，陽性率為0，結(jié)果詳見表1。

表1　東莞市馬場馬鼻疽抗體檢測結(jié)果

2.2馬鼻疽菌素滴眼反應(yīng)檢疫結(jié)果

在檢疫的51匹馬中，馬鼻疽菌素滴眼反應(yīng)檢疫結(jié)果均為陰性，滴眼后在3，6，9，24h檢查均未發(fā)現(xiàn)馬匹眼睛有炎癥反應(yīng)。

3　討　論

3.1東莞市馬匹的存欄量為100多匹，主要用于賽馬，休閑和娛樂，流動性比較大。東莞市按照“無馬疫區(qū)的規(guī)定”每年采用鼻疽菌素滴眼反應(yīng)進(jìn)行檢疫，多年來一直未發(fā)現(xiàn)有馬鼻疽陽性反應(yīng)。此次試驗采用間接ELISA方法檢測結(jié)果均為陰性，與鼻疽菌素滴眼反應(yīng)檢疫結(jié)果為一致。結(jié)果表明，我市的馬匹未發(fā)現(xiàn)有馬鼻疽的感染，說明馬鼻疽疫情控制的很好。

3.2鼻疽菌素試驗是國家規(guī)定檢疫馬鼻疽的方法，該方法一直用于大批馬匹的檢疫，但該檢疫方法的時間長，需在3，6，9，24h到場進(jìn)行檢查，并受人為因素影響大。ELISA方法操作簡單，時間短，結(jié)果準(zhǔn)確，受人為因素干擾少，并且適合大規(guī)模的檢測。對ELISA、CF、AGID和HA等方法進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，ELISA與臨床馬鼻疽確診病例符合率達(dá)到100%，而其他試驗僅有90.9%的符合率，因此，ELISA能夠作為馬鼻疽常規(guī)采用的高靈敏度診斷方法。

3.3雖然我市在馬鼻疽的防控做的比較好，但是馬匹的流動性比較大，帶來一定的隱患。我市馬鼻疽的防控工作不能放松，按照《馬鼻疽防治技術(shù)規(guī)范》每年做好馬鼻疽的檢疫。按照“廣東從化無馬疫區(qū)”的要求，定期對馬場進(jìn)行巡查，發(fā)現(xiàn)疑似病例及時上報，并及時派專業(yè)人員到現(xiàn)場處理。加強(qiáng)馬場的飼養(yǎng)管理，做好消毒等防疫措施，提高馬匹的抗病能力。異地調(diào)運馬屬動物，必須來自非疫區(qū)，并做好隔離，在隔離期內(nèi)進(jìn)行檢疫，連續(xù)2次（間隔5～6d）鼻疽菌素試驗檢疫，確認(rèn)健康無病，方可混群飼養(yǎng)。售馬屬動物的單位和個人，應(yīng)在出售前按規(guī)定報檢，經(jīng)當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫并簽發(fā)產(chǎn)地檢疫證后，方可調(diào)運。

［1］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.北京.中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：462-463.

［2］張亞黎，等.淺談關(guān)于馬鼻疽的診斷及防制措施［J］.中獸醫(yī)雜志，2014，11：21.

［3］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.動物傳染病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999，75-84.

［4］陳琦，等.馬鼻疽研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)雜志，2012，48（11）：48-50.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.08.028

謝柱彬（1978～），廣東省東莞市人，助理獸醫(yī)師，從事動物疫病防控工作