羅　靜（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心401121）

復(fù)方磺胺甲噁唑片《中國藥典》2015版微生物限度檢查法的建立

羅靜（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心401121）

目的建立復(fù)方磺胺甲噁唑片的微生物限度檢查法。方法2016年3～5月按照《中國藥典》2015年版（四部）微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，采用平皿法、薄膜過濾法、薄膜過濾加入中和劑（1.00%對氨基苯甲酸）法對5種陽性菌的回收率進(jìn)行測定，探索需氧菌、真菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法和控制菌大腸埃希菌檢查方法。結(jié)果需氧菌、真菌總數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)中各菌回收率均達(dá)70.00%以上，回收率為0.50%～2.00%時(shí)試驗(yàn)組可檢出大腸埃希菌，該法符合《中國藥典》2015版的要求。結(jié)論所建立的方法適用于該品種執(zhí)行新版藥典要求下的微生物限度檢查，需氧菌總數(shù)和控制菌檢查采用薄膜過濾加入中和劑的方法消除復(fù)方磺胺甲噁唑片的抑菌作用，真菌總數(shù)采用常規(guī)法。

復(fù)方合劑；磺胺甲基異惡唑/分析；甲氧芐啶/分析；微生物學(xué)技術(shù)；藥物污染；過濾/方法；中和試驗(yàn)

復(fù)方磺胺甲噁唑片為磺胺類抗菌藥物，是磺胺甲噁唑（SMZ）與甲氧芐啶（TMP）的復(fù)方制劑，本品具有較強(qiáng)的抑菌作用，臨床主要用于治療敏感菌，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、瘧原蟲、卡氏肺孢子菌所致的細(xì)菌性感染，以及寄生蟲感染、細(xì)菌性痢疾、流行性腦脊髓膜炎等［1-3］?！吨袊幍洹?015版的微生物限度檢查法更靠近歐美藥典，與2010年版比較，在試驗(yàn)菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和檢驗(yàn)方法等方面均有較大改變［4-5］。目前，按新版藥典進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的研究少見［6-7］。2016年3～5月本研究對復(fù)方磺胺甲噁唑片進(jìn)行了微生物限度檢查方法學(xué)的驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品本研究所用樣品為重慶科瑞南海制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品（規(guī)格：SMZ0.4g，TMP80mg，批號：160301）。

1.1.2菌株金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC （F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑胰酪大豆胨（TSA）瓊脂培養(yǎng)基（批號：141126）、TSA液體培養(yǎng)基（批號：150916）、沙氏葡萄糖（SDA）瓊脂培養(yǎng)基（批號：150824）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：150924）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：1511103）、氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0，批號：150906）、對氨基苯甲酸（批號：070425）等。

1.1.4儀器QUINTIX612-1CN電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，HVA-110高壓滅菌器購自日本HIRAYAMA儀器制造公司，SHH-250LD生化培養(yǎng)箱購自重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司，HF safe-1200生物安全柜購自上海力申科學(xué)儀器公司，SW22恒溫振蕩水浴箱購自德國優(yōu)萊博公司，HTY-100微生物限度檢驗(yàn)儀購自杭州高利醫(yī)療器械公司，S60微生物限度培養(yǎng)器購自浙江泰林生物技術(shù)有限公司（批號：20160220）。

1.2方法［8-12］

1.2.1需氧菌、真菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1.2.1.1菌液的制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液；取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液；取經(jīng)25℃培養(yǎng)6 d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

1.2.1.2需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（1）試驗(yàn)組。方法一（薄膜過濾法）：稱取樣品10.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL用薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，立即倒入TSA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后按規(guī)定溫度、時(shí)間（需氧菌培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)3 d；真菌培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5 d）培養(yǎng)，觀察結(jié)果。方法二（薄膜過濾法）：除用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 mL沖洗外其余步驟與方法一相同。方法三（薄膜過濾加入中和劑法）：稱取樣品10.0 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，趁熱加入1.00%無菌對氨基苯甲酸溶液5 mL混勻，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL用薄膜過濾，用含0.01%對氨基苯甲酸的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，立即倒入含0.01%對氨基苯甲酸的TSA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后按規(guī)定的溫度、時(shí)間（需氧菌培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)3 d；真菌培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5 d）培養(yǎng)，觀察結(jié)果。方法四（薄膜過濾加入中和劑法）：除用含0.01%對氨基苯甲酸的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 mL沖洗外其余步驟與方法三相同。（2）菌液組。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL替代供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1mL加入平皿中，倒入TSA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后按規(guī)定的溫度、時(shí)間（需氧菌培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)3 d；真菌培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5 d）培養(yǎng)，觀察結(jié)果。（3）中和劑對照組。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL替代供試液，趁熱加入1.00%對氨基苯甲酸溶液5mL混勻，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100cfu，混勻，取1mL加入平皿中，倒入含0.01%對氨基苯甲酸的TSA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后按規(guī)定的溫度、時(shí)間（需氧菌培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)3d；真菌培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5 d）培養(yǎng)，觀察結(jié)果。（4）供試液對照組。按試驗(yàn)組的供試液制備方法，以稀釋液代替菌液，操作與試驗(yàn)組相同，按規(guī)定的溫度、時(shí)間（需氧菌培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)3 d；真菌培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)5 d）培養(yǎng)，觀察結(jié)果。另作陰性、空白對照。

1.2.1.3真菌總數(shù)計(jì)數(shù)（1）試驗(yàn)組。方法一（平皿法）：稱取樣品10.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL加入平皿中，立即倒入SDA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。方法二（平皿法）：稱取樣品2.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶50供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100cfu，混勻，取1mL加入平皿中，立即倒入SDA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。（2）菌液組。取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL替代供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL加入平皿中，倒入SDA瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置25℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。（3）供試液對照組。按試驗(yàn)組的供試液制備方法，以稀釋液代替菌液，操作與試驗(yàn)組相同，置25℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。另作陰性、空白對照。

1.2.1.4回收率計(jì)算方法各菌株回收率（%）=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試液對照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)×100%。根據(jù)《中國藥典》2015年版（四部）的規(guī)定，若回收率為0.50%～2.00%，所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法可用于該樣品的需氧菌、真菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

1.2.2控制菌大腸埃希菌檢查驗(yàn)證方法

1.2.2.1菌液制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌TSA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每毫升含菌量小于或等于100 cfu的菌懸液。

1.2.2.2試驗(yàn)方法（1）試驗(yàn)組。方法一：取1∶10供試液10 mL與每毫升含菌量小于或等于100 cfu大腸埃希菌同時(shí)加入100 mL TSA液體培養(yǎng)基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。方法二：取1∶10供試液10 mL薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml沖洗，在最后一次沖洗液中加入1.00%對氨基苯甲酸5 mL和每毫升含菌量小于或等于100 cfu大腸埃希菌，置于含0.01%對氨基苯甲酸的100 mL TSA液體培養(yǎng)基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（2）樣品組。取1∶10供試液10mL，以稀釋液代替菌液，操作與試驗(yàn)組相同，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（3）陽性對照組。將1mL含菌量小于或等于100cfu大腸埃希菌置于100mL TSA液體培養(yǎng)基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（4）陰性對照組。取稀釋液10 mL加入100 mLTSA液體培養(yǎng)基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。

2　結(jié)　果

2.1需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)3次平行試驗(yàn)結(jié)果陰性、空白對照均無菌生長。3次回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1～3。中和劑對照組金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率分別為92.00%、95.00%、94.00%、96.00%、95.00%，均大于50.00%，符合藥典對中和劑的相關(guān)要求。

表1　第1次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

表2　第2次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

表3　第3次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.2真菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)3次平行試驗(yàn)結(jié)果陰性、空白對照均無菌生長。黑曲霉、白色念珠菌的回收率均可達(dá)50.00%以上，見表4～6。

表4　第1次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

表5　第2次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

表6　第3次回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.3控制菌大腸埃希菌檢查3次平行試驗(yàn)結(jié)果樣品對大腸埃希菌有較強(qiáng)抑菌作用，方法二可較好地去除抑菌性，見表7～9。

表7　第1次大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表8　第2次大腸埃希菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表9　第3次大腸埃希菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3　討　論

《中國藥典》2015年版整合了2010年版藥典一、二、三部有關(guān)微生物內(nèi)容部分，檢驗(yàn)方法與國際全面接軌，涵蓋標(biāo)準(zhǔn)和方法的整體變化，涉及品種微生物限度檢查法需要進(jìn)行重新驗(yàn)證。涉及附錄1105微生物計(jì)數(shù)法主要修訂了如下7個(gè)方面：（1）目標(biāo)檢測菌的修訂，①細(xì)菌總數(shù)改為需氧菌總數(shù)（包括細(xì)菌、真菌總數(shù)）；②真菌總數(shù)（細(xì)菌數(shù)）。（2）培養(yǎng)基檢測系統(tǒng)、稀釋液的修訂。（3）基于培養(yǎng)基性能，對細(xì)菌計(jì)數(shù)定義、靈敏度檢查的修訂。（4）檢驗(yàn)方法的修訂。（5）刪除方法驗(yàn)證試驗(yàn)，增訂計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。（6）微生物計(jì)數(shù)結(jié)果判斷的修訂。（7）體例的變化，按試驗(yàn)順序。修訂后的計(jì)數(shù)方法將與美國藥典/歐洲藥典/日本藥典協(xié)調(diào)后的方法一致，結(jié)果將更接近供試品微生物污染情況。

復(fù)方磺胺甲噁唑片為磺胺類抗菌藥物，具有較強(qiáng)的抑菌活性，因此，本研究在需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)方面采用薄膜過濾法，加大沖洗量仍然不能去除薄膜上復(fù)方磺胺甲噁唑的抑菌活性，于是查閱文獻(xiàn)［13-14］得知，磺胺類藥物是有抗菌作用的對氨基苯磺酰胺藥物的總稱，其抗菌作用主要是妨礙細(xì)菌體內(nèi)的正常代謝，因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)的正常代謝必須有對氨基苯甲酸參與，而磺胺類藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與前者十分類似，很可能被細(xì)菌誤認(rèn)為是對氨基苯甲酸而吸收，以致細(xì)菌生長和繁殖受到抑制。為更好地去除復(fù)方磺胺甲噁唑片的抑菌性，本研究結(jié)合對氨基苯甲酸這種中和劑的競爭性抑制作用，獲得滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

試驗(yàn)中中和劑的加入量應(yīng)適量，過多會影響培養(yǎng)基的凝固，過少則不能較好地去除供試品的抑菌性，且2015版《中國藥典》要求在制備好的供試液中加入試驗(yàn)菌液再進(jìn)行薄膜過濾，因此，本研究在供試液、沖洗液及培養(yǎng)基中均加入了中和劑，本研究采用1∶10供試液100 mL中趁熱加入1.00%對氨基苯甲酸溶液5 mL，另外在沖洗液和TSA瓊脂培養(yǎng)基中均加入0.01%對氨基苯甲酸作為中和劑，可較好地去除抑菌性。

依據(jù)本研究結(jié)果，可確定其真菌總數(shù)采用常規(guī)法，需氧菌總數(shù)及控制菌大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾加入中和劑方法。本研究所建立的驗(yàn)證方法符合新版藥典的相關(guān)規(guī)定，可用于該品種微生物限度檢查。

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Establishment of microbial limit test of Chinese Pharmacopoeia（edition 2015）for compound sulfamethoxazole tablets

Luo Jing（Chongqing Municipal Institute for Food and Drug Control/Chongqing Municipal Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing 40ll2l，China）

ObjectiveTo establish the microbial limit test of compound sulfamethoxazole tablets.MethodsAccording to the applicability test of microbial limit count method provide by the Chinese Pharmacopoeia（edition 2015，part 4），the plate method，membrane filtration method，membrane filtration adding neutralizing agent method were used to detect the recovery rate of 5 kinds of positive bacteria for exploring the count method of aerobic bacteria and fungi，and the detection method of control bacterium Escherichia coli.ResultsIn the verification test of aerobic bacterial and fungal total count，the recovery rate of each bacterium reached more than 70.00%，when the recovery rate was 0.50%-2.00%，Escherichia coli could be detected.This method conformed to the requirements of the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia.ConclusionThe established method is suitable for the microbial limit test under the new edition of the Chinese Pharmacopoeia.The membrane filtration adding neutralizing agent method for detecting aerobic bacterial and fungal total count is adopted to eliminate the bacteriostasis effect of compound sulfamethoxazole tablets，the fungal total count usually adopts the conventional method.

Drug combinations；Sulfamethoxazole/analysis；Trimethoprim/analysis；Microbiological techniques；Drug contamination；Filtration/methods；Neutralization tests

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.011

A

1009-5519（2016）17-2652-04

羅靜（1981-），生藥學(xué)碩士研究生，主管中藥師，主要從事中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。

2016-06-01）