曹　建， 賈子才， 叢培旭， 陶素媛， 李兆杰， 徐　杰， 薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

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冰島刺參和南非花刺參腦苷脂分子種的比較*

曹建， 賈子才， 叢培旭， 陶素媛， 李兆杰， 徐杰??， 薛長湖

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

利用高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-Q-TOF)分析比較冰島刺參(Cucumariafrondosa)和南非花刺參(Stichopusvariegatus)腦苷脂的分子種組成。以氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液提取，經(jīng)皂化和SPE凈化，在正離子模式下，通過自動二級(MS/MS)方式同時獲取腦苷脂分子的一級和二級質(zhì)譜圖。篩取含180Da中性丟失碎片的分子，再結(jié)合二級質(zhì)譜中的長鏈堿和脂肪酸碎片，確定每種腦苷脂分子的結(jié)構(gòu)。研究表明:一次性從冰島刺參中分析出56種腦苷脂分子，從南非花刺參中分析出109種腦苷脂分子；南非花刺參含長鏈堿種類較多，為15種，冰島刺參含長鏈堿11種。冰島刺參腦苷脂中鞘氨醇型長鏈堿占91.84%，南非花刺參腦苷脂中鞘氨醇型長鏈堿占85.97%；脂肪酸的組成均為17～25碳的飽和或單不飽和脂肪酸，且以24碳脂肪酸為主。冰島刺參腦苷脂中2-羥基脂肪酸占總脂肪酸的33.50%，飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸≈2∶3；南非花刺參腦苷脂中2-羥基脂肪酸占總脂肪酸的76.73%，飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸≈2∶1。研究結(jié)果顯示，在抑制腫瘤細胞增長、預防癌癥方面南非花刺參腦苷脂較冰島刺參腦苷脂可能具有更好的生物活性。本研究為不同海參腦苷脂的活性研究和營養(yǎng)評價提供了參考與借鑒。

腦苷脂；高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法；冰島刺參；南非花刺參；分子種

引用格式：曹建， 賈子才， 叢培旭， 等. 冰島刺參和南非花刺參腦苷脂分子種的比較[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(9): 38-44.

CAO Jian, JIA Zi-Cai, CONG Pei-Xu, et al. Comparison of cerebroside molecular species from sea cucumbersCucumariafrondosaandStichopusvariegatus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(9): 38-44.

腦苷脂又稱酰基鞘氨醇己糖苷，是存在于細胞膜中的內(nèi)源性活性化合物，由神經(jīng)酰胺(Cer)連接一分子己糖構(gòu)成，神經(jīng)酰胺通過C-1位上羥基與己糖通過β糖苷鍵連接而成，包括葡萄糖腦苷脂和半乳糖腦苷脂，屬于神經(jīng)鞘脂類[1]。神經(jīng)酰胺是由長鏈脂肪酸中的羧基與神經(jīng)鞘氨醇(又稱長鏈堿(Long-chain base,LCB))的氨基經(jīng)脫水以酰胺鍵相連形成的一類酰胺類化合物[2]。神經(jīng)鞘氨醇是最簡單的鞘脂[3]，根據(jù)神經(jīng)鞘氨醇的不同，腦苷脂可以分為鞘氨醇型腦苷脂(d型)和植物鞘氨醇型腦苷脂(t型)。鞘氨醇羥基位于C-1和C-3位上，氨基位于C-2位上。植物鞘氨醇羥基位于C-1、C-3和C-4位上，氨基位于C-2位上。不同結(jié)構(gòu)的神經(jīng)酰胺和長鏈堿在體內(nèi)的吸收和代謝不完全相同，Sugawara等[1]研究發(fā)現(xiàn)小腸上皮細胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)運機制使得植物鞘氨醇的吸收利用率遠低于鞘氨醇。

腦苷脂脂肪酸一般為16～25個碳的2-羥基和非羥基脂肪酸，包括飽和及單不飽和脂肪酸。哺乳動物腦苷脂的鞘氨醇主要為d18∶1和d18∶2；而植物腦苷脂的鞘氨醇主要為d18∶1、d18∶0，植物鞘氨醇t18∶0也較為常見[5][6]。而海參腦苷脂結(jié)構(gòu)新穎，與哺乳動物和植物腦苷脂相比有顯著不同[7]，不但含有哺乳動物和植物體內(nèi)常見的d型鞘氨醇，還含有t型鞘氨醇，如d18∶3、d19∶3、t19∶3。腦苷脂的生物活性主要體現(xiàn)在抗菌[8]、抗腫瘤[9]、抗肝毒[10]等方面。武風娟等研究發(fā)現(xiàn)海參腦苷脂對H2O2誘導的PC12細胞的氧化損傷具有一定的保護作用[11]。董喆等研究表明海參腦苷脂對酵母浸粉誘導的高尿酸血癥有明顯改善作用[12]。Xu等從海地瓜中得到的腦苷脂類化合物顯示出顯著的抗脂肪肝活性[2]。研究海參腦苷脂的結(jié)構(gòu)對于其活性及營養(yǎng)評價具有重要意義。

海參腦苷脂的結(jié)構(gòu)組成是其活性研究與營養(yǎng)評價的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的長鏈堿和脂肪酸結(jié)構(gòu)分析主要通過薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜(GC)或者氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3]。以上方法步驟冗繁、樣品消耗量大且效率不高。隨著軟電離技術(shù)、高分辨質(zhì)量分析技術(shù)和串聯(lián)技術(shù)的發(fā)展，腦苷脂分子種組成的測定工作取得了較大進步。Xu等[3]通過液相色譜-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS-IT-TOF)測定了海地瓜、北大西洋海參和仿刺參腦苷脂，分別鑒定出12、52、26種葡萄糖腦苷脂分子，但該法靈敏度相對較低。邢培培等利用液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-Q-TOF)一次性分析出123種美國紅參腦苷脂分子[2]。Xie等研究表明LC-Q-TOF具較高的靈敏度與分辨率，分析速度快且質(zhì)量范圍寬[14]。因此，在分析結(jié)構(gòu)復雜的腦苷脂化合物方面，LC-Q-TOF法具有更強的適用性。

海參作為海洋中重要的生物，長久以來為人們食用，其中所含的海參多糖[15]、膠原蛋白、海參磷脂等物質(zhì)在降血脂、抗腫瘤、治療糖尿病、提高免疫力方面功能顯著[16-19]。不同產(chǎn)地的海參營養(yǎng)成分受到其生長環(huán)境的影響而不同。冰島刺參(Cucumariafrondosa)又稱葉瓜參，屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)枝手目(Dendrochirota)瓜參科(Cucumariidae)海洋動物，主要產(chǎn)于寒帶水域，分布于格陵蘭到馬薩諸塞的西大西洋水域，挪威、英國、俄羅斯都有分布。其體壁總脂含量高達13.51%[20]，具有較高的研究價值。南非花刺參(Stichopusvariegatus)屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroidea)楯手目(Aspidochirota)刺參科(Stichopodidae)，生長于南非，處于副熱帶高壓帶，是重要的食用海參之一。我國臺灣、廣東、廣西以及海南島海域均有分布。本文通過LC-Q-TOF法高通量分析冰島刺參和南非花刺參的腦苷脂分子種，比較不同生長環(huán)境下2種海參腦苷脂的差異性，為不同海參之間腦苷脂種類的分析比較提供了參考。

1　實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity Series液相色譜儀，G6540 Q-TOF質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；AB 135-S分析天平(梅特勒-托利多集團)；T10 basic分散機(德國IKA公司)；DTU-1C氮吹儀(日本TAITEC公司)；Milli-QA超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

甲醇(色譜純，德國Merck公司)，乙酸銨，乙酸(色譜純，美國Sigma公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；SGF254薄層色譜硅膠預制板(煙臺市化學工業(yè)研究所)；柱層析硅膠(試劑級，300～400目，青島海洋化工廠)；Supelclean ENVI-18固相萃取柱(3mL，美國Supelco公司)；0.22μm有機濾膜(美國Agela公司生產(chǎn))。

冰島刺參(Cucumariafrondosa)、南非花刺參(Stichopusvariegatus)干品，購于青島市南山市場。

1.2 樣品制備

冰島刺參和南非花刺參各取6只干品粉碎為干粉(100～200目)，混合均勻后各稱取0.1g(每種海參樣品平行3份)。加入氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)5mL振搖5min，超聲浸提30min，過濾，反復浸提5遍。濾液用氮氣濃縮至干。加入100μL的4mol/L氫氧化鉀溶液以及1.0mL甲醇，置于37 ℃水浴中皂化1h，再分散于0.8mL水中，用2mL氯仿萃取5遍，有機相用氮氣濃縮至干，得到冰島刺參和南非花刺參腦苷脂粗提物。再通過Supelclean ENVI-18 SPE正相硅膠柱(3mL)凈化，以氯仿/甲醇溶液梯度洗脫(100∶0～90∶10,V/V)，分部收集洗脫液，采用TLC法初步檢測收集物的組成及腦苷脂純度，合并腦苷脂組分，氮吹后，以500μL甲醇溶解，待LC-Q-TOF分析。

1.3 LC-Q-TOF操作條件

1.3.1 液相色譜條件采用Agilent Plus C18色譜柱(100mm×2.1mm，3.5μm)；流速0.2mL/min；95%甲醇-水溶液(含5mmol/L乙酸銨和0.05%乙酸)等度洗脫；柱溫30℃；進樣體積5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描模式；干燥氣(N2)流速5L/min，溫度280℃；毛細管電壓3.5kV；噴霧氣壓2.1×105Pa；鞘氣(N2)流速11L/min，溫度280℃；噴嘴電壓500V；裂解電壓135V。一級質(zhì)譜采集范圍m/z700～900，掃描速率100ms；自動二級質(zhì)譜采集范圍m/z100～900，掃描速率100ms；每個循環(huán)最大分析母離子數(shù)為5，離子計數(shù)閾值為2 000，碰撞能25eV。

2　結(jié)果與討論

2.1 LC-Q-TOF法分析冰島刺參腦苷脂分子種結(jié)果

采用1.3方法，正離子掃描模式下，不同分子在所采用的反相液相色譜條件下依照疏水性不同而分離。圖1為冰島刺參(見圖1a)、南非花刺參(見圖1b)腦苷脂的總離子流(TIC)圖及提取180Da中性碎片(質(zhì)譜提取離子窗口設為±0.2)后的提取離子流(pNLC)圖，色譜峰重合且信噪比大于10即可判定為腦苷脂色譜峰，依此篩選母離子。然后依次提取不同母離子的二級質(zhì)譜圖，解析其結(jié)構(gòu)。

圖2為d17∶1-C24∶1的二級質(zhì)譜圖，可發(fā)現(xiàn)LCB(m/z250.252 6)離子碎片，并有脂肪酸(FA)子離子碎片(m/z366.368 4)，據(jù)此可推測出長鏈堿為d17∶1，其脂肪酸鏈為C24∶1。高分辨質(zhì)譜測得[M+H]+峰的精確質(zhì)量數(shù)為796.661 8，偏差為-5.9×10-6，長鏈堿偏差為-4.12×10-6，可計算出其分子式為C47H89NO8，驗證其結(jié)構(gòu)為d17∶1-C24∶1。另外，將其一級離子提取色譜圖的離子峰以及脫水峰的積分面積進行加和，采用面積歸一化法，得到該結(jié)構(gòu)腦苷脂的相對含量。同理，可分析出冰島刺參腦苷脂的其他分子種和南非花刺參腦苷脂分子種及相對含量。

(a.冰島刺參腦苷脂 Cerebrosides fromCucumariafrondosa; b.南非花刺參腦苷脂Cerebrosides fromStichopusvariegatus)

圖1腦苷脂的總離子流圖(TIC)和母離子的中性丟失離子流圖(pNLC)

Fig.1Total ion chromatogram (TIC) and precursor neutral loss chromatogram (pNLC) of cerebrosides

采用該方法分析腦苷脂分子種，發(fā)現(xiàn)在不同保留時間會出現(xiàn)分子式相同的分子種(如保留時間4.05和5.64min的峰均為t19∶3-C24∶1h)，推測兩者的LCB雙鍵位置不同或LCB末端存在異丙基(iso-)和反異丙基(ante-iso)取代情況[21]。

采用1.3.2方法，分析出4種冰島刺參腦苷脂系列物(見表1，系列物I：普通鞘氨醇-非羥基型脂肪酸；系列物-II：普通鞘氨醇-羥基型脂肪酸；系列物-III：植物鞘氨醇-羥基型脂肪酸)和3種南非花刺參腦苷脂系列物(見表1，系列物I、系列物-II、系列物-III)，包括56種冰島刺參腦苷脂分子和109種南非花刺參腦苷脂分子。

2.2 冰島刺參和南非花刺參腦苷脂分子種分析比較

冰島刺參中含量最高的腦苷脂為系列物I，含量較高的腦苷脂分子種為d17∶1-C24∶1(16.14%)、d17∶1-C24∶1h(10.52%)、d18∶2-C18∶0(8.53%)、t17∶0-C24∶1h(6.11%)等；南非花刺參中含量最高的為腦苷脂系列物-II，含量較高的腦苷脂分子種為t18∶0-C24∶0h(10.16%)、d17∶1-C24∶1h(5.69%)、d17∶1-C22∶0h(4.59%)、d18∶2-C18∶0(4.35%)，誤差均在±10×10-6以內(nèi)。相比于冰島刺參，南非花刺參腦苷脂分子種類繁多，結(jié)構(gòu)復雜。

(FA：脂肪酸Fatty acids；LCB：長鏈堿Long-chain base；Cer：神經(jīng)酰胺Ceramide)

腦苷脂系列物Cerebrosideseries相對含量①/%冰島刺參②南非花刺參③I66.5023.27II25.3362.70III8.1614.03

Note: ①Relative content; ②Cucumariafrondosa; ③Stichopusvariegatus

通過本方法分析出冰島刺參腦苷脂的長鏈堿11種，其中d17∶1(56.13%)、d18∶2(16.71%)、d19∶2(8.87%)、t17∶0(6.29)為其主要長鏈堿；南非花刺參腦苷脂的長鏈堿15種，其中d17∶1(33.10%)、d18∶1(16.07%)、d18∶2(16.06%)、t18∶0(10.69%)為其主要長鏈堿(見圖3)。南非花刺參腦苷脂長鏈堿種類較多，且植物鞘氨醇的相對含量略高于冰島刺參，長鏈堿可誘導多種腫瘤細胞的凋亡，且其雙鍵個數(shù)、羥基個數(shù)、鏈長對抗癌活性影響顯著[22]，故推測南非花刺參腦苷脂在抑制腫瘤增殖方面具有更好的生物活性。

(a.不同種類長鏈堿的相對含量; b.植物鞘氨醇長鏈堿與鞘氨醇長鏈堿相對含量比例。a.The percent of different species of LCB; b.The ratio of phytosphingosine and sphingosine.)

圖3冰島刺參和南非花刺參腦苷脂中長鏈堿的相對含量

Fig.3The percent of LCB from sea cucumberCucumariafrondosaandStichopusvariegatus

冰島刺參和南非花刺參腦苷脂分子中脂肪酸鏈主要為碳數(shù)17～25的脂肪酸，其中既包括非羥基脂肪酸(NFA)和2-羥基脂肪酸(HFA)，以及飽和脂肪酸(SFA)也包括單不飽和脂肪酸(MUFA)。兩者都以24碳為主，冰島刺參腦苷脂分子中24碳脂肪酸比例為50.01%，南非花刺參腦苷脂分子中24碳脂肪酸比例為43.44%。冰島刺參腦苷脂分子中HFA占33.50%，NFA占66.50%，而南非花刺參腦苷脂分子中HFA占76.73%，NFA占23.27%(見圖4)；SFA與MUFA的比例而言，冰島刺參約為2∶3，南非花刺參約為2∶1，可見2種海參腦苷脂分子脂肪酸碳數(shù)以及主要脂肪酸雖相似，但南非花刺參腦苷脂分子脂肪酸羥基化程度更高，有研究表明，羥基脂肪酸對于哺乳動物細胞功能的調(diào)節(jié)作用顯著[23]，尤其對于維持中樞髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響[24]。本實驗室開展了海參腦苷脂的神經(jīng)營養(yǎng)活性研究，結(jié)果表明冰島刺參腦苷脂系列物(I，II，III)對PC12細胞具有一定的促分化作用，并能促進相關(guān)神經(jīng)生長因子突觸素和神經(jīng)生長蛋白(GAP-43)的表達，其中腦苷脂系列物III的效果最為顯著。由此，推測南非花刺參腦苷脂可能具有更好的生物活性。

(a.不同碳數(shù)脂肪酸的相對含量;b.非羥基脂肪酸與2-羥基脂肪酸的相對含量比例;c.飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸的相對含量比例。a.Relative contents of different carbon numbers of fatty acids; b.Relative contents of non-hydroxyl fatty acids and 2-hydroxyl fatty acids; c.Relative contents of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids. NFA：非羥基脂肪酸Non-hydroxyl fatty acids；HFA：2-羥基脂肪酸2-hydroxyl fatty acids；SFA：飽和脂肪酸Saturated fatty acids；MUFA：單不飽和脂肪酸Monounsaturated fatty acids.)

圖4冰島刺參和南非花刺參腦苷脂中脂肪酸的相對含量

Fig.4Relative contents of different species of fatty acids in cerebrosides from sea cucumberCucumariafrondosaandStichopusvariegatus

3　結(jié)論

本文分析比較了冰島刺參和南非花刺參腦苷脂的分子種組成。共分析出56種冰島刺參腦苷脂分子，109種南非花刺參腦苷脂分子，其中南非花刺參所含長鏈堿種類較多，含有15種，冰島刺參含有長鏈堿11種，且南非花刺參脂肪酸羥基化程度更高,預示著南非花刺參腦苷脂在抑制腫瘤細胞增長、預防癌癥方面較冰島刺參腦苷脂可能具有更好的生物活性。本文也為不同海參腦苷脂的活性研究及營養(yǎng)評價提供了基礎(chǔ)。

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責任編輯朱寶象

Comparison of Cerebroside Molecular Species from Sea CucumbersCucumariafrondosaandStichopusvariegatus

CAO Jian, JIA Zi-Cai, CONG Pei-Xu, TAO Su-Yuan, LI Zhao-Jie, XU Jie, XUE Chang-Hu

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

To compare cerebroside molecular species from sea cucumbersCucumariafrondosaandStichopusvariegatus, liquid chromatography—quadrupole-time-of-flight (LC-Q-TOF) mass spectrometry was used. The cerebrosides from sea cucumbers were extracted with chloroform-methanol (2∶1, V/V) solution, saponified, and purified by a SPE cartridge. In positive electrospray ionization (ESI) mode, the mass spectra of precursor ion scan and product ion scan were obtained simultaneously through the automatic MS/MS mode. Cerebroside molecules were separated and identified on the basis of both mass and hydrophobicity. According to total ion chromatogram (TIC) and neutral loss chromatogram (NLC) of 180 Da, the shapes of TLC and NLC were nearly the same. Cerebroside molecular species were screened by identifying overlapping peaks with signal to noise ratio (S/N) > 10. Fifty-six cerebroside molecular species fromCucumariafrondosaand 109 cerebroside molecular species fromStichopusvariegatuswere identified rapidly. After comparison, more than 15 long-chain bases (LCB) of cerebrosides were found inStichopusvariegatusthan inCucumariafrondosa(11 LCB). The percentage of the total sphingosines of cerebrosides inCucumariafrondosaandStichopusvariegatuswas 91.84% and 85.97%, respectively. For fatty acids, the carbon number varied between 17 and 25. The 24 carbon fatty acids were predominant. The relative ratio of saturated fatty acids to monounsaturated fatty acids of cerebrosides fromCucumariafrondosawas about 2∶3, and the percentage of 2-hydroxy fatty acids was about 33.50%. The relative ratio of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids fromStichopusvariegatuswas about 2∶1, and the percentage of 2-hydroxy fatty acids was about 76.73%. Major fatty acids composition of cerebroside molecular species fromStichopusvariegatuswas similar to that fromCucuma-riafrondosa; however they were highly hydroxylated, which regulate mammalian cell function significantly. This study indicated that cerebrosides fromStichopusvariegatusmight have a better perspective than those fromCucumariafrondosain inhibiting tumor cell growth and preventing cancer. In addition, the study provided a basis for the evaluation of bioactivity and nutrition of cerebrosides from different sea cucumbers.

cerebroside; liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry;Cucumariafrondosa;Stichopusvariegatus; molecular species

國家自然科學基金項目(31201329)資助

2015-06-01；

2016-04-01

曹建(1990-)，男，碩士生。E-mail: caozijian1106@163.com

??通訊作者：E-mail: xujie9@ouc.edu.cn

TS254.1

A

1672-5174(2016)09-038-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150196

Supported by National Natural Science Foundation of China(31201329)