河南漢族人群HLA超型的分析研究

劉悅越， 杜加亮， 劉 艷， 宣 博， 范行良， 于晴川， 高加梅， 國 泰

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050； *通訊作者，E-mail：guotai@nifdc.org.cn)

?

河南漢族人群HLA超型的分析研究

劉悅越， 杜加亮， 劉 艷， 宣 博， 范行良， 于晴川， 高加梅， 國 泰

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；*通訊作者，E-mail：guotai@nifdc.org.cn)

目的 分析河南漢族人群HLA基因多態(tài)性和超型分布。 方法 采用測序法對111名志愿者的血樣進(jìn)行HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1五個座位的基因分型，分別根據(jù)5個研究組的HLA超型分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HLAⅠ類和Ⅱ類超型的分析統(tǒng)計。 結(jié)果 總共檢測出130個HLA等位基因，其中HLA-A座位為21個等位基因，-B座位為41個，-C座位為24個，-DRB1座位為27個，-DQB1座位為17個。依據(jù)不同的分型方法，共得到86個超型，其中HLAⅠ類51種，Ⅱ類35種。按照5個研究組的分型標(biāo)準(zhǔn)，HLAⅠ類的優(yōu)勢超型型別基本相似，其中HLA-A2和-B7的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但對于HLAⅡ類分子，超型名稱分類標(biāo)準(zhǔn)在不同的研究組均不同。 結(jié)論 獲得河南漢族人群的超型分布特征，HLAⅠ類分子的優(yōu)勢超型為HLA-A3、-A2、-B7、-B44和-B62，但HLAⅡ類分子的超型分類標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，有待進(jìn)一步研究。

人類白細(xì)胞抗原; 超型; 基因多態(tài)性; 表位疫苗

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，豐富的群體多態(tài)性是HLA的一個重要特點[1]。它包括224個基因座位，其中128個為功能基因，96個為假基因。截止至2016年3月，國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫IMGT/HLA中記錄的HLA Ⅰ類等位基因為10 730個，HLA Ⅱ類等位基因為3 743個[2]。而且隨著研究的不斷進(jìn)行，其種類持續(xù)增長。大多數(shù)多態(tài)性位于肽結(jié)合區(qū)，理論上每一種等位基因識別一種抗原表位。然而，研究表明很多HLA分子可以結(jié)合相似的一類肽，根據(jù)HLA的肽結(jié)合位點的相似基序可以將一些HLA分子歸類為一種超型[1,3]，這種分類在一定程度上簡化了HLA多態(tài)復(fù)雜性。

目前對于HLA超型的分類尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法。本文采用序列分析技術(shù)(sequence-based typing,SBT)對111名河南漢族健康人血樣進(jìn)行HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1位點等位基因分型，通過綜述相關(guān)文獻(xiàn)的超型分類標(biāo)準(zhǔn)對樣本等位基因進(jìn)行超型歸類，以探討在我國河南省HLA基因多態(tài)性和超型的分布特征，為研究HLA超型與移植免疫、病原體感染的相關(guān)性，特別是疫苗設(shè)計與免疫效果的機(jī)制研究提供免疫學(xué)基礎(chǔ)支持資料。

1 材料及方法

1.1 樣本來源

樣本為本實驗室留存的來自河南漢族人群的111份疫苗免疫原性研究剩余樣本，置于-80 ℃保存。征得受試者或其監(jiān)護(hù)人同意后，進(jìn)行HLA分型檢測。

1.2 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，凱杰公司)，HLA-A,-B,-C,-DRB1和-DQB1分型試劑盒(SBT法，深圳華大基因)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒(ExoSAP-IT，美國USB公司)，BigDye?Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒(美國ABI公司)，基因擴(kuò)增儀(Verti96，美國ABI公司)，基因測序儀(3730XL，美國ABI公司)

1.3 DNA提取

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書操作步驟進(jìn)行DNA提取，100 μl洗脫液洗脫，于-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HLA分型

分別采用深圳華大基因的BGI HLA-A,-B,-C,-DRB1和-DQB1分型試劑盒對HLA五個位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，按照BigDye?Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒說明書步驟對純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)和純化，置于ABI 3730XL基因測序儀進(jìn)行測序，測序結(jié)果導(dǎo)入Soap typing 1.01軟件，在IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫3.10中進(jìn)行比對分型。

1.5 確定超型分類依據(jù)

在Pubmed數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞為“supertype”和“HLA”的所有HLA超型分型相關(guān)文獻(xiàn)，剔除不符合條件的文章，如研究不是基于高分辨的HLA等位基因分型結(jié)果，或僅僅局限于有限的幾個等位基因型別進(jìn)行超型分型。根據(jù)各文獻(xiàn)研究結(jié)果將各型別的等位基因歸于相應(yīng)的超型。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用Arlequin3.5.1.3軟件分別對人群的5個位點基因分布進(jìn)行Hardy-Weinber平衡檢驗，P>0.05為期望值和觀察值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件，計算人群HLA等位基因和超型的頻數(shù)。對于頻率較高的優(yōu)勢超型，采用卡方檢驗統(tǒng)計根據(jù)不同研究組的分類標(biāo)準(zhǔn)該超型的分布差異，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各位點HLA等位基因頻率

在111份樣本中，總共檢測出130個HLA等位基因，其中HLA-A座位為21個等位基因，-B座位為41個，-C座位為24個，-DRB1座位為27個，DQB1座位為17個，呈現(xiàn)較高的基因多態(tài)性。A、B、C、DRBl和DQB1各座位頻率排名前4位的等位基因分別是A*11:01，A*02:01，A*24:02，A*30:01，B*13:02，B*52:01，B*40:01，B*13:01，C*07:02，C*03:04，C*06:02，C*01:02，DRB1*15:01，DRB1*09:01，DRB1*07:01，DRB1*11:01，DQB1*03:01，DQB1*03:03，DQB1*06:01，DQB1*06:02。除了HLA-B座位外，其他座位的前4個等位基因累計頻率均超過50%，表明在本研究人群中，HLA等位基因的分布相對比較集中。通過最大似然估計法對人群的HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1五個位點基因分布進(jìn)行Hardy-Weinber平衡檢驗，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明所選樣本具有群體代表性。

2.2 超型分類

根據(jù)檢索結(jié)果，共有5個實驗室[4-8]的分類標(biāo)準(zhǔn)用于HLA Ⅰ類的超型分型，5個[5,9-12]用于HLA Ⅱ類的超型分型。結(jié)合本研究的HLA分型結(jié)果，共得到86個超型，其中HLA Ⅰ類51種，Ⅱ類35種。

2.3 超型分布

根據(jù)不同研究組的超型分類方法，各HLA超型所包括的HLA等位基因型別不完全一致，所占頻數(shù)和頻率也不完全相同，HLAⅠ類分子超型見表1?？傮w分布以HLA-A3、A2和B7、B44、B62為主，所占比重較大。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，A2(P=0.297)和B7(P=0.208)分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但A3、B44和B62的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

HLAⅡ類分子超型見表2。根據(jù)不同的Ⅱ類超型分類方法，超型的名稱表示方法及其分布頻率均不同。

3 討論

在人類機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞識別抗原遞呈細(xì)胞表面的HLA Ⅰ類或Ⅱ類分子結(jié)合肽，是啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)的第一步。形成HLA-抗原肽-TCR復(fù)合物，才能啟動免疫應(yīng)答[13]。從疫苗的[n]是指按照參考文獻(xiàn)n的分類標(biāo)準(zhǔn)對HLA各等位基因進(jìn)行超型分型；其他是指文獻(xiàn)中未涉及，而本調(diào)查人群中檢出的等位基因，均歸為其他角度來說，需要含有模擬感染性病原體或腫瘤的抗原，且能夠與HLAⅠ類或Ⅱ類分子結(jié)合，才能有效激活免疫反應(yīng)。但是對于表位肽疫苗，由于HLA基因的多態(tài)性導(dǎo)致HLA的肽結(jié)合能力差異，使得特定的肽段僅能與有限的HLA特異性結(jié)合，因此該疫苗僅能用于有限的人群，而缺乏廣譜性。為了減低HLA基因多態(tài)性的這種復(fù)雜性，使表位肽疫苗的使用成為可能，不同的HLA分子根據(jù)其具有相同或相似的肽結(jié)合特異性而被定義為同一HLA超型，從而簡化了疫苗抗原肽的選擇，使之能夠與大多數(shù)HLA分子結(jié)合[14]。

表1 河南漢族人群HLA Ⅰ類超型分布頻率

Table 1 The frequencies of HLA class Ⅰ supertypes in Henan Han population

基因座超型所含等位基因數(shù)頻數(shù)頻率(%)基因座超型所含等位基因數(shù)頻數(shù)頻率(%)HLA-A[4]A0378337.39HLA-B[6]B441210145.50A0246027.03B27116830.63A2432913.06B7165022.52A0132812.61其他231.35A01/A031198.56HLA-C[6]C11315971.62A01/A24220.90C295926.58其他110.45其他241.80HLA-B[4]B07134922.07HLA-A[7]A358036.04B4464520.27A246027.03B6263917.57A143917.57B2772913.06A2432712.16B58294.05其他5167.21B08131.35HLA-B[7]B4464520.27其他64821.62B794018.02HLA-A[5]A358036.04B6243716.67A246027.03B39294.05A133817.12B58294.05A2432913.06B27373.15A26194.05其他157533.78其他562.70HLA-A[8]A346227.93HLA-B[5]B6267031.53A246027.03B4475022.52A2412712.16B7124721.17AB283.60B2752310.36其他106328.38B39294.05HLA-B[8]B753314.86B58294.05B153188.11其他7146.31B442125.41HLA-A[6]A31212355.41B57294.05A267031.53BX152.25A2432913.06B27241.80其他2614464.86

肽親和力是影響T細(xì)胞識別和結(jié)合病原體的重要因素，測定和判斷哪些型別的HLA分子具有相似的肽親和力，有不同的方法。學(xué)者們基于不同的方法，提出幾種不同的分類系統(tǒng)來定義HLA超型的類型。目前研究HLA超型的難點是其分類尚沒有一個公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)來定義哪些等位基因構(gòu)成特定的超型。不同的研究組可能采用不同的實驗和計算標(biāo)準(zhǔn)[n]是指按照參考文獻(xiàn)n的分類標(biāo)準(zhǔn)對HLA各等位基因進(jìn)行超型分型；其他是指文獻(xiàn)中未涉及，而本調(diào)查人群中檢出的等位基因，均歸為其他來確定HLA分子-肽親和力，從而對等位基因進(jìn)行超型分類。例如，Sidney等[4]采用基序掃描的方式根據(jù)結(jié)合基序的重疊關(guān)系定義HLA分子超型；而根據(jù)HLA分子中多肽結(jié)合槽的氨基酸突變規(guī)律，Doytchinova等[6]利用分級成簇和主要成分分析技術(shù)對HLAⅠ類分子的結(jié)構(gòu)以及結(jié)合位點殘基突變特點進(jìn)行計算得到超型；Hertz和Yanover[7]則利用距離矩陣對HLAⅠ類分子的超型進(jìn)行劃分。因此，本研究中我們使用多個研究組的不同超型定義標(biāo)準(zhǔn)，來對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行超型分類。這種方法能夠為HLA超型的分布特點提供新的信息，同時避免因局限于某種方法而忽略了應(yīng)有的結(jié)果。

表2 河南漢族人群HLA Ⅱ類超型分布頻率

Table 2 The frequencies of HLA class Ⅱ supertypes in Henan Han population

基因座超型所含等位基因數(shù)頻數(shù)頻率(%)基因座超型所含等位基因數(shù)頻數(shù)頻率(%)HLA-DRB1[5]DR225122.97HLA-DRB1[10]DR1*043104.50DR712913.06DR1*03183.60DR112177.66DR1*01162.70DR44114.95其他146027.03DR132114.95HLA-DRB1[11]DR586529.28DR3183.60DR145926.58DR1162.70DR323716.67DR8131.35DR4113013.51其他138638.74DR913013.51HLA-DRB1[9]MainDR612757.21其他110.45DRB32146.31HLA-DRB1[11]DQ3610145.50DR43125.41DQ188839.64其他166931.08DQ223214.41HLA-DQB1[9]DQ727232.43其他110.45MainDQ42511.26HLA-DRB1[12]Dr54018.02其他1112556.31a13616.22HLA-DRB1[10]DR1*1513616.22E33515.77DR1*0913013.51Q12913.06DR1*0712913.06A5177.66DR1*08/1332410.81R183.60DR1*08/112198.56其他115725.68

在本研究中，根據(jù)不同研究組的分類標(biāo)準(zhǔn)，HLA各位點的超型組成有所不同。但有些位點的優(yōu)勢超型型別基本一致，如HLA-A位點，根據(jù)不同研究組的標(biāo)準(zhǔn)，頻率最高的超型均是A3(27.93%-55.41%)，其次為A2(27.03%-31.53%)。對于HLA-B位點，由于不同的判定標(biāo)準(zhǔn)，各超型所包含的等位基因不同，優(yōu)勢超型也不同，如根據(jù)Sidney等[4]、Reche等[8]兩個研究組的標(biāo)準(zhǔn)，頻率最高的B位點超型是B07，按照Doytchinova等[6]、Hertz等[5]兩個研究組的標(biāo)準(zhǔn)，頻率最高的是B44超型，而按照Lund等[5]的分類方法，優(yōu)勢超型則是B62。其中B07的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.208)，但B44和B62的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而對于HLA Ⅱ類分子，其分類研究不如Ⅰ類分子成熟，在不同的研究組，各超型名稱和分類標(biāo)準(zhǔn)差異明顯，尚有待進(jìn)一步研究和規(guī)范。

中國人群的HLA呈現(xiàn)出明顯的基因多態(tài)性和空間異質(zhì)性。本研究首次綜合不同的HLA超型分類標(biāo)準(zhǔn)分析河南地區(qū)志愿者HLAⅠ類和Ⅱ類超型分布規(guī)律及特點，是在HLA超型水平上對以往統(tǒng)計研究結(jié)果的補充與深入，從新的角度為研究疾病與HLA分子相關(guān)性分析的提供一定的數(shù)據(jù)支持，為今后有針對性地設(shè)計感染性病原體或腫瘤相關(guān)抗原HLA超型限制性表位疫苗的設(shè)計提供方向。

[1] Vejbaesya S,Thongpradit R,Kalayanarooj S,etal.HLA class Ⅰ supertype associations with clinical outcome of secondary dengue virus infections in ethnic Thais[J].J Infect Dis,2015,212(6):939-947.[2] The IPD-IMGT/HLA database.HLA allele statistics[EB/OL].[2016-05-01].http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html.

[3] Dos Santos Francisco R,Buhler S,Nunes JM,etal.HLA supertype variation across populations:new insights into the role of natural selection in the evolution of HLA-A and HLA-B polymorphisms[J].Immunogenetics,2015,67(11-12):651-663.

[4] Sidney J,Peters B,Frahm N,etal.HLA class Ⅰ supertypes:a revised and updated classification[J].BMC Immunol, 2008, 9:1.

[5] Lund O,Nielsen M,Kesmir C,etal.Definition of supertypes for HLA molecules using clustering of specificity matrices[J].Immunogenetics,2004,55(12):797-810.

[6] Doytchinova IA,Guan P,Flower DR.Identifying human MHC supertypes using bioinformatic methods[J].J Immunol,2004,172(7):4314-4323.

[7] Hertz T,Yanover C.Identifying HLA supertypes by learning distance functions[J].Bioinformatics,2007,23(2):e148-155.

[8] Reche PA,Reinherz EL.Definition of MHC supertypes through clustering of MHC peptide-binding repertoires[J].Methods Mol Biol,2007,409:163-173.

[9] Greenbaum J,Sidney J,Chung J,etal.Functional classification of class Ⅱ human leukocyte antigen(HLA) molecules reveals seven different supertypes and a surprising degree of repertoire sharing across supertypes[J].Immunogenetics,2011,63(6):325-335.

[10] Nielsen M,Lundegaard C,Blicher T,etal.Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of known sequence:NetMHCIIpan[J].PLoS Comput Biol,2008,4(7):e1000107.

[11] Doytchinova IA,Flower DR.In silico identification of supertypes for class Ⅱ MHCs[J].J Immunol,2005,174(11):7085-7095.

[12] Ou D,Mitchell LA,Tingle AJ.A new categorization of HLA DR alleles on a functional basis[J].Hum Immunol,1998,59(10):665-676.

[13] Garcia-Guerrero E,Perez-Simon JA,Sanchez-Abarca LI,etal.The dynamics of the human leukocyte antigen head domain modulates its recognition by the T-cell receptor[J].PLoS One,2016,11(4):e0154219.

[14] Wang S,Bai Z,Han J,etal.Improving the prediction of HLA class Ⅰ-binding peptides using a supertype-based method[J].J Immunol Methods,2014,405:109-120.

Study of HLA supertype in Henan Han population

LIU Yueyue, DU Jialiang, LIU Yan, XUAN Bo, FAN Xingliang, YU Qingchuan, GAO Jiamei, GUO Tai*(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China；*Correspondingauthor,E-mail:guotai@nifdc.org.cn)

ObjectiveTo analyze the polymorphism of HLA gene and its supertype distribution in Henan Han population.MethodsBlood samples of 111 volunteers were genetyped by sequence-based typing(SBT) method for the HLA-A, -B, -C, -DRB1 and DQB1 loci. The HLA class Ⅰ and class Ⅱ supertypes were studied according to the standard defined by 5 different laboratories, respectively.ResultsA total of 130 HLA alleles were observed, including 21 HLA-A alleles, 41 HLA-B alleles, 24 HLA-C alleles, 27 HLA-DRB1 alleles and 17 HLA-DQB1 alleles. A total of 86 HLA supertypes were observed based on classification systems in 5 different laboratories, including 51 HLA class Ⅰ and 35 HLA class Ⅱ supertypes. The dominant supertypes of HLA class Ⅰ were basically similar. There was no significant difference in the frequencies of HLA-A2 and-B7 according to different classification system(P>0.05). However, the name and classification criteria were different for HLA class Ⅱ molecules according to different research groups.ConclusionThe distribution characteristics of the HLA supertype of Henan Han population are obtained. The dominant supertypes of HLA class Ⅰ are HLA-A3, -A2, -B7, -B44 and -B62. But the classification criteria of HLA class Ⅱ molecules are not uniform and need to be further studied.

human leukocyte antigen(HLA); supertype; gene polymorphism; peptide-based vaccines

國家科技重大專項課題資助項目(2012ZX10004702,2014ZX09304-316)

劉悅越，女，1983-04生，碩士，助理研究員，E-mail：yyliu@nifdc.org.cn

2016-07-01

Q394

A

1007-6611(2016)09-0822-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.009