朱建蒙

（廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西南寧 530000）

人類白細(xì)胞介素-2與白細(xì)胞介素-7對(duì)體外誘導(dǎo)抗原肽SLYNTVAT 特異性T淋巴細(xì)胞的影響

朱建蒙

（廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西南寧 530000）

目的：優(yōu)化人類白細(xì)胞介素-2（rhIL-2）與白細(xì)胞介素-7（rhIL-7）在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)SLYNTVAT（SL9）抗原特異性T細(xì)胞時(shí)的用量。方法：分離健康人外周血PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，培養(yǎng)T2（TAP缺陷T淋巴細(xì)胞）細(xì)胞并加載HIV來(lái)源抗原肽作為刺激細(xì)胞。SL9抗原肽四聚體檢測(cè)不同細(xì)胞因子用量下特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)頻率大小。結(jié)論：rhIL-7在誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞中起到關(guān)鍵促進(jìn)作用，SL9 特異性T淋巴細(xì)胞能夠自身分泌大量rhIL-2，減少rhIL-2用量可為體外誘導(dǎo)培養(yǎng)SL9特異性T淋巴細(xì)胞提高效率。

SLYNTVAT 特異性T淋巴細(xì)胞 白細(xì)胞介素

通過(guò)長(zhǎng)期混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的方法能夠誘導(dǎo)出同種抗原肽-MHC特異性的T 細(xì)胞［1］，肽四聚體技術(shù)目前被看做檢測(cè)特異性CTL的金標(biāo)準(zhǔn)方法［2］。一般研究者體外誘導(dǎo)特異性CTL時(shí)均認(rèn)為rhIL2在維持T細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖中起到重要作用，為誘導(dǎo)特異性CTL必不可少的細(xì)胞因子［3］。本研究通過(guò)加入不同量rhIL-2與rhIL-7進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞，構(gòu)建SL9抗原肽四聚體并檢測(cè)不同細(xì)胞因子用量下特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)頻率。證明rhIL-7在誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞時(shí)起到更重要作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

T2細(xì)胞購(gòu)自于上海復(fù)祥生物科技有限公司，RPMI Medium 1640從Gibco公司購(gòu)買，胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)。PE標(biāo)記鏈酶親和素抗體購(gòu)自于Sigma公司，生物素化MHC-SL9肽四聚體單體由北京曠博生物公司合成。PBMC來(lái)源于HLA-A2陽(yáng)性志愿者外周血，無(wú)血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自于照生公司，淋巴細(xì)胞分離液由索來(lái)寶公司提供?？乖腟L9由杭州中肽公司合成。

1.2 抗原肽SL9加載T2細(xì)胞

培養(yǎng)T2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml備用。在24孔板中，每孔加入1ml調(diào)整濃度后的T2細(xì)胞。各孔中加入特異性抗原肽SL9，終濃度40μg/ml。6 h后X射線200Gy輻照，1500rpm 5min離心收集細(xì)胞，無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸備用。

1.3 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)SL9特異性CTL

健康人外周血Ficoll-Hypaque法分離PBMC后在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁2 h得到T淋巴細(xì)胞。加載SL9抗原肽T2細(xì)胞與PBL（外周血T淋巴細(xì)胞）以1：10的比例在完全T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)?；旌狭馨图?xì)胞分為三組培養(yǎng)。第一組：每三天加入rhIL7（終濃度10ng/ ml），每一周用加載SL9抗原肽T2細(xì)胞重新刺激。第二組：開(kāi)始培養(yǎng)的三天加入rhIL2（終濃度50U/ml），三天后加入rhIL7；以后每三天輪流加入rhIL2或rhIL7。第三組：開(kāi)始培養(yǎng)的三天加入rhIL2，以后每三天均加入rhIL7。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SL9特異性CTL

T細(xì)胞用CD8單克隆抗體與PE-MHC肽四聚體染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙染陽(yáng)性頻率。用Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

抗原肽SL9加載T2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HLA-1類分子，第三組誘導(dǎo)方案可得到最大量特異性CTL，經(jīng)過(guò)兩周的誘導(dǎo)最大特異性CTL檢測(cè)頻率為12.4%。

圖1 加載SL9抗原肽的T2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HLA-I類分子

圖2 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明經(jīng)過(guò)兩周培養(yǎng)后，第三組混合淋巴細(xì)胞特異性CTL頻率最高，即在誘導(dǎo)最初加入rhIL-2，以后每三天均加入rhIL-7，最高檢出頻率為12.4%。

3 討論

抗原特異性T細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用［4］。在H I V病毒感染后長(zhǎng)期無(wú)病程進(jìn)展的患者血中可檢測(cè)到高頻率的CD8+T細(xì)胞［5］。對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的研究有利于研究病毒性疾病病理進(jìn)展和疫苗開(kāi)發(fā)。HIV p17Gag蛋白來(lái)源抗原肽SLYNTVATL有著嚴(yán)格的生物學(xué)限制性，研究表明當(dāng)HIV病毒產(chǎn)生對(duì)SL9特異性CTL產(chǎn)生免疫逃避后，將引起患者病毒大量復(fù)制［6］。提高SL9特異性CTL體外誘導(dǎo)效率可能有助于對(duì)疾病機(jī)理的研究與治療。

［1］Y.J. GUO， Y. ZHU， S.H. SUN. Identification and functional studies of HLA-A0201 restricted CTL epitopes in the X protein of hepatitis B virus. Acta Virol 2011， 55（2）：107-15.

［2］Dries Van Hemelen， Vera Mahler， Gottfried Fischer， et al. HLA-class II peptide tetramers vs. allergen-induced proliferation for identification of allergen-specific CD4 T cells.Allergy. 2015 Jan；70（1）：49-58.

［3］Angel Varela-Rohena1， Peter E Molloy2， Steven M Dunn，et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nat Med. 2008 Dec；14（12）：1390-5.

［4］Goulder， P.J. & Watkins， D.I. HIV and SIV CTL escape： implications for vaccine design.Nat. Rev. Immunol. 2004 4， 630 640.

［5］Varela-Rohena A， Molloy PE， Dunn SM，et al. Nat Med. 2008 Dec；14（12）：1390-5.

［6］Morikawa， Y.， Zhang， W.H.， Hockley， D.J.， Nermut， M.V. & Jones，I.M. Detection of a trimeric human immunodeficiency virus type 1 Gag intermediate is dependent on sequences in the matrix protein， p17. J. Virol. 1998 ，72， 76597663.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0324-01