福辛普利保護高尿酸血癥性腎病大鼠的療效分析

劉靜，巫斌

廈門市仙岳醫(yī)院內(nèi)科，福建廈門361012

論著

福辛普利保護高尿酸血癥性腎病大鼠的療效分析

劉靜，巫斌

廈門市仙岳醫(yī)院內(nèi)科，福建廈門361012

目的 分析研究福辛普利對高尿酸血癥性腎病大鼠血漿血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和醛固酮 （ALD）水平的表達及腎間質(zhì)纖維化的影響，從而探討其在高尿酸血癥性腎病大鼠中的保護作用。方法2014年6月—2015年6月間在廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心選取清潔型SD大鼠80只，隨機分為造模組60只，對照組20只；高尿酸血癥性腎病大鼠模型的建立采用腺嘌呤＋鹽酸乙胺丁醇灌胃法，造模成功后將造模組動物隨機分為模型組28只、福辛普利干預(yù)組28只。于實驗第45、60天分別檢測3組大鼠血漿AngII、ALD的表達，免疫組化法測定腎臟組織a-平滑肌肌動蛋白（a-SMA）的表達。結(jié)果①實驗第60天福辛普利干預(yù)組治療后血漿AngⅡ（68.75±20.56）pg/mL、ALD（246.56±59.69）pg/mL與同期模型組（86.56±23.30）pg/mL、（346.64±86.78）pg/mL比較有下降（P＜0.05）；②福辛普利干預(yù)組治療后實驗第45 d、60 d腎組織中a-SMA的濃度（0.27±0.16）、（0.33±0.56）與模型組（0.52±0.12）、（0.63±0.42）比較均有明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 福辛普利可能通過下調(diào)高尿酸血癥性腎病大鼠模型血漿AngⅡ、ALD水平的表達，抑制腎臟炎癥及腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化，從而防治高尿酸血癥性腎間質(zhì)纖維化。

福辛普利；高尿酸血癥性腎??；AngⅡ；ALD；a-SMA；腎間質(zhì)纖維化

［Abstract］Objective To observe the effect of fosinopril on the expression of plasma angiotensin II（Ang II）and aldosterone（ALD）and renal interstitial fibrosis in rats with hyperuricemia nephropathy，Then investigate the protective effect of it in rats with hyperuricemia nephropathy.Methods From June 2014 to June 2015，in the center of animal experiment，xiamen university school of medicine，80 clean SD rats were randomly divided into 60 groups and the control group of 20；Adenine+ ethambutol hydrochloride by gastric method is used to establish the rat model of high uric acid nephropathy，After successful modeling，the model animals were randomly divided into Model group 28 and fosinopril intervention group 28.The expression of AngII and ALD in rat plasma was detected at forty-fifth and sixtieth days，respectively，and the expression of asmooth muscle actin（a-SMA）in renal tissue was determined by immunohistochemistry.Results①sixty days fosinopril intervention group after treatment plasma Ang II（68.75±20.56）pg/mL，ALD（246.56±59.69）pg/mL compared with the same period model group（86.56±23.30）pg/mL、（346.64±86.78）pg/mL compared with the decline（P＜0.05）；②fosinopril interven-tion group after treatment for forty-fifth days，sixty days，the concentration of a-SMA in renal tissue（0.27±0.16），（0.33± 0.56）and model group（0.52±0.12），（0.63±0.42）were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Fosinopril may be down regulation of hyperuricemia nephropathy rat model of plasma Ang II，ALD levels of expression，Suppression of renal inflammation and activation of the renin angiotensin system，Therefore，the prevention and treatment of hyperuricemia renal interstitial fibrosis.

［Key words］Fosinopril；High uric acid nephropathy；AngⅡ；ALD；a-SMA；Renal interstitial fibrosis

近年來，高尿酸血癥在腎臟疾病中的作用得到了新的重視，但是對于尿酸如何導(dǎo)致腎病的機理，多年來學(xué)者們一直存在爭議。早期的研究顯示主要是急性高尿酸在腎臟結(jié)晶引起的梗阻性損傷，但近年來研究發(fā)現(xiàn)尿酸可以導(dǎo)致腎臟炎癥狀態(tài)、腎小球前動脈病變以及使腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）活化，從而加重腎血管平滑肌的增殖和腎臟疾病的進展［1］?；谀壳暗难芯繜狳c，從2014年6月—2015年6月間該實驗選取清潔型SD大鼠80只，著重研究高尿酸血癥性腎病大鼠體內(nèi)炎癥及RAS活化情況，以及探討福辛普利的保護機制?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1實驗動物

清潔型SD大鼠80只，成年雄性，體重175～185 g（購于廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心）。

1.2藥物準(zhǔn)備

1.2.1造模藥物鹽酸乙胺丁醇（E4630，25 g/瓶，國藥準(zhǔn)字號H21022349）+腺嘌呤（Amresco 0183，10 g/瓶，國藥準(zhǔn)字號H50020220），同時使用1 000 mL滅菌蒸餾水將鹽酸乙胺丁醇25 g、腺嘌呤10 g配成懸濁液［2］，放置4℃冰箱保存，臨用時解凍。

1.2.2福辛普利片（國藥準(zhǔn)字H19980197，10 mg/片），按10 mg：20 mL蒸餾水配制。

1.3儀器及試劑

全自動生化分析儀；Allegra X-15R低速冷凍離心機；全自動染色機（MiCROM HMS760X）。AngⅡ、ALD放射免疫分析試劑盒，小鼠抗大鼠a-SMA單克隆抗體（1：100）、即用型SABC、顯色劑DAB-0031/1032。

1.4實驗方法

1.4.1造模方法按文獻方法［2］，SD雄性大鼠常規(guī)下飼養(yǎng)數(shù)天后隨機分為2組：對照組20只，造模組60只，將配置好的混懸液按12 mL/（kg·d）的劑量給造模組大鼠灌胃20天，復(fù)制高尿酸血癥性腎病模型，對照組灌服等量生理鹽水。第21天隨機抽取4只造模組大鼠殺檢，觀察腎臟病理變化。造模成功后，造模組大鼠繼續(xù)灌胃至第30 d，以保持高尿酸血癥性腎病模型的穩(wěn)定性。

1.4.2分組給藥模型穩(wěn)定后開始將造模組隨機分為模型組28只，干預(yù)組28只；干預(yù)組灌服已配置好的福辛普利溶液，按5 mg（kg·d）劑量給藥，模型組及對照組灌服等量生理鹽水，療程為30 d。

1.4.3標(biāo)本收集造模成功后實驗開始第45、60天分別（每組每次5只）處死大鼠，處死前一天使用代謝籠收集所有大鼠24 h尿液，并目內(nèi)眥取血待測；處死動物后迅速打開腹腔，摘取右側(cè)腎臟，取部分腎臟組織置于10%福爾馬林液中固定，用于病理相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.5相關(guān)指標(biāo)檢測

大鼠一般情況觀察（活動、飲食、體重、尿量等）。生化指標(biāo)：使用自動生化分析儀采用光電比色分別進行尿酸、肌酐的測定；AngⅡ、ALD的含量測定采用放射免疫法，嚴(yán)格按說明書步驟方法檢測；采用磺柳酸比濁法測定大鼠24 h尿蛋白定量。病理組織學(xué)檢查：A.光鏡：腎臟組織標(biāo)本做蘇木素伊紅（HE）和馬松（Masson's）染色，觀察腎臟結(jié)構(gòu)病理及腎小管-間質(zhì)纖維化情況。B.免疫組化檢測a-SMA表達：采用SABC法，嚴(yán)格按照即用型SABC試劑盒說明書操作。a-SMA免疫組化結(jié)果半定量分析采用彩色病理圖像分析軟件，方法如下：以染色強度結(jié)合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分，組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性標(biāo)志。在顯微鏡下放大200倍中分別取10個不重復(fù)的腎小球、腎小管-間質(zhì)視野，按陽性組織所占視野百分比進行半定量評分，測量平均光密度。

表1　各組大鼠治療前后各指標(biāo)變化比較

表1　各組大鼠治療前后各指標(biāo)變化比較

注：與對照組比較，aP＜0.01，與模型組比較bP＜0.05。

項目尿酸（umol/L）肌酐（umol/L）24 h尿蛋白定量（mg/24 h）AngII（pg/mL）ALD（pg/mL）a-SMA（平均光密度）第45天對照組模型組干預(yù)組第60天對照組模型組干預(yù)組89.23±13.82（103.55±12.33）a（96.42±10.12）ab19.58±4.98（93.51±19.08）a（72.72±5.42）ab6.76±0.25（30.21±7.15）a（18.02±9.08）ab47.56±5.21（76.24±20.96）a（60.01±11.35）ab183.35±25.33（287.65±75.64）a（206.54±63.21）ab0.09±0.01（0.52±0.12）a（0.27±0.16）ab92.32±0.86（159.25±22.45）a（107.56±20.64）ab19.06±3.15（106.78±18.15）a（81.01±17.36）ab7.56±1.63（39.58±6.39）a（20.89±7.16）ab46.23±9.63（86.56±23.30）a（68.75±20.56）ab195.37±19.76（346.64±86.78）a（246.56±59.69）ab0.12±0.56（0.63±0.42）a（0.33±0.56）ab

1.6統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

2.1一般情況

造模組動物自實驗10 d左右后，開始出現(xiàn)進食減少，倦??；30 d后后明顯加重，出現(xiàn)消瘦、蜷臥少動、夜間尿量增多、尿色渾濁等，其中以模型組表現(xiàn)尤為突出，而對照組動物反應(yīng)機警，皮毛亮澤，食欲好、尿量可、體重增長正常；整個實驗過程中，無動物死亡。

2.2血液相關(guān)指標(biāo)結(jié)果顯示

實驗第45天，與對照組相比，干預(yù)組和模型組尿酸、Scr、AngⅡ、ALD、24 h尿蛋白定量等均有升高，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異；而實驗第60天，與模型組相比，干預(yù)組上述指標(biāo)均有不同程度的下降。見表1。

2.3病理、免疫組化結(jié)果

2.3.1光鏡觀察HE染色光鏡下對照組腎小管排列緊密，未見尿酸鹽結(jié)晶及炎性細胞沉積，Masson's染色腎小管、小球結(jié)構(gòu)和上皮細胞的形態(tài)完整，無異常物質(zhì)沉積。第21天模型組及干預(yù)組大鼠可見針狀、雙折光樣棕黑色尿酸鹽結(jié)晶排列于腎小管-間質(zhì)內(nèi)；第45天，模型組受累小管、小球增多，可見炎癥細胞呈灶性排列在腎間質(zhì)中，腎小管上皮細胞彌漫性空泡變性，Masson's染色可見腎間質(zhì)增寬，纖維組織增生，第60天模型組可見腎小管變性萎縮，管腔內(nèi)有尿酸鹽結(jié)晶，腎小球數(shù)量明顯減少，腎間質(zhì)可見成纖維細胞增生。干預(yù)組與同期模型組相比，細胞外基質(zhì)增生情況較輕，小管、小球受累較少。見圖1、圖2。

圖1　實驗第60天，各組大鼠光鏡觀察（HE×200）

圖2　實驗第60天，各組大鼠光鏡觀察（Masson's×200）

圖3　實驗第60天，各組大鼠a-SMA免疫組織化學(xué)表達（免疫組化×400）

2.3.2免疫組化a-SMA的表達對照組腎小管間質(zhì)中a-SMA幾乎不表達。第45天模型、干預(yù)組在腎小管-間質(zhì)區(qū)及血管平滑肌上可見較多a-SMA呈片狀或線樣分布。實驗第60天，測量a-SMA平均光密度；干預(yù)組為（0.33±0.56）明顯低于模型組（0.63±0.42）?？梢姼Ｐ疗绽梢詼p輕a-SMA在腎組織中的表達，見表1及圖3。

3　討論

高尿酸血癥發(fā)病率一直呈上升趨勢，在患有高尿酸血癥多年的患者中，90%具有腎臟損害，近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸是腎臟相關(guān)疾病的獨立危險因素，故維持正常的血尿酸水平對人體是非常重要的。

那么高尿酸血癥是如何引起或加重腎臟損害呢？基于當(dāng)前學(xué)者們的研究熱點，該試驗觀察到模型組大鼠實驗45 d腎臟病理提示尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎小管-間質(zhì)內(nèi)，周圍可見炎癥細胞呈灶性排列，同期檢測血尿酸（103.55±12.33）umol/L、尿白蛋白（30.21±7.15）mg/24 h、AngII（76.24±20.96）pg/mL和ALD（287.65±75.64）pg/mL表達即增加，與對照組（89.23±13.82）umol/L、（6.76± 0.25）mg/24 h、（47.56±5.21）pg/mL、（183.35±25.33）pg/mL比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見RAS活化、炎癥反應(yīng)等可能均參與了高尿酸血癥所致的腎臟損害，與何宏明、陳麗川，李靖等［3-5］研究相似。a-平滑肌肌動蛋白（a-SMA）是肌成纖維細胞的標(biāo)記物，金建生、巫斌等［6-7］研究報告發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化大數(shù)腎小管間質(zhì)中a-SMA表達在試驗第14天明顯增多，到28 d表達量進一步增加，且腎小管間質(zhì)纖維化程度與腎小管間質(zhì)中a-SMA表達呈明顯正相關(guān)，預(yù)示a-SMA作為細胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志不僅可以早期預(yù)測腎間質(zhì)纖維化，同時也客觀預(yù)測著腎間質(zhì)纖維化的情況。在該組研究中，我們發(fā)現(xiàn)實驗第45天腎組織中a-SMA含量模型組（0.52±0.12）、干預(yù)組（0.27±0.16）均明顯高于對照組（0.09±0.01），提示這時候已經(jīng)出現(xiàn)了腎臟細胞外基質(zhì)增生及早期間質(zhì)纖維化，與金建生等研究報告相符。如此就給出這樣一個提示：如果能在早期就有效地抑制RAS活化、保護平滑肌細胞、減輕腎內(nèi)炎癥狀態(tài)，或許能起到保護高尿酸血癥性腎病的作用。

福辛普利為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，它通過抑制RAAS系統(tǒng)，減少AngⅡ的生成，同時還可以抑制一些炎癥因子如縮血管因子內(nèi)皮素的生成和釋放［8］，那么它對高尿酸血癥性腎病的保護作用及機制如何呢？該研究中，在造模成功后采用福辛普利干預(yù)，結(jié)果顯示：試驗第60天福辛普利干預(yù)后大鼠血清尿酸（107.56± 20.64）umol/L、Scr（81.01±17.36）umol/L、尿白蛋白（20.89± 7.16）mg/24 h、AngII（68.75±20.56）pg/mL和ALD（246.56± 59.69）pg/mL等指標(biāo)與同期模型組（159.25±22.45）umol/L、（106.78±18.15）umol/L、（39.58±6.39）mg/24 h、（86.56± 23.30）pg/mL、（346.64±86.78）pg/mL相比均有明顯好轉(zhuǎn)下降，光鏡顯示福辛普利干預(yù)后大鼠腎小管、小球損害，尿酸沉積及細胞外基質(zhì)增生程度均明顯減輕，腎組織中a-SMA（0.33±0.56）的平均光密度與模型組（0.63± 0.42）相比較亦明顯降低。由此可發(fā)現(xiàn)福辛普利具有減輕尿酸在腎組織中的沉積、抗炎、抑制RAAS活化，減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。與周杰研究結(jié)果相似［8］。

總之，該實驗發(fā)現(xiàn)福辛普利可能通過下調(diào)高尿酸血癥性腎病大鼠血漿AngⅡ、ALD水平的表達，抑制腎臟炎癥及體內(nèi)RAAS活化，從而起到保護高尿酸血癥性腎病的作用。由此可見福辛普利在高尿酸血癥性腎損害的防治中可能具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進一步探索。

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Analysis of the Therapeutic Effect of Fosinopril on the Protective Effect of Hyperuricemia Nephropathy in Rats

LIU Jing，WU Bing
Department of Nephrology，Xianyue Hospital in Xiamen，Xiamen，F(xiàn)ujian Province，361012 China

R5

A

1674-0742（2016）09（c）－0001-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.27.001

2016-06-25）

廈門市2012年度科技局指導(dǎo)性科研立項項目（2011S0448）。

劉靜（1979.3-），女，福建浦城人，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腎臟病的基礎(chǔ)和臨床研究。