劉　偉，許　強，黎曉珊，李　清，陳明月，韓　元，彭建偉，陳春蓉，王　帆，蔡葵蒸，馬忠仁

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030)

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兩株少孢節(jié)叢孢菌在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)差異及生長特性

劉偉，許強，黎曉珊，李清，陳明月，韓元，彭建偉，陳春蓉，王帆，蔡葵蒸*，馬忠仁*

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030)

為了觀察捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌不同分離株在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)特性及生長情況，將少孢節(jié)叢孢菌分離株DH 066和F 107接種于10 g/L麩皮瓊脂(WBA)培養(yǎng)基、10 g/L玉米粉瓊脂(CMA)培養(yǎng)基、20 g/L葡萄糖離子瓊脂(DIA)培養(yǎng)基和20 g/L葡萄糖瓊脂(DA)培養(yǎng)基中，置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察不同分離株在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)學(xué)特性并測定其產(chǎn)孢量。對2個分離株在6種不同培養(yǎng)基中菌絲生長長度每天進(jìn)行定時測量。結(jié)果表明，該菌在4種培養(yǎng)基中的特征為分生孢子梨形至倒卵形，1個分隔，偶見2個分隔，分生孢子梗無色，直立，分隔，偶見分枝，分生孢子在10 g/L WBA產(chǎn)量最大。此外，對2個分離株在不同培養(yǎng)基中生長速度研究表明，該菌在10 g/L麩皮自來水瓊脂(WBWA)培養(yǎng)基和10 g/L玉米粉自來水瓊脂(CMWA)培養(yǎng)基中生長最快。

捕食線蟲性真菌；少孢節(jié)叢孢菌；形態(tài)學(xué)特性

節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)最早是由Corda于1839根據(jù)模式種多孢節(jié)叢孢菌(A.superba)而建立，少孢節(jié)叢孢菌(A.oligospora)是Fresenius于1852年首次發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時并沒有發(fā)現(xiàn)其具有捕食能力，直到1888年，Zopf才觀察到該菌捕食線蟲，并對黏性網(wǎng)進(jìn)行了描述。A.oligospora是廣泛分布于自然界的一種捕食線蟲性真菌，從土壤、牛羊糞便、糞堆、爛菜葉、垃圾和水中[1-5]都曾分離到，并且是大部分棲息地中的優(yōu)勢種，說明該菌具較強的抵抗外界環(huán)境變化的能力及對環(huán)境適應(yīng)能力強。

國內(nèi)外對捕食線蟲性真菌A.oligospora已進(jìn)行了大量的研究，如用傳統(tǒng)分類法對A.oligospora進(jìn)行鑒定[6-9]， Jansson H B等[10]、滿達(dá)等[11]通過掃描電鏡對A.oligospora的形態(tài)和分生孢子直接產(chǎn)生捕食結(jié)構(gòu)及捕食全過程的動態(tài)學(xué)進(jìn)行了觀察，Murray D S等[12]用微分干涉差顯微鏡對其捕食過程中刺入階段形成的感染球(初級感染球和二級感染球)進(jìn)行詳細(xì)觀察和描述，但沒有記載A.oligospora能產(chǎn)生2個隔的分生孢子及分生孢子梗分枝的現(xiàn)象。楊玉琴等[13]、Singh R K等[14]對在不同溫度、不同pH及不同培養(yǎng)基生長的理化特性進(jìn)行研究，但未記載A.oligospora在麩皮培養(yǎng)基中菌絲生長狀況及分生孢子產(chǎn)量的研究。

雖然國內(nèi)對該菌有不少研究，但由于每株菌來源不同、分離地地理環(huán)境、氣候不同，對該菌的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性也存在差異，DH 066和F 107來源于糞堆和新鮮糞便，說明已經(jīng)通過1次消化道。鑒于此，本試驗對生長于4種不同培養(yǎng)基的DH 066和F 107進(jìn)行詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察和在6種培養(yǎng)基中生長狀況進(jìn)行研究，以便為今后利用捕食線蟲性真菌進(jìn)行家畜體內(nèi)寄生蟲的生物防治提供候選菌種。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種捕食線蟲性真菌——少孢節(jié)叢孢菌(A.oligospora)分離株DH 066是從浙江省溫州市平陽縣地區(qū)糞堆中分離純化獲得，分離株F 107是從吉林省長春市綠園區(qū)城地區(qū)新鮮綿羊糞便中分離純化獲得。菌種于20 g/L麩皮瓊脂斜面培養(yǎng)基4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基20 g/L葡萄糖瓊脂(dextrose agar,DA)培養(yǎng)基：稱取瓊脂粉20 g，加900 mL蒸餾水，121℃高壓滅菌20 min后，加入100 mL已用115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min的含量為200 g/L的葡萄糖，然后傾注于滅菌培養(yǎng)皿中，備用。

20 g/L葡萄糖離子瓊脂(dextrose ionized agar,DIA)培養(yǎng)基：稱取瓊脂粉20 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，加900 mL蒸餾水，121 ℃高壓滅菌20 min后，加入100 mL已用115 ℃高壓滅菌15 min的含量為200 g/L的葡萄糖，倒置平皿，備用。

10 g/L麩皮瓊脂(wheat bran agar,WBA)培養(yǎng)基：稱取新鮮麩皮40 g，加入1 000 mL蒸餾水，微火煮沸1 h后，4層～6層紗布過濾，補蒸餾水至1 000 mL，濾液置于4 ℃冰箱沉淀過夜，虹吸上清液，制成原液。取原液250 mL加蒸餾水至1 000 mL，加入瓊脂粉20 g，121 ℃高壓滅菌20 min后，傾注于滅菌培養(yǎng)皿中，備用。

10 g/L麩皮自來水瓊脂(wheat bran water agar,WBWA)培養(yǎng)基：方法同上，僅將蒸餾水換成自來水。

10 g/L玉米粉瓊脂(corn meal agar,CMA)培養(yǎng)基：方法同上，用蒸餾水，麩皮換成玉米粉。

10 g/L玉米粉自來水瓊脂(corn meal water agar,CMWA)培養(yǎng)基：方法同上，用自來水。

4 g/L玉米粉瓊脂(corn meal agar,CMA)培養(yǎng)基：方法同上，用蒸餾水將40 g/L的玉米粉瓊脂原液稀釋10倍。

1.2方法1.2.1形態(tài)學(xué)特征觀察將DH 066和F 107接種于10 g/L CMA，25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，對該菌菌落特征，分生孢子形態(tài)及大小、產(chǎn)孢方式、分生孢子梗大小、捕食結(jié)構(gòu)等進(jìn)行觀察，并按照張克勤等[15]，Zhang K Q等[16]的描述進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

將保存于20 g/L麩皮斜面培養(yǎng)基的DH 066和F 107先接種在4 g/L CMA平皿上，25℃培養(yǎng)7 d后，再接種于10 g/L WBA，10 g/L CMA，20 g/L DIA，20 g/L DA平皿中央，置于25 ℃培養(yǎng)，3 d后在菌落邊緣以30°～50°角傾斜插入滅菌的蓋玻片，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d～6 d后待菌絲完全覆蓋蓋玻片，取出蓋玻片用乳酸酚棉藍(lán)染色液制片，在光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,CX21，日本)下觀察每株菌在不同培養(yǎng)基中分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)，并拍照。測量分生孢子的大小(各測50個)。在蓋玻片上畫0.3 cm×0.3 cm的方格，計分生孢子數(shù)，從而推算出每株菌在不同培養(yǎng)基中分生孢子量/cm2，同時計有分枝的分生孢子梗數(shù)及分生孢子?？倲?shù)，計算分生孢子梗的分枝率。

1.2.2對生長在不同培養(yǎng)基中的兩株少孢節(jié)叢孢菌進(jìn)行觀察及測量將保存于20 g/L麩皮斜面培養(yǎng)基的DH 066和F 107接種于4 g/L CMA平皿上。25 ℃培養(yǎng)7 d后，用直徑為5 mm的打孔器取出同等大小的帶有菌絲的瓊脂塊，接種于10 g/L WBWA，10 g/L WBA，10 g/L CMWA，10 g/L CMA，20 g/L DIA，20 g/L DA平皿中央，每組3個培養(yǎng)皿。將接種后的培養(yǎng)皿置于25 ℃下培養(yǎng)，從接種后第3天(即接種后48 h)開始，每天定時觀察并用游標(biāo)卡尺定點測量1次，最后用如下公式計算菌絲生長長度：

菌絲生長長度(mm)=各組中菌絲當(dāng)天的菌落直徑平均值-5

將統(tǒng)計的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0作圖。

2　結(jié)果

2.1在不同培養(yǎng)基中DH 066和F 107的形態(tài)

通過對培養(yǎng)于10 g/L CMA的DH 066和F 107進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，鑒定這2株菌均為少孢節(jié)叢孢菌。培養(yǎng)在不同培養(yǎng)基的DH 066和F 107，其分生孢子大小不同(表1)，DH 066在4種培養(yǎng)基中產(chǎn)生的分生孢子大小依次排列為20 g/L DA>20 g/L DIA>10 g/L WBA≈10 g/L CMA，F(xiàn) 107分生孢子大小依次排列為10 g/L CMA>10 g/L WBA≈20 g/L DIA>20 g/L DA(圖1和圖2)。在4種培養(yǎng)基中的DH 066和F 107的分生孢子均為梨形至倒卵形，1個分隔，偶見2個分隔，具2個分隔的分生孢子約占總體的0.01%(圖1E和圖2E)。分生孢子梗無色，直立，分隔，偶見分枝，分枝率約為0.4%(圖1F和圖2F)，分生孢子梗頂端具瘤節(jié)，分生孢子著生在瘤狀突起的小齒梗上。

2.2在不同培養(yǎng)基中DH 066和F 107的分生孢子產(chǎn)量

如圖3所示，DH 066和F 107的分生孢子均在10 g/L WBA培養(yǎng)基中產(chǎn)量最大，在20 g/L DA培養(yǎng)基中產(chǎn)量最低，其中F 107在10 g/L WBA中分生孢子產(chǎn)量和在其他3種培養(yǎng)基的產(chǎn)量有顯著差異(P<0.05)，而DH 066在4種培養(yǎng)基中分生孢子產(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)。

2.3不同培養(yǎng)基對DH 066和F 107菌絲生長的影響

不同培養(yǎng)基對DH 066和F 107生長速度的影響分別見圖4和圖5。從圖4可知，DH 066在相同的培養(yǎng)溫度(25 ℃)下，其生長速度快慢依次排列為10 g/L WBWA≈10 g/L CMWA>10 g/L WBA>20 g/L DIA>10 g/L CMA>20 g/L DA。于10 g/L WBWA和10 g/L CMWA培養(yǎng)基中生長最佳，5 d就已長滿整個平皿；20 g/L DA生長最差，10 d才能覆蓋整個平皿。從圖5可知，F(xiàn) 107在相同的培養(yǎng)溫度(25 ℃)下，其生長速度快慢依次排列為10 g/L WBWA>10 g/L CMWA>10 g/L WBA>20 g/L DIA≈10 g/L CMA>20 g/L DA。于10 g/L WBWA培養(yǎng)基中生長最佳，6 d長滿整個平皿；20 g/L DA生長最差，10 d還未覆蓋整個平皿。往往菌絲在最后1 d生長速度減慢(斜率小)，這是由于菌絲長滿整個平皿所致。

表1　捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌DH 066和F 107在不同培養(yǎng)基中分生孢子的大小

A,B,C,D分別是在10 g/L WBA、10 g/L CMA、20 g/L DA、20 g/L DIA培養(yǎng)基中的分生孢子；E.具2個隔的分生孢子；F.分生孢子梗分枝A,B,C,D are the conidia produced on 10 g/L WBA，10 g/L CMA，20 g/L DA，20 g/L DIA,respectively; E.2-septate conidia; F.branched conidiophores

圖1不同培養(yǎng)基中捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌DH 066分生孢子形態(tài)及分生孢子梗分枝

Fig.1Conidial morphology and branched conidiophores of nematode-trapping fungusArthrobotryoligosporastrain DH 066 in different media

A,B,C,D分別是在10 g/L WBA、10 g/L CMA、20 g/L DA、20 g/L DIA培養(yǎng)基中的分生孢子；E.具2個隔的分生孢子；F.分生孢子梗分枝A,B,C,D are the conidia produced on 10 g/L WBA，10 g/L CMA，20 g/L DA，20 g/L DIA,respectively; E.2-septate conidia; F.branched conidiophores

圖2不同培養(yǎng)基中捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌F 107分生孢子形態(tài)及分生孢子梗分枝

Fig.2Conidial morphology and branched conidiophores of nematode-trapping fungusArthrobotryoligosporastrain F 107 in different media

圖3　捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌DH 066和F 107在不同培養(yǎng)基中分生孢子量/cm2

圖4　捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌DH 066于6種不同培養(yǎng)基中的生長情況

圖5　捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌F 107于6種不同培養(yǎng)基中的生長情況

3　討論

本研究表明DH 066在20 g/L DA培養(yǎng)基中的分生孢子明顯要比其他培養(yǎng)基中的大，而F 107在10 g/L CMA中的分生孢子要比其他培養(yǎng)基的大，Singh R K等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的A.oligospora，其分生孢子長度最長可達(dá)51.0 μm，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中最長可達(dá)40 μm，而在Richard’s，YPSS，Sabouraud’s，PDA和CMA培養(yǎng)基中，分生孢子最長為30.50 μm，在含有線蟲的CMA培養(yǎng)基中產(chǎn)生的分生孢子要比不加線蟲的CMA培養(yǎng)基中的大。Haaed K[7]研究表明在含有線蟲的培養(yǎng)基中的分生孢子比不加線蟲的培養(yǎng)基中要小，這與Singh R K的研究結(jié)果相反，這種結(jié)果可能由于同種不同株導(dǎo)致的。這說明同一株少孢節(jié)叢孢菌在不同培養(yǎng)基中分生孢子大小不同，并且也說明同種不同株的分生孢子在同種培養(yǎng)基中分生孢子大小也不同。因此，鑒于在不同培養(yǎng)基中分生孢子的大小和形態(tài)有所差異，因此在鑒定種時，應(yīng)統(tǒng)一在CMA培養(yǎng)基中測量孢子大小，并進(jìn)行鑒定。

Cooke R C等[6]描述A.oligospora分生孢子倒卵形，分生孢子1個分隔并在分隔處溢縮，分生孢子梗不分枝。Haaed K[7]研究表明，A.oligospora在CMA培養(yǎng)基中產(chǎn)生的分生孢子倒卵形至梨形，分生孢子1個分隔，末端細(xì)胞是頂端細(xì)胞的2倍，分生孢子梗不分枝，以及國內(nèi)對該種不同分離株也有不少描述，但沒有報道過該種偶爾產(chǎn)生2個分隔的分生孢子以及分生孢子梗偶爾分枝的現(xiàn)象。

在10 g/L WBWA和10 g/L CMWA 培養(yǎng)基中，DH 066和F 107菌絲生長速度最快，在10 g/L WBA培養(yǎng)基兩株菌的生長速度略比10 g/L WBWA和10 g/L CMWA慢，但要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于10 g/L CMA。這表明WBA培養(yǎng)基要比CMA培養(yǎng)基更適合培養(yǎng)A.oligospora，也表明自來水比蒸餾水更適合培養(yǎng)該菌。但并不是營養(yǎng)越高菌絲生長速度越快，我們研究資料表明，在20 g/L CMA以及PDA培養(yǎng)基中，菌絲生長速度較慢，明顯要比4 g/L和10 g/L CMA慢，這與楊曉野等[8]的試驗結(jié)論一致。在相同培養(yǎng)基中DH 066生長速度明顯要比F 107快，這說明不同分離株的確存在差異。

在10 g/L WBA培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的分生孢子的量比在10 g/L CMA及20 g/L DIA明顯要多，這說明麩皮培養(yǎng)基不僅適合于A.oligospora的生長，也適合于大量生產(chǎn)分生孢子。麩皮價格相比玉米和其他糧食更低，從實用性的角度來說，更適合于今后的大規(guī)模生產(chǎn)。

早在20世紀(jì)20年代，Nathan Cobb就提出用線蟲的天敵來防治線蟲，直到1978年Coyrol J C等[17]才成功地用強力節(jié)叢孢(A.robusta，商品名：Royale 300)防治蘑菇生產(chǎn)上線蟲的危害；于1983年，Coyrol J C將A.irregularis(商品名：Royale 350)用于番茄生產(chǎn)中對根結(jié)線蟲的防治。目前，國內(nèi)也有用于植物線蟲的產(chǎn)品，如淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus，商品名：滅線寧)，厚孢輪枝菌(Pochoniachlamydosporia，商品名：線蟲必克)。但用于家畜寄生線蟲的生防治劑還沒有商品化，因為用于動物寄生線蟲防治的菌種需添加到家畜飼料中讓其采食，這樣既節(jié)約成本，又方便實施[18]。因此，要求菌種必須能夠通過家畜的消化道，與植物生防菌種相比，對菌種要求更高。由于本次研究的2株A.oligospora來源于糞堆和新鮮糞便，已通過家畜的消化道，說明其可能對家畜胃腸道的pH、酶等具有一定的耐受性，但還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗以驗證其通過家畜胃腸道的生存活力。

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Morphological Differences and Growth Characteristics of TwoArthrobotryoligosporaStrains in Different Media

LIU Wei,XU Qiang,LI Xiao-shan,LI Qing,CHEN Ming-yue,HAN Yuan,PENG Jian-wei,CHEN Chun-rong,WANG Fan,CAI Kui-zheng,MA Zhong-ren

(College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou，Gansu, 730030,China)

The influence of different cultures on nematode-trapping fungusArthrobotryoligosporastrains DH 066 and F 107 was studied for understanding its biological characteristics.The isolated strains DH 066 and F 107 were inoculated in 10 g/L wheat bran agar (WBA),10 g/L corn meal agar (CMA),20 g/L dextrose ionized agar (DIA) and 20 g/L dextrose agar (DA),cultured in incubator with 25 ℃,the morphological characteristics and the amount of conidia were carefully observed and counted.The growth status and growth length of DH 066 and F 107 mycelia,cultured in 6 different culture media,were monitored at the fixed time.The results showed that isolated strains DH 066 and F 107 were characterized by hyaline,erect,septate,occasionally branched conidiophores,which bear pyriform or obovoid,1-septate,occasionally 2-septate conidia.The amount of conidia in 10 g/L WBA is top producer in 4 different culture media.The hyphal growth rate was the best when strains DH 066 and F 107 were cultured in 10 g/L wheat bran water agar (WBWA) and 10 g/L corn meal water agar (CMWA).

nematode-trapping fungus;Arthrobotryoligospora; morphological characteristics

2016-01-17

甘肅省科技支撐計劃項目(1304NKCA157)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”(IRT13091)資助；西北民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目(Yxm2014184)

劉偉(1990-)，男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，主要從事家畜寄生線蟲病的生物防治研究。*通訊作者

S855.4

A

1007-5038(2016)08-0060-05