于林楠　翟宏穎

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 錦州 121000

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山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響

于林楠1*翟宏穎2

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，遼寧 錦州 121000

目的：研究山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用MTT法檢測(cè)山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影響。結(jié)果:不同濃度的山慈菇提取物對(duì)HT29細(xì)胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系；山慈菇提取物干預(yù)后誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；山慈菇提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。結(jié)論:山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cyt-C、Bax、Caspase-3下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

山慈菇提取物；結(jié)腸癌HT29細(xì)胞；凋亡

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率逐年增高，隨著手術(shù)、放療、化療等的進(jìn)步，早中期結(jié)腸癌治療效果明顯提高，但對(duì)于中晚期、高齡及難手術(shù)患者缺少有效的治療方法。目前，越來(lái)越多的醫(yī)務(wù)科研工作者將目光投向天然動(dòng)植物的研究，從中尋找可以防治腫瘤的有效成分，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[1-2]。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一，為蘭科植物中杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭及云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖，具有解毒、化痰、散結(jié)等功效，臨床上常以配伍用藥的形式應(yīng)用于各種腫瘤的治療，其中包括結(jié)直腸癌[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制血管生成、抗炎以及影響造血系統(tǒng)等作用，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明[4]。研究擬探討山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響，以期為山慈菇運(yùn)用于結(jié)腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-175(日本Sanyo公司)；流式細(xì)胞儀6HT2L(美國(guó)Guava Easy Cyte公司)；BX50顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(tái)VD1320(哈爾濱東聯(lián)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)CR21(日本Hitachi公司)；凝膠成像儀及凝膠成像分析系統(tǒng) GelDOC2000(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2材料山慈菇提取物(沈陽(yáng)藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供，純度為98 %。稱取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去離子水加熱，冷卻過(guò)濾，濃縮至200mL，加入95%乙醇冷藏洗滌，最后獲得干粉6g，使用培養(yǎng)基配置成所需要的濃度)。胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；RPMI1640 培養(yǎng)液(Gibco生物工程有限公司)；0.5%二甲基亞砜、MTT(DMSO，美國(guó)Sigma公司)；Annexin V/PI凋亡試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，Cyt-C抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、β-actin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；吸附(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

2　方法

2.1人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的培養(yǎng)將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，留取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1mL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。空白對(duì)照組加入培養(yǎng)基0.1mL，不同濃度的山慈菇提取物組以10、20、30mg/mL培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72h后，吸棄各孔中培養(yǎng)液，每孔加入0.1mLMTT[含 5%磷酸鹽緩沖液(PBS)]，在37℃下孵育4h后棄去上清，加入0.5%DMSO 0.1mL，振蕩搖勻，室溫放置10min。在0.1mL DMSO中發(fā)現(xiàn)藍(lán)紫色的MTT甲臜沉淀物，使用ELISA法以酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1mL，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。以0(空白對(duì)照組)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培養(yǎng)細(xì)胞24h后，每孔懸浮細(xì)胞用PBS洗2次，加入500μl Binding Buffer和FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ(20μg/mL)10μl和碘化丙啶(PI，50μg/mL)5μl，避光反應(yīng)15min，采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)，計(jì)算凋亡率。2.4Western blot法檢測(cè)Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔0.1mL，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。以0(空白對(duì)照組)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培養(yǎng)細(xì)胞24h后，用裂解液抽提。根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明提取各組細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞的蛋白樣品定量，變性；進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜；脫脂牛奶封閉2h；洗膜，加入Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 (稀釋倍數(shù)1∶1000)的一抗以及β-actin(稀釋倍數(shù)1∶1000)作為陽(yáng)性對(duì)照，4℃過(guò)夜；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，然后洗膜、風(fēng)干；ECL發(fā)光顯影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3　結(jié)果

3.1細(xì)胞抑制率的測(cè)定MTT結(jié)果顯示，隨著時(shí)間與藥物干預(yù)濃度的增加，山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1　不同時(shí)間、濃度山慈菇提取物對(duì)細(xì)胞的抑制率　

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01。

3.2細(xì)胞凋亡率的測(cè)定與空白對(duì)照組比較，10、20、30mg/mL山慈菇提取物培養(yǎng)細(xì)胞24h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，并且隨著山慈菇提取物濃度的增加，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并呈劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表2　不同濃度山慈菇提取物對(duì)細(xì)胞的抑制率 ±s,n=12)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01。

3.3Western blot法檢測(cè)Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3蛋白表達(dá)的測(cè)定由圖1可知，10、20、30 mg/mL山慈菇提取物培養(yǎng)細(xì)胞24h 后，山慈菇提取物可使Cyt-C、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并呈劑量依賴關(guān)系。

1.空白對(duì)照組；2.10mg/mL山慈菇提取物組；3.20mg/mL山慈菇提取物組；4.30mg/mL山慈菇提取物組圖1　Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

4　討論

細(xì)胞凋亡是基因介導(dǎo)的主動(dòng)發(fā)生的程序性死亡，在正常情況下細(xì)胞凋亡與增殖維持動(dòng)態(tài)平衡[5]。細(xì)胞凋亡既可以出現(xiàn)在正常的生理過(guò)程中，也可以出現(xiàn)在多種疾病中，如腫瘤因關(guān)閉了線粒體的這一調(diào)控功能，使細(xì)胞凋亡減少出現(xiàn)細(xì)胞過(guò)度增殖現(xiàn)象[6]。因此腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖失控相關(guān)，還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7]，中間牽涉很多促凋亡和抗凋亡細(xì)胞因子。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡和調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)不斷深入，選擇性得抑制細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療惡性腫瘤的一個(gè)方向[8]。實(shí)驗(yàn)采用MTT法證明山慈菇提取物能夠抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且抑制作用隨著劑量的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。另外在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的HT29細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，山慈菇提取物能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且具有劑量依賴性。

凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。而Caspase家族的凋亡途徑包括兩條：①死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑(Fas-FasL)；②線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性調(diào)亡途徑。而B(niǎo)cl-2家族成員又與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑密切相關(guān)[9]。研究表明：細(xì)胞在外界以及DNA損傷等內(nèi)部信號(hào)的刺激下將Bcl-2家族中的成員聚集在線粒體，在促凋亡與抑凋亡因子的作用下調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放，在胞漿中其與凋亡相關(guān)因子結(jié)合形成多聚體，激活Caspase-9，再激活其下游的Caspase-3，細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。Bcl-2作為抑凋亡基因，在生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用，其通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)病。而B(niǎo)ax則與其相反，它能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。若Bcl-2過(guò)表達(dá)，則與Bax形成異二聚體抑制細(xì)胞凋亡，若Bax過(guò)表達(dá)，則形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。另外，研究提出Bcl-2/Bax比率關(guān)系細(xì)胞凋亡，當(dāng)比率增大時(shí)，細(xì)胞凋亡受到抑制[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western-blot法檢測(cè)Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3在人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，來(lái)研究山慈菇提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，山慈菇提取物通過(guò)提高Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)降低Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，山慈菇提取物可以通過(guò)調(diào)節(jié)Cyt-C、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)來(lái)抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但本實(shí)驗(yàn)處于初步探討階段，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)山慈菇的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)掘山慈菇在腫瘤治療中的作用。

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(編輯：穆麗華)

Effects of Cremastra Appendiculata Extract on the Apoptosis of Human Colon Cancer HT29 Cells

YU Linnan1ZHAI Hongying2

1. Dept. of Oncology，the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universiy，Jinzhou 121000，China；2.Dept. of Traditional Chinese Medicine，the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universiy，Jinzhou 121000，China

Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells;the flow cytometry to determine the apoptosis rates;Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract; the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased(P<0.05).Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

2016-06-13

于林楠(1984-)，男，漢族，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向?yàn)槲改c道腫瘤。E-mail:yln-lll@163.com

R282.71

A

1007-8517(2016)16-0017-03