陳江寧，單國順，劉曉瑜，高慧*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600)

膽南星輔料成分分析及其清熱作用△

陳江寧1，2，單國順1，2，劉曉瑜1，2，高慧1，2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連116600)

目的：通過比較豬、牛、羊膽汁中膽酸類成分和對發(fā)熱小鼠清熱作用的差異，為膽南星炮制輔料的篩選提供參考依據。方法：采用HPLC-CAD法檢測三種膽汁中膽酸類成分(膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c)。色譜條件為WatersC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為0.5%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，體積流量：1mL·min-1；進樣量：20μL，Corona參數：氮氣壓力為35psi(241.3Kpa)，Filter：high，Range200pA。以干酵母制備小鼠發(fā)熱模型，觀察豬、牛、羊膽汁對發(fā)熱小鼠體溫的影響。結果：豬、牛、羊膽汁中膽酸類成分存在明顯差異，五種膽酸總量分別為1.4950%、0.3540%、0.5976%，豬膽汁中豬去氧膽酸含量最多，為1.1287%。豬、牛、羊膽汁對發(fā)熱小鼠均有一定的清熱作用，豬膽汁在6h時表現出清熱作用但不持久。牛膽汁在8h時表現出較明顯的清熱作用。羊膽汁清熱作用最明顯且持久。結論：豬、牛、羊膽汁無論膽酸類成分含量還是清熱作用均存在明顯差異，提示我們應對藥典規(guī)定的膽南星的三種膽汁進行區(qū)分，將其分別發(fā)酵制成膽南星后并結合藥效評價再進行篩選。

膽南星膽汁；高效液相色譜；膽酸；解熱

膽汁為來源于豬科動物豬SusscrofadomesticaBrisso，?？苿游稂S牛BosTaurusdomesticusGmelin或水牛BubalusL，?？苿游锷窖駽aprahircusL及綿羊OvisariesL的膽汁[1]。膽汁性苦寒，具有清熱解毒、利濕、止咳、通便等功效[2]。膽南星是由天南星與豬、牛、羊膽汁混合，經發(fā)酵制成，藥性由溫轉涼，功效由溫化寒痰轉變?yōu)榍寤療崽?。目前膽南星的炮制輔料和炮制工藝尚無統一標準。由于膽汁中的膽汁酸類成分具有一定的藥效活性，故本文通過比較研究三種膽汁中膽酸類成分和對發(fā)熱小鼠清熱作用的差異，為篩選發(fā)酵膽南星所需的輔料和統一膽南星的炮制工藝提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器

LC-20AB高效液相色譜儀(日本島津公司)；Corona電霧式檢測器(美國ESA公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MettlerAE240型十萬分之一分析天平(瑞士Mettler公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；HWS-080恒溫恒濕箱(上海精宏實驗設備有限公司)；電子體溫計(歐姆龍(大連)有限公司)；干酵母(安琪酵母股份有限公司)。

1.2試藥

膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100078-201415、110724-200207、100087-201411，質量分數均≥98%；鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，批號分別為ZO1011LA14、Z25M3L1，質量分數均≥98%；乙腈、甲醇為色譜純；水為純水。豬、牛、羊膽汁購于大連開發(fā)區(qū)灣里商場。

2 方法與結果

2.1膽酸類成分含量測定[3]

2.1.1膽酸類成分對照品溶液的制備 精密稱取膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為0.0426、0.0453、0.051、0.026、0.024mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2膽酸類成分供試品溶液的制備 豬、牛、羊膽汁為趁鮮破膽取得，置棕色瓶，于-20℃保存，備用。

精密稱取豬、牛、羊膽汁各2g，置50mL量瓶中，加入適量甲醇并超聲提取1h，放冷至室溫，補足甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3膽酸類成分含量測定色譜條件WatersC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)流動相為0.5%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫條件：0～5min，40%A～50%A；5～25min，50%A～57%A；體積流量：1mL·min-1；進樣量：20μL，Corona參數：氮氣壓力為35psi(241.3Kpa)，Filter：high，Range200pA[2]。

1.膽酸；2.豬去氧膽酸；3.牛磺膽酸鈉；4.鵝去氧膽酸；5.去氧膽酸圖 1膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c對照品色譜圖

1.膽酸；2.豬去氧膽酸；3.?；悄懰徕c；4.鵝去氧膽酸；5.去氧膽酸圖2 羊膽汁中膽酸類成分色圖譜

2.1.4方法學考察

2.1.4.1線性關系考察 精密吸取各膽酸類對照品溶液適量，注入液相色譜儀，測定，并記錄峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程，膽酸：Y=3149097.5910x+49800.5902(r=0.9992)，去氧膽酸：Y=1319880.8592x+2677.1690(r=0.9997)，豬去氧膽酸：Y=1022475x-26477.3854(r=0.9997)，鵝去氧膽酸：Y=275884.1685x+341.3370(r=0.9999)，?；悄懰徕c：Y=1834609.8531x-15358.4262(r=0.9997)，結果表明五種膽酸類成分的進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4.2精密度試驗 精密吸取各對照品溶液20μL，重復進樣6次，計算得膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c峰面積的RSD值分別為1.5%、1.8%、2.1%、1.1%、1.3%，結果表明儀器精密度良好，色譜圖見圖1。

2.1.4.3穩(wěn)定性試驗 取豬膽汁供試品溶液，分別在0、2、4、6、10、24h進樣，計算得膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c峰面積的RSD值分別為1.9%、2.0%、1.2%、1.6%、1.5%，結果表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.1.4.4重復性試驗 精密稱取同一批豬膽汁6份，制備供試品溶液，進樣測定，計算得膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；悄懰徕c質量分數的RSD值分別為0.7%、1.2%、2.4%、1.4%、2.1%，結果表明本方法重復性良好。

2.1.4.5加樣回收率試驗 取已知含量的豬膽汁樣品1g，平行6份，精密稱定，分別精密加入0.0426mg·mL-1膽酸、0.051mg·mL-1豬去氧膽酸、0.024mg·mL-1?；悄懰徕c、0.026mg·mL-1鵝去氧膽酸、0.0453mg·mL-1去氧膽酸對照品溶液適量，制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表1。

2.1.5含量測定 分別精密吸取牛、羊、豬膽汁供試品溶液20、10、10μL，按照“2.1.3”項下色譜條件進行含量測定，外標法計算各膽汁中五種膽酸類成分的質量分數，結果見表2。

2.1.6結果 豬、牛、羊三種膽汁中所含的成分有一定的差異。羊膽汁中檢測出上述五種膽酸類成分，但在牛膽汁和豬膽汁中分別未檢測出鵝去氧膽酸和去氧膽酸。同時，膽酸類成分的含量差異亦較大，豬、牛、羊膽汁中五種膽汁酸類成分總量分別為1.4950%、0.3540%、0.5976%，豬膽汁含有豬去氧膽酸的量最多，為1.1287%。三種膽汁中?；悄懰徕c含量均達到0.2%以上。

2.2小鼠清熱實驗

2.2.1干酵母混懸溶液的制備[4-6]稱取干酵母2g于乳缽中，逐漸加入蒸餾水研磨為均勻的懸漿，并定容于10mL量瓶中，即得20%酵母混懸液(現用現配)。

2.2.2動物及造模給藥[7]SPF級KM小鼠40只，體重18～22g(購于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-00011)。小鼠適應性喂養(yǎng)一周，自由飲食飲水，室溫(22±2)℃。

表1 豬膽汁中五種膽酸成分加樣回收率試驗(n=6)

表2 不同膽汁中膽酸類成分含量(%)

注：—表示未檢測出該成分

造模前，小鼠分別于每日上午8：00和下午3：00測量肛溫，連續(xù)測定3天。(將體溫計于探頭后3 cm處進行標記，確保體溫計每次伸入動物體內的長度一致)選取體溫在36.6～38.0 ℃且連續(xù)體溫變化小于0.3 ℃的小鼠，取其平均值作為正?；A體溫。按照體溫基礎值和體重均衡隨機分成5組，每組8只，分別為空白組、模型組、豬膽汁組、羊膽汁組、牛膽汁組。稱重后各組小鼠以10 mL/kg劑量皮下注射20%干酵母混懸液進行造模，同時灌胃膽汁(10 mL/kg)，空白對照組注射和給予同體積生理鹽水。于給藥后2.0、3.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0 h 測定肛溫，與基礎體溫比較，計算溫差。

2.2.4 結果 觀察小鼠體溫12 h內的變化情況，由表3可以看出，各組和模型組相比，豬、牛、羊膽汁對發(fā)熱小鼠均有一定的清熱作用。其中，豬膽汁在6 h時表現出清熱作用但不持久。牛膽汁在8 h時表現出較明顯的清熱作用。羊膽汁清熱作用最明顯且持久。

表3 三種膽汁對發(fā)熱小鼠體溫變化的影響

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討論

由于膽汁中的膽酸類成分沒有紫外吸收，王一博[3]等對HPLC-CAD法和HPLC-ELSD法測定膽汁中膽酸類成分進行了分析比較，結果表明HPLC-CAD法更適合膽酸類成分的測定，因此本實驗采用HPLC-CAD法檢測豬、牛、羊膽汁中五種膽酸類成分的含量，本方法簡便、準確，重復性較好。實驗數據表明，豬、牛、羊膽汁中膽酸類成分存在明顯差異，五種膽酸總量分別為1.495 0%、0.354 0%、0.597 6%，其中豬膽汁中5種膽酸總量最高，主要是豬去氧膽酸含量高，為1.128 7%，但去氧膽酸未檢出。牛膽汁中5種膽酸總量最低，其中鵝去氧膽酸未檢出，膽酸含量明顯偏低。三種膽汁中?；悄懰徕c含量相對比較接近，在0.2%-0.5%之間。

豬、牛、羊膽汁對發(fā)熱小鼠均有一定的清熱作用，其中，豬膽汁在6 h時表現出清熱作用但不持久。牛膽汁在8 h時表現出較明顯的清熱作用。羊膽汁清熱作用最明顯且持久。

膽南星是一味藥用歷史悠久的曲劑，清朝的《幼幼集成》記載“能裝過九膽誠為至寶，任彼真正牛黃莫能及此”[8]。雖然膽南星有著較好的臨床療效，但是現行的藥典和各省炮制規(guī)范對膽南星的炮制工藝并沒有一個統一的標準，市場加工及應用情況較為混亂，沒有最大的發(fā)揮出膽南星的藥用價值。本實驗對不同膽汁中的膽酸成分和解熱作用進行了比較研究，發(fā)現豬、牛、羊膽汁無論膽酸類成分含量還是清熱作用均存在明顯差異，我們應對藥典規(guī)定的膽南星的三種膽汁進行區(qū)分，將其分別發(fā)酵制成膽南星并結合藥效評價再進行篩選。包括制成膽南星后的成分及作用比較，篩選出膽南星的適宜輔料、統一膽南星的炮制工藝。

[1] 蔣蕾.羊膽汁與其主要成分抗炎作用及作用機制的比較研究[D].黑龍江中醫(yī)藥大學，2007.

[2] 中國藥典[S].一部.2015：319.

[3] 王一博，王春雨，曲范娜，等 高效液相色譜-電霧式檢測器同時測定豬、牛、羊、熊膽粉中5種膽汁酸的含量[J].分析化學，2014，42(1)：109-112.

[4] 馮淑怡，李先榮，孫建寧.連翹酯苷抗感染、解熱作用研究[J].現代生物學進展，2006，6(10)：73-75.

[5] 段紅妍，趙 琴，馬 成.銀花連翹配伍對發(fā)熱大鼠體溫和血清NO含量的影響[J].新疆中醫(yī)藥，2009，27(2)：11-13.

[6] 段紅妍，馬 成.金銀花與連翹配伍退熱機制的實驗研究[J].現代中西醫(yī)結合雜志，2009，18(11)：1214.

[7] 陳慧慧，張 敏，虞慧娟.等柴胡和黃芩配伍解熱抗炎作用研究[J].中成藥，2011，33(9)：1596-1598.

[8] 陳復正.幼幼集成(清刊本，卷二)[M].38.

CompositionAnalysisandCompareofClearingHeatEffectsamongArisaemacumBileProcessing

CHENJiangning1，2，SHANGuoshun1，2，LIUXiaoyu1，2，GAOHui1，2*

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.ChineseMateriaMedicaProcessingEngineeringCenterofLiaoningProvince，Dalian116600，China)

Objective：To compare bile acids composition in pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile and differences of clearing heat effect in mice，and provide a reference basis for screening out the arisaema cum bile processing adjuvants.Methods：HPLC-CAD method was used to detect the bile acid composition (cholic acid，deoxidationcholic acid，hyodeoxycholic acid，chenodeoxycholic acid，sodium taurocholic acid) in three kinds of bile.The chromatographic condition was following：Waters C18column (250mm×4.6mm，5μm)，0.5% Formic acid water (A)-Acetonitrile (B)，gradient elution，Volume flow：1mL·min-1，Corona parameters：the nitrogen pressure was35psi (241.3Kpa)，the Filter：high，Range200pA.The fever model of mice was induce with dry yeast，the effects of clearing the heat on the model among pig’s bile，bilis bovina and shee Pbile were observed and compared.Results：The total amount of the five kinds of bile acids in pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile were1.4954%，0.3540% and1.4954%.pig’s bile contains the most amount of hyodeoxycholic acid，was1.1287%.The3kinds of biles all showed clearing heat function.The pig’s bile showed clearing heat effect at6h but not persistent.Bilis bovina showed a significant effect of clearing heat at8h.Shee Pbile could clear heat significant and persistent.Conclusion：Both the contents of five kinds of bile acids and the effects of clearing heat are different among the pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile,In pharmacopoeia we distinguish the Pinellia Cum Bile with three kinds of bile,then we use pharmacodynamic evaluation to filt the which bile fermente Arisaema Cum Bile is best.

Arisaema cum Bile；HPLC-CAD；cholic acid；clearing heat

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.008

2016-02-01)

公益性行業(yè)科研專項(No.201507004-03)

*

高慧，教授，博士;研究方向：中藥炮制原理；電話：0411-85890146，E-mail：gaohuitcm@163.com