韓瑋，楊芙蓮，董文賓，馮麗琴

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

利用茶葉制備γ-氨基丁酸的工藝研究

韓瑋，楊芙蓮，董文賓，馮麗琴

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法對富硒茶中γ-氨基丁酸的含量進行測定，利用Intertsil ODS-C18色譜柱，以15mmol/L的乙酸鈉，純乙腈為流動相進行梯度洗脫。以γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度X（mg/mL）對峰面積Y（mAU·min）作回歸曲線，得回歸方程Y=3 488.4X＋23.525，相關(guān)系數(shù)為0.996 5。選用真空處理和谷氨酸鈉浸漬處理兩種方法對茶葉中γ-氨基丁酸進行富集，并對比富集效果。研究表明，在真空處理條件下處理10 h，富硒茶中γ-氨基丁酸的富集效果最好，γ-氨基丁酸含量增至0.875 mg/mL，是對照品的9.5倍。富硒茶在1%谷氨酸鈉溶液浸漬12 h后效果最好，γ-氨基丁酸含量為0.624mg/mL，是對照品的6.8倍。

γ-氨基丁酸；高效液相色譜；富集

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA）是一種由4個碳原子組成的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于真核生物和原核生物中。在高等植物中它是在谷氨酰胺脫羧酶催化下由谷氨酸不可逆脫羧而合成［1］。GABA作為人體和哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有極強的生理活性。研究表明，GABA具有降血壓、降低膽固醇、增進腦機能、促進睡眠、鎮(zhèn)痛安神、促進生長激素分泌、促進酒精代謝、抗癲癇和抗衰老等多種有益的保健功能［2-6］。近年來，GABA已作為新型的食品功能因子［7］，建立高效準確的檢測方法尤為重要。有研究對高效液相色譜法（HPLC）、改良紙層析法及Berthelot比色法進行了比較，結(jié)果表明HPLC測定GABA的結(jié)果準確、靈敏度高、適用范圍廣［8］。

GABA是一種植物逆境氨基酸［10］。在逆境脅迫下，GABA能起到應激信號的作用，其積累可提高植物的抗逆性［11］。已有研究表明逆境條件如缺氧、冷藏、失水、機械損傷、低pH、Ca2+濃度等都能強烈刺激植物細胞合成富集GABA［1］。

本試驗以富硒茶老葉為原料，利用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生高效液相色譜法建立了一種快速簡便測定GABA的方法。為了進一步提高茶葉中的γ-氨基丁酸含量，選用了真空處理和谷氨酸鈉溶液浸漬處理兩種方法對茶葉中的GABA進行富集，確定一種最佳的富集工藝，以期為GABA功能性產(chǎn)品的開發(fā)的研究提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1儀器

Agilent LC1200液相色譜儀：美國安捷倫（Agilent）公司；PL5243 PURE LAB Classic超純水系統(tǒng)：美國Pall-Gelman公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；BS-224型電子天平：德國SARTORIUS公司；HH-2型恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SC-3610型離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；PHS-3C型精密PH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2材料與試劑

茶鮮葉：陜西安康紫陽富硒茶，2015年11月2日茶園修剪茶樹后廢棄的老葉。

GABA標準品（≥99%）：美國sigma公司；乙腈（色譜純）：科密歐試劑有限公司；鄰苯二甲醛、2-巰基乙醇、無水乙酸鈉、冰乙酸、硼酸均為分析純。

1.3方法

1.3.1GABA標準溶液的配制

準確稱取GABA標準品0.050 0 g，用超純水溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的GABA標準溶液。分別稀釋此標準溶液液至0.050、0.080、0.100、0.200、0.400、0.600 mg/mL，備用。

1.3.2樣品預處理

1.3.2.1對照樣品

首先用微波爐對茶鮮葉進行殺青，時間1min～2min（使用中高檔，每50 s翻勻一次茶葉），放入鼓風干燥箱中80℃烘至絕干，粉碎至細度80目，供分析使用。

1.3.2.2厭氧處理試驗

將鮮葉晾曬至含水量約70%，用真空干燥箱在真空度0.08 MPa及溫度30℃下對其進行厭氧處理4、6、8、10、12、14 h（每個真空條件處理100 g鮮葉），處理完畢后即刻用微波爐殺青1 min～2 min（使用中高檔，每50 s翻勻一次茶葉），放入鼓風干燥箱中80℃烘至絕干，粉碎至細度80目，供分析使用。

1.3.2.3谷氨酸鈉溶液處理試驗

晾曬鮮葉100 g到含水量約70%，分別將茶葉用0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的谷氨酸鈉溶液，用其浸泡12 h后用去離子水潤洗瀝干用以除掉表面殘留的谷氨酸鈉，然后用微波爐殺青1 min～2 min（使用中高檔，隔50 s翻勻一次茶葉），放入鼓風干燥箱中80℃烘至絕干，粉碎過80目篩，供分析使用。

1.3.3γ-氨基丁酸的提取

茶粉5g→加10%冰醋酸溶液10mL與茶粉混勻→加去離子水50 mL→60℃浸提1.5 h→以3 600 r/min轉(zhuǎn)速離心保留清液→濾渣用于重復此操作→合并2次濾液定容至150 mL→放入4℃冰箱保存待用。

1.3.4衍生液的制備

準確稱取0.2 mg鄰苯二甲醛粉末，用10 mL甲醇溶解完全后，加入pH10.2，濃度0.4 mol/L的硼酸緩沖液40mL和600μL2-巰基乙醇，4℃條件下可存放2d。

1.3.5衍生化反應

取茶葉樣品或GABA標準液100 μL于樣品瓶中，加入鄰苯二甲醛衍生液1 000 μL，渦旋振蕩5 s后靜置2 min，過0.45 μm微孔濾膜，取20 μL進樣。

1.3.6色譜條件

色譜柱：IntertsilODS-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：流動相A為15 mmol/L的乙酸鈉，用4%的冰醋酸調(diào)pH值至5.90±0.05；流動相B為純乙腈；流速為1 mL/min；柱溫30℃；進樣量20 μL；檢測波長為332 nm；梯度洗脫程序如表1所示。

表1　梯度洗脫程序表Table 1Gradient elution program list

2　結(jié)果與討論

2.1GABA標準曲線的繪制

按照1.3.1方法配制GABA系列濃度的標準溶液后，根據(jù)1.3.5及1.3.6方法依次進行柱前衍生反應及HPLC測定，以峰面積Y（mAU·min）對質(zhì)量濃度X（mg/ mL）繪制標準曲線。標準曲線如圖1所示。

回歸方程Y=3 488.4X＋23.525，相關(guān)系數(shù)為0.9965。由此表明，用該法測GABA質(zhì)量濃度在0.02 mg/mL～1 mg/mL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可作為GABA的精確定量分析方法。

圖1　GABA的標準曲線Fig.1GABA standard curve

2.2γ-氨基丁酸的定性分析

在1.3.6中的色譜分析條件下，利用Intertsil ODSC18柱對已衍生的標樣和富硒茶葉樣品組分進行了有效地分離。無γ-氨基丁酸的空白衍生液、標準品以及富硒茶樣品的色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。

圖2　空白衍生液液相色譜圖Fig.2Liquid phase chromatogram of blank derivative liquid

圖3　GABA標準液液相色譜圖Fig.3Liquid phase chromatogram of the GABA standard

由圖2～圖4對比可知，γ-氨基丁酸的保留時間為18.4 min左右；富硒茶樣品中其它共存氨基酸和雜質(zhì)對目標物的測定沒有干擾。

2.3精密度試驗

圖4　樣品液液相色譜圖Fig.4Liquid phase chromatogram of the sample

取0.08 mg/mL的標準品重復進樣5次，根據(jù)5次測定樣品中GABA含量的數(shù)據(jù)可得峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.845%，質(zhì)量濃度的相對標準偏差（RSD）為0.432%，表明該色譜系統(tǒng)適用于GABA的含量測定。

2.4真空處理時間對富硒茶中GABA含量的影響

真空處理時間對富硒茶中GABA含量的影響見圖5。

圖5　真空處理時間對GABA含量的影響Fig.5Effect of vacuum processing time on the GABA content

由圖5可知，不同的真空處理時間對富硒茶GABA的富集效果存在差異，保持其它條件一致的情況下，富硒茶中GABA含量隨著真空時間的延長先增后減，在真空處理10 h時富硒茶中GABA的富集效果最好，原因可能是由于真空時間過長會影響L-谷氨酸脫羧酶的活性，使其合成受到抑制。富硒茶對照品中GABA含量為0.092 mg/mL，而經(jīng)過真空處理10 h后富硒茶中GABA含量增至0.875 mg/mL，相比而言，真空處理10 h后富硒茶GABA含量是對照品的9.5倍。

2.5谷氨酸鈉浸漬茶鮮葉中GABA含量的影響

谷氨酸鈉浸漬茶鮮葉中GABA含量的影響見圖6。

由圖6可知，不同濃度谷氨酸鈉對富硒茶中GABA的富集也存在差異。富硒茶中GABA隨著谷氨酸鈉濃度的增加先增后減，在1%濃度時富硒茶GABA含量達到在最大。原因可能是谷氨酸鈉底物濃度過高會抑制GABA的合成。通過色譜數(shù)據(jù)分析得1%谷氨酸鈉溶液浸泡12 h后，富硒茶含量為0.624 mg/mL，是富硒茶對照品中GABA含量的6.8倍。

圖6　谷氨酸鈉溶液濃度對GABA含量的影響Fig.6Effect of concentration of the solution of sodium glutamate on GABA content

3　結(jié)論

本研究采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法對茶葉中GABA的含量進行測定，具有高效、結(jié)果準確、精密度好的特點。選用真空處理和谷氨酸鈉溶液浸漬處理兩種方法對茶葉中的GABA進行富集，結(jié)果表明，真空處理10 h后，茶葉中的GABA富集效果最好，是對照品的9.5倍。該試驗以富硒茶廢棄老葉為原料，不僅提高了茶葉資源的利用率，還增加了茶葉的附加值，對茶葉的市場價值開發(fā)具有重要的意義。這不僅為后期開發(fā)茶葉系列的功能性產(chǎn)品提供了有力的理論依據(jù)，也為該系列產(chǎn)品中GABA含量測定提供了有效的分析手段。關(guān)于GABA更好的富集方法有待進一步研究。

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Study on the Preparation of Gamma Aminobutyric Acid from Tea

HAN Wei，YANG Fu-lian，DONG Wen-bin，F(xiàn)ENG Li-qin
（College of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

High performance liquid chromatography method with o-phthaldialdelhyde（OPA）pre-colomn derivatization was used to measure γ-aminobutyric acid content in Se tea.Separation of GABA was carried out on Intertsil ODS-C18 column with the gradient elution of 15 mmol/L sodium acetate and pure acetonitrile.In γaminobutyric acid concentration X（mg/mL）on the peak area Y（mAU·min）draw a regression curve，the regression equation was Y=3 488.4X+23.525，with correlation coefficient of 0.996 5.Tea was processed with vacuum and impregnation with a solution of sodium glutamate to enrich γ-aminobutyric acid，and compared with two enrichment effects.Studies had shown that under vacuum conditions，when Se tea was deal with 10 h，γ-aminobutyric acid enrichment effect was the best，γ-aminobutyric acid content increased to 0.875 mg/mL，which was 9.5 times of the reference.After being impregnated with a solution of 1%sodium glutamate 12 h，γaminobutyric acid enrichment effect was the best，its content was 0.624 mg/mL，which was 6.8 times of the reference.

gamma aminobutyric acid；HPLC；enrichment

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.025

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2013KTZB02-01-04）；西安市技術(shù)轉(zhuǎn)移促進工程項目（CXY1434-3）；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目（14JF002）

韓瑋（1991—），女（漢），在讀研究生，研究方向：食品新材料制備與分析檢測技術(shù)。

2015-12-15