宋國田，江小龍，陳五九，彭彥峰，路福平，王欽宏

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產(chǎn)順,順-粘康酸細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化

宋國田1,2，江小龍2，陳五九2，彭彥峰2，路福平1，王欽宏2

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457 2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

順,順-粘康酸是重要的平臺(tái)化學(xué)品。目前，生物合成順,順-粘康酸還缺乏高性能菌株，已報(bào)道的主要工程菌株不僅需要誘導(dǎo)表達(dá)，遺傳不穩(wěn)定，而且發(fā)酵培養(yǎng)基組分復(fù)雜，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。構(gòu)建能利用簡單無機(jī)鹽培養(yǎng)基、遺傳穩(wěn)定且不需要誘導(dǎo)表達(dá)的新型工程菌受到人們的關(guān)注。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的產(chǎn)三脫氫莽草酸工程菌株WJ060中，整合合成順,順-粘康酸的3個(gè)外源基因(、、)，并且利用3個(gè)不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子進(jìn)行組合調(diào)控，成功構(gòu)建了27株順,順-粘康酸工程菌，得到的最優(yōu)工程菌MA30的產(chǎn)量達(dá)到1.7 g/L。為了進(jìn)一步提高順,順-粘康酸工程菌的生產(chǎn)能力，利用基因組復(fù)制工程構(gòu)建突變體庫，結(jié)合高通量篩選方法，經(jīng)過兩輪篩選，成功篩選到了順,順-粘康酸產(chǎn)量提高超過8%的大腸桿菌MA30-G2。利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，MA30-G2的順,順-粘康酸產(chǎn)量達(dá)到了11.5 g/L。本研究采用組合調(diào)控和高通量篩選相結(jié)合的策略不僅促進(jìn)了順,順-粘康酸的生物合成，同時(shí)也為其他生物基化學(xué)品的生物制造提供了重要參考。

順,順-粘康酸，組合調(diào)控，大腸桿菌，組成型啟動(dòng)子，基因組復(fù)制工程，高通量篩選

順,順-粘康酸(,-muconic acid，MA)具有兩個(gè)羧基和成對(duì)的共軛雙鍵，在260 nm處具有很好的紫外吸收性質(zhì)，可用于紫外防護(hù)劑以及軍工特種用品如隱形飛機(jī)涂層，同時(shí)也是制備功能樹脂、醫(yī)藥及農(nóng)用化學(xué)品的潛在原料[1]，并可用于生產(chǎn)大宗化工產(chǎn)品尼龍66的單體己二酸以及對(duì)苯二甲酸二甲酯和偏苯三酸等[2-4]。

目前，生物合成MA主要是利用含質(zhì)粒的工程菌實(shí)現(xiàn)。2015年，Jung等[5]通過在優(yōu)化的肺炎克雷伯氏菌中轉(zhuǎn)入含有的質(zhì)粒，MA產(chǎn)量達(dá)到2.1 g/L，但由于肺炎克雷伯氏菌是致病菌，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；2013年，Pandeeti等[6]在釀酒酵母中通過在質(zhì)粒上過表達(dá)MA合成途徑的3個(gè)外源基因，首次實(shí)現(xiàn)了MA在釀酒酵母中的生產(chǎn)，產(chǎn)量僅為141 mg/L。自1994年Draths等[7]在莽草酸合成途徑阻斷的大腸桿菌AB2834中通過共轉(zhuǎn)含有MA合成途徑3個(gè)外源基因的2個(gè)質(zhì)粒，MA產(chǎn)量達(dá)到2.4 g/L之后，在大腸桿菌中合成MA的研究也越來越受到人們的關(guān)注。2014年，Lin等[8]通過以水楊酸作為前體合成MA，搖瓶發(fā)酵48 h產(chǎn)量達(dá)到 1.5 g/L。2015年，Zhang等[9]通過構(gòu)建了共生的雙細(xì)胞模式將木糖與葡萄糖混合糖轉(zhuǎn)化為MA的生物合成途徑，MA在72 h的分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到4.7 g/L。雖然MA在大腸桿菌中生產(chǎn)取得了一定程度的成功，但由于是以遺傳不穩(wěn)定的基于質(zhì)粒的工程菌為發(fā)酵菌株，同時(shí)使用復(fù)雜的培養(yǎng)基成分使生產(chǎn)成本增加，不利于MA工業(yè)化生產(chǎn)。因此，需要通過利用新的代謝工程策略將外源基因整合到大腸桿菌基因組，并通過組合調(diào)控等獲得生產(chǎn)能力提高，并且遺傳穩(wěn)定的工程菌株。

為了提高M(jìn)A產(chǎn)量，近幾十年中，許多研究學(xué)者[10-12]也采用各種方法提高M(jìn)A前體物3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量。本研究中，以產(chǎn)3-脫氫莽草酸(3-hydroshikimate, DHS) 的大腸桿菌WJ060作為出發(fā)菌株，先后整合不同強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子組合調(diào)控[13]、和突變體[14]的表達(dá)，合成途徑如圖1所示。我們得到了最優(yōu)MA生產(chǎn)菌MA30。為進(jìn)一步提高M(jìn)A工程菌的生產(chǎn)能力，我們將基因組復(fù)制工程與MA高通量篩選方法[15-16]相結(jié)合，經(jīng)過兩輪篩選，成功篩選到了MA產(chǎn)量得到提高的大腸桿菌MA30-G2。利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵[17-21]，進(jìn)一步提高了MA的產(chǎn)量。

圖1 大腸桿菌中順,順-粘康酸生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本試驗(yàn)所用菌株與質(zhì)粒如表1所示。生產(chǎn)DHS的出發(fā)菌株大腸桿菌WJ060是實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的菌株。

表1 本研究的菌株與質(zhì)粒

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素(工作濃度100 μg/mL)、氯霉素(工作濃度34 μg/mL)、壯觀霉素(工作濃度 50 μg/mL) 購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；DNA 回收試劑盒購自康為世紀(jì)公司；TransStart FastDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×PCR MasterMix，DNA marker購自Biomed公司；3-脫氫莽草酸(DHS) 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；原兒茶酸(PCA) 標(biāo)準(zhǔn)品購自Aldrich公司；兒茶酚(CA) 標(biāo)準(zhǔn)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；順,順-粘康酸(MA)標(biāo)準(zhǔn)品購自Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10 (固體LB加入1.5%瓊脂粉) 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.5，K2HPO4·3H2O 6.5，MgSO40.12，(NH4)2HPO43.5，CaCl20.011，硫胺素0.005。每升搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基添加1 mL的微量元素(g/L) 包括FeCl3·6H2O 0.16，CoCl2·6H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.015，ZnCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.02，H3BO30.05，每升微量元素添加10 mL濃鹽酸。

發(fā)酵罐發(fā)酵種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，葡萄糖10；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 7.5，MgSO4·7H2O 2，(NH4)2SO41.6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.077 5，檸檬酸2，酵母抽提物1。每升發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基添加1 mL微量元素(g/L) 包括MnSO4·H2O 0.004 5，Na2SO40.02，ZnSO40.006 4，CoCl2·6H2O0.004，CuSO4·5H2O 0.000 6。

1.2 方法

1.2.1 重組片段的構(gòu)建

整合到基因組中的由低強(qiáng)度到高強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子(P1: 5￠-TTATCTCTGGCGGTGTTG ACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCTTTTGGTGCGTCAGTCAGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3￠，P2: 5￠-TTATCTCTGGCGGTGT TGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCTGAGGTGGCTTATTATTCGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3'，P3: 5￠-TTATCTCTGGCGG TGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCGTATTGTTAGCATGTACGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3￠)[24]與以及T7終止子串聯(lián)表達(dá)重組片段構(gòu)建如下：1) 第一步同源重組片段的構(gòu)建：以pEASY-cat-sacB-ap為模板利用引物ldhA-cat-sacB-s/ldhA-cat-sacB-a進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有40 bp同源臂的ldhA-cat-sacB- ldhA DNA片段。2) 第二步同源重組片段的構(gòu)建：以pKD8.243為模板利用ldhA-P1-aroZ-s、ldhA-P2-aroZ-s、ldhA-P3-aroZ-s/ldhA-T7-aroZ-a分別進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有40 bp同源臂的ldhA-P1/2/3-aroZ-T7-ldhA DNA片段，通過兩步同源重組的方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)片段對(duì)的無痕替換。具體構(gòu)建片段與整合流程如圖2A所示。

圖2 重組片段的整合與組合調(diào)控示意圖

用上述方法獲得帶有40 bp同源臂的aroZ-T7-cat-sacB-ldhA、aroZ-T7-P1/2/3-aroY-T7- ldhA以及aroY-T7-cat-sacB-ldhA、aroY-T7- P1/2/3-catA-T7-ldhA DNA片段。本研究中所用引物見表2。

表2 本研究所用的引物

The underlined is the sequence of synthetic promoter corresponding to the primer name.

1.2.2 MA細(xì)胞工廠的構(gòu)建

通過在產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060基因組上位點(diǎn)上依次整合3種不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子組合調(diào)控的3個(gè)外源基因(、、)，成功構(gòu)建了27株MA工程菌MA13-MA39，組合調(diào)控示意圖如圖2B所示。

1.2.3 MA高通量測定方法的建立

基于MA在260 nm處有很好的紫外吸收性質(zhì)，配制濃度為0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L以及1 g/L的MA標(biāo)準(zhǔn)品，通過在酶標(biāo)儀測定其260 nm的紫外吸光度值，以MA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制MA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組實(shí)驗(yàn)3次平行。

1.2.4 MA細(xì)胞工廠的高通量篩選優(yōu)化

基于突變的基因組復(fù)制工程構(gòu)建文庫[16]，在MA30中轉(zhuǎn)入溫敏型質(zhì)粒pKD46-dnaQ (由突變體替換pKD46中的、、)后于30 ℃連續(xù)傳代4次，每代時(shí)12 h，從而構(gòu)建了MA30突變體文庫。從文庫中分離單菌落，經(jīng)過活化后，在無菌的96深孔板中37 ℃、 220 r/min發(fā)酵24 h，取每個(gè)文庫中近千個(gè)樣本的發(fā)酵液在96孔板中于酶標(biāo)儀上檢測其260 nm處的紫外吸光度值，并對(duì)吸光度值高于對(duì)照的最高突變工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，從而實(shí)現(xiàn)了高通量篩選的目的。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)MA：將保存于?80 ℃的工程菌在加有氨芐青霉素的平板上劃線，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含有3mL LB的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，測600值，保證起始600=0.4，按相應(yīng)比例接種到10 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(100 mL搖瓶)，接種時(shí)添加2%葡萄糖，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，收集菌液用于MA產(chǎn)量的測定。

發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)MA：選取搖瓶發(fā)酵中MA產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。將保存于?80 ℃的工程菌在加有氨芐青霉素的平板上劃線，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落到含有3 mLLB的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，再將3 mL培養(yǎng)液接種于200 mL種子培養(yǎng)基(1 L搖瓶)中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h，然后將200 mL種子全部接種于裝有1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在37 ℃、pH 6.5、溶氧40%的條件下發(fā)酵，通過氨水調(diào)控pH。嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中殘?zhí)呛康陀? g/L。從6 h開始，每隔6 h取樣檢測發(fā)酵液中葡萄糖、DHS、PCA、CA以及MA含量。

1.2.6 代謝產(chǎn)物和菌體量檢測

利用高效液相色譜來確定發(fā)酵液中葡萄糖消耗量，DHS、PCA、CA以及MA積累量。發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后取1 mL于12 000 r/min離心10 min，取上清液制樣，上液相。檢測條件：VWD檢測器，Innoval C18色譜柱(4.6mm× 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為水∶磷酸=1 000∶1 (占80%)，B為甲醇(占20%)，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長分別為210 nm以及 260 nm。每個(gè)待測樣品分別有3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。用DHS、PCA、CA以及MA等標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。以水作為空白，用分光光度計(jì)測定600值作為單位時(shí)間的菌體量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MA細(xì)胞工廠的構(gòu)建

為了構(gòu)建基因組整合型的MA細(xì)胞工廠，選擇實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的產(chǎn)3-脫氫莽草酸大腸桿菌WJ060為出發(fā)菌株。該菌株是在野生型大腸桿菌ATCC8739中，通過弱化調(diào)控突變體替換解除反饋抑制作用、強(qiáng)化調(diào)控替換PTS以及弱化調(diào)控和后獲得，可高效生產(chǎn)3-脫氫莽草酸，搖瓶產(chǎn)量超過3 g/L (圖1)。結(jié)合理性設(shè)計(jì)原則，在產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060基因組上，通過替代乳酸脫氫酶基因，依次整合3種不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子組合調(diào)控的3個(gè)外源基因(、、)，成功構(gòu)建了27株MA工程菌，實(shí)現(xiàn)了外源基因在WJ060基因組上的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。對(duì)MA及其副產(chǎn)物產(chǎn)量分析表明，在MA產(chǎn)量前三的工程菌(MA21、MA27以及MA30) 中的表達(dá)均由高強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子P3調(diào)控，而在MA產(chǎn)量最低的3株工程菌(MA13、MA22以及MA31) 中以及的表達(dá)均由弱強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子P1調(diào)控，其副產(chǎn)物DHS、PCA以及CA在不同程度上均有較多積累，基因的表達(dá)強(qiáng)度影響MA的生產(chǎn)強(qiáng)度；MA30產(chǎn)量最高達(dá)到1.7 g/L，其副產(chǎn)物DHS因其的表達(dá)由中等強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子P2調(diào)控，未完全轉(zhuǎn)化到PCA而積累0.067 g/L，由于和的表達(dá)均受到高強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子P3調(diào)控，PCA和CA基本上都轉(zhuǎn)化成MA而沒有積累；由3個(gè)最強(qiáng)的P3啟動(dòng)子分別調(diào)控3個(gè)外源基因表達(dá)的MA39產(chǎn)量少于MA30，與預(yù)期不一致，其原因在于MA39生長情況明顯較弱，不利于MA的積累；同時(shí)結(jié)合27株工程菌的生長情況分析，MA產(chǎn)量較高的工程菌(MA21、MA27以及MA30) 其生長情況明顯較弱，相反，MA產(chǎn)量較低的工程菌(MA13、MA22以及MA31)其生長情況反而較好，MA產(chǎn)量的積累對(duì)MA工程菌的生長有明顯的抑制作用。通過構(gòu)建一系列的MA細(xì)胞工廠，成功得到1株生長較好、產(chǎn)量較高的MA工程菌MA30。

圖3 整合不同強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子表達(dá)aroZ、aroY和catA的工程菌的MA產(chǎn)量

2.2 MA高通量測定方法的建立

為了提高M(jìn)A細(xì)胞工廠的生產(chǎn)能力，期望通過基因組復(fù)制工程，篩選得到產(chǎn)能提高的MA突變株。然而，利用產(chǎn)物HPLC分析等檢測方法難以進(jìn)行龐大的文庫篩選，需要有高通量的檢測和篩選方法。由此，基于MA在260 nm處有良好的紫外吸收性質(zhì)，我們測試了MA在 260 nm吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)測得的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)MA溶液濃度之間的關(guān)系為=2.703 2+4.406 8，相關(guān)系數(shù)的平方2為0.990 5，線性關(guān)系良好 (圖4)。因此，利用紫外檢測的方法可以用來實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)MA的突變體文庫快速、準(zhǔn)確地篩選。

圖4 紫外檢測MA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 MA細(xì)胞工廠的優(yōu)化

2.3.1 MA細(xì)胞工廠的高通量篩選

第一輪篩選：以MA30作為出發(fā)菌株，基于突變體的基因組復(fù)制工程構(gòu)建了MA突變文庫后，利用MA高通量篩選方法，對(duì)文庫進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測260 nm處的紫外吸光度值 (圖5A)。在含有950個(gè)樣本的MA30文庫中，篩選得到紫外吸收值大于MA30共351個(gè)，占文庫37%，并經(jīng)過搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，得到了MA產(chǎn)量提高的突變體MA30-G1。

圖5 MA突變體的紫外吸光度值

第二輪篩選：為了進(jìn)一步提高M(jìn)A30-G1的生產(chǎn)能力，以MA30-G1作為出發(fā)菌株，基于突變體的基因組復(fù)制工程構(gòu)建文庫后，利用MA高通量篩選方法，對(duì)文庫進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測260 nm處的紫外吸光度值(圖5B)。在含有950個(gè)樣本的MA30-G1文庫中，篩選得到紫外吸收值大于MA30-G1的突變體共171個(gè)，占文庫18%，并經(jīng)過搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，得到了MA產(chǎn)量進(jìn)一步提高的突變體MA30-G2。

2.3.2 篩選得到的進(jìn)化菌株搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià)

為了同時(shí)評(píng)價(jià)篩選得到的MA30-G1，MA30-G2以及對(duì)照MA30生產(chǎn)MA的情況，對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵評(píng)價(jià) (圖6)。通過基因組復(fù)制工程與高通量篩選方法的結(jié)合，先后成功篩選得到了MA產(chǎn)量較MA30提高4%的MA30-G1，較MA30-G1產(chǎn)量進(jìn)一步提高4.3%的MA30-G2，從而最終得到的MA30-G2較MA30產(chǎn)量提高了8.5%。因而，我們利用基因組復(fù)制輔助工程與MA高通量篩選方法，實(shí)現(xiàn)了快速、便捷的MA文庫構(gòu)建與篩選，并成功篩選到MA細(xì)胞工廠產(chǎn)能進(jìn)一步提高的MA30-G2。

圖6 大腸桿菌MA30-G1和MA30-G2相對(duì)于MA30的粘康酸產(chǎn)量提高率

2.3.3 MA30-G2的5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步研究工程菌生產(chǎn)MA的性能，選取MA30-G2作為出發(fā)菌株，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵 (圖7)。經(jīng)過72 h的發(fā)酵，MA產(chǎn)量最高為11.5 g/L，PCA、CA以及其他的副產(chǎn)物含量幾乎為0 g/L，而DHS積累了 2.7 g/L，轉(zhuǎn)化率8.1% mol/mol，其原因在于在MA30-G2(P2、P3和P3分別調(diào)控3個(gè)外源基因的表達(dá))中的由中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子P2調(diào)控，致使DHS無法完全轉(zhuǎn)化到PCA而積累了下來。通過放大發(fā)酵，MA30-G2的MA產(chǎn)量得到了進(jìn)一步的提高，較MA30提高了6.7倍。隨著MA產(chǎn)量的不斷增加，600在30 h達(dá)到最大值為19.4之后一直在降低， 78 h時(shí)降到12.4。一方面，由于發(fā)酵后期，菌體處于衰亡期，死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，總活菌數(shù)明顯下降，生理代謝活動(dòng)趨于停滯；另一方面可能由于MA的積累對(duì)MA30-G2造成了很大的生長壓力，抑制其生長。后續(xù)我們可以通過對(duì)MA30-G2進(jìn)行MA耐受性適應(yīng)性進(jìn)化，提高菌株對(duì)MA的耐受性，從而進(jìn)一步提高M(jìn)A工程菌的生產(chǎn)能力。

圖7 MA30-G2的5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

3 討論

本研究先后采用了理性設(shè)計(jì)原則以及基因組復(fù)制工程對(duì)產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌WJ060進(jìn)行改造與優(yōu)化，包括了在WJ060基因組中的位點(diǎn)上，依次整合3種不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子組合調(diào)控的3個(gè)外源基因(、) 的理性設(shè)計(jì)以及MA工程菌基于基因組復(fù)制工程構(gòu)建文庫與基于紫外檢測MA方法構(gòu)建的高通量篩選方法進(jìn)行篩選的非理性設(shè)計(jì)，從而得到了27株MA工程菌中MA產(chǎn)量最高的MA30以及產(chǎn)量進(jìn)一步提高的MA30-G2。

根據(jù)理性設(shè)計(jì)原則，在不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子組合調(diào)控3個(gè)外源基因表達(dá)而構(gòu)建的27株MA工程菌中，MA30 (由P2、P3和P3組成型啟動(dòng)子分別調(diào)控3個(gè)外源基因的表達(dá))在簡單的無機(jī)鹽搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)過24 h發(fā)酵，產(chǎn)量達(dá)到1.7 g/L，實(shí)現(xiàn)了MA生產(chǎn)過程無需添加額外的營養(yǎng)物質(zhì)，也成功避免了質(zhì)粒表達(dá)外源基因時(shí)存在的易丟失現(xiàn)象，極大降低了MA生產(chǎn)成本，為異源合成MA以及MA工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。然而，基于理性設(shè)計(jì)原則的代謝工程方法雖然可以通過對(duì)宿主的代謝網(wǎng)絡(luò)中的特定基因位點(diǎn)進(jìn)行遺傳改造，來實(shí)現(xiàn)微生物向著指定表型區(qū)域定向躍進(jìn)，但是，很難實(shí)現(xiàn)基因組上多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)擾動(dòng)來增強(qiáng)表型的目的。

于是，我們基于突變體的基因組復(fù)制工程構(gòu)建了1個(gè)含有將近千個(gè)突變體的文庫，實(shí)現(xiàn)了在MA30的基因組上多位點(diǎn)的同時(shí)擾動(dòng)，并利用已構(gòu)建的高效、便捷的MA紫外檢測和篩選方法，經(jīng)過兩輪的篩選，成功篩選得到MA產(chǎn)量逐步提高的MA30-G1和MA30-G2，在搖瓶發(fā)酵中MA30-G2的MA產(chǎn)量較MA30提高了8.5%。對(duì)MA30-G2進(jìn)行5 L發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵，經(jīng)過72 h的發(fā)酵，MA產(chǎn)量達(dá)到最高為11.5 g/L較MA30產(chǎn)量提高了6.7倍，從而證實(shí)了基因組復(fù)制工程與MA高通量篩選方法能夠高效而有效地提高M(jìn)A工程菌的生產(chǎn)能力。

本研究中，MA30-G2在含有較高濃度的MA時(shí)生長明顯受到抑制，后續(xù)可以通過對(duì)MA30-G2進(jìn)行耐受性適應(yīng)性進(jìn)化，提高其耐受性，進(jìn)一步提高M(jìn)A30-G2的生產(chǎn)能力。借助基因組復(fù)制工程，我們篩選得到的MA30-G1和MA30-G2以及原始菌株MA30進(jìn)行基因組重測序，期望通過序列對(duì)比以及功能性基因的差異性分析整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的差異性，從而為后續(xù)反向代謝工程操作提高M(jìn)A產(chǎn)量提供參考。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and optimization of microbial cell factories for producing-muconic acid

Guotian Song1,2, Xiaolong Jiang2, Wujiu Chen2, Yanfeng Peng2, Fuping Lu1, and Qinhong Wang2

1,,300457,CAS Key Laboratory of Systems Microbial BiotechnologyTianjin Institute of Industrial BiotechnologyChinese Academy of ScienceTianjinChina

-muconic acid (MA) is an important platform chemical. Now, majority of reported engineered strains are genetically instable, the exogenous genes are expressed under the control of expensive inducer and the components of their fermentation medium are complex, thus large-scale microbial production of MA is limited due to the lack of suitable strains. Hence, it is still necessary to construct novel high-performance strain that is genetically stable, no induction and grows in simple inorganic fermentation medium. In this study, after 3 exogenous genes (,,) for biosynthesis of MA were integrated into previously constructed 3-hydroshikimate producingWJ060 strain and combinatorially regulated with 3 constitutive promoters with different strengths, 27 engineered strains were constructed. The best engineered strain,MA30 could produce 1.7 g/L MA in the simple inorganic fermentation medium without induction. To further enhance the production capacity of MA, the mutant library ofMA30 was constructed by genome replication engineering and screenedhigh-throughput assay. After two-round screening, the new strain,MA30-G2 with improved production of MA was obtained, and the titer of MA increased more than 8%. Under the condition of 5 L fed-batch fermentation,MA30-G2 could produce about 11.5 g/L MA. Combinatorial regulation and high-throughput screening provide important reference to microbial production of other bio-based chemicals.

-muconic acid, combinatorial regulation,, constitutive promoters, genome replication engineering, high throughput screening

December 21, 2015; Accepted: January 15, 2016

Qinhong Wang. Tel/Fax: +86-22-84861950; E-mail: wang_qh@tib.cas.cn

Supported by:Key Technology R&D Programof Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 14ZCZDSY00066), Research Equipment Program of Chinese Academy of Sciences (No. YZ201153).

天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 14ZCZDSY00066)，中國科學(xué)院科研裝備項(xiàng)目 (No. YZ201153) 資助。

宋國田, 江小龍, 陳五九, 等. 產(chǎn)順,順-粘康酸細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 1212–1223.

Song GT, Jiang XL, Chen WJ, et al. Construction and optimization of microbial cell factories for producing-muconic acid. Chin J Biotech, 2016, 32(9): 1212–1223.