馮雪儀 梁瑞蓮 梁玉全 葉珮璣 鄭嘉文

順德地區(qū)香港海鷗型菌流行情況與耐藥性規(guī)律研究

馮雪儀 梁瑞蓮 梁玉全 葉珮璣 鄭嘉文

廣東省佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院（佛山528300）

目的 對從淡水養(yǎng)殖魚類、青蛙樣品以及腹瀉病人大便樣品分離的菌株作臨床常用抗生素的耐藥性分析，為相關(guān)疾病的治療提供實驗依據(jù)。方法 獲取臨床腹瀉病人的新鮮大便標(biāo)本和在水產(chǎn)品市場采集淡水魚和青蛙樣品取腸道內(nèi)含物分別涂布選擇性培養(yǎng)基，選取疑似菌落進(jìn)行生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定，確證為香港海鷗型菌的菌株采用紙片擴(kuò)散法測定分離株對幾類臨床常見抗菌藥物的敏感性。結(jié)果 本次檢測的24株香港海鷗型菌分離株對八種常用的抗生素藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥性。蛙源株對環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶的耐藥率高于魚源株。其中分離的11株分離株（45.8%）對3個種類及以上抗生素表現(xiàn)耐藥，為多重耐藥株。結(jié)論 抗生素作為促生長劑和動物疾病防治被廣泛加于動物飼料中，可能導(dǎo)致食源性細(xì)菌耐藥性增加。人們有可能通過攝入含有香港海鷗型多重耐藥株污染的食物而獲得抗生素耐藥性的潛在危險。

海鷗型菌 流行情況 常用抗生素 耐藥性規(guī)律

香港海鷗型菌（Laribacter hongkongensis）隸屬奈瑟菌科的革蘭陰性桿菌。該菌于2001年首次在一名香港肝硬化病人的胸腔膿液中分離得到，隨后通過生化與分子鑒定確定其為新細(xì)菌屬，并根據(jù)其首次發(fā)現(xiàn)地和海鷗狀的形態(tài)而命名［1］。在2004年的一個多中心病例對照實驗中，香港大學(xué)的醫(yī)學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)香港海鷗型菌與社區(qū)獲得性胃腸炎和急性腹瀉有顯著關(guān)聯(lián)，且其致病性與食用淡水魚和外出旅游密切相關(guān)［2］。

至今，該菌已在亞洲、歐洲、非洲和美洲的病人身上分離得到，我國則在香港、浙江和廣東先后報導(dǎo)感染案例［3-4］，表明該菌的地區(qū)分布和致病力具有全球性。流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，香港海鷗型菌可從淡水魚類和青蛙的腸道中分離得到，推測該菌引致腸胃炎和腹瀉可能是由于病人食用了被污染的淡水魚或青蛙［5-6］。另外，最近的報道指出該菌可在自然淡水環(huán)境中分離得到，飲用不潔凈的水源亦有可能是該菌傳播途徑中的一種［7］。上述研究證據(jù)表明，香港海鷗型菌是一種有重要臨床與環(huán)境意義的新型病原菌。

多個研究報導(dǎo)指出，香港海鷗型菌對抗菌藥物的耐藥性比較嚴(yán)重。在一項針對不同來源香港海鷗型菌菌株的藥敏試驗顯示，14株香港海鷗型菌菌株對24種常用抗菌藥物中的15種分別表示出耐藥性［8］。在總結(jié)了香港海鷗型菌中的耐藥規(guī)律后，香港海鷗型菌的發(fā)現(xiàn)者Woo等建議以喹諾酮類抗生素作為需要抗菌治療的香港海鷗型菌感染病人首選藥物［9］。然而，喹諾酮耐藥的菌株也在2009年發(fā)現(xiàn)。因此，開展對香港海鷗型菌的耐藥性機(jī)制及流行規(guī)律的研究，指導(dǎo)臨床抗菌治療，是很有必要的。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在2015年2月—2016年1月期間，順德第一人民醫(yī)院課題組成員取200份臨床腹瀉病人的新鮮大便標(biāo)本，同時在水產(chǎn)品市場采集103份淡水魚和97份青蛙樣品取腸道內(nèi)含物標(biāo)本，共分離出22株香港海鷗型菌，其中魚類分離株13株，食用蛙分離株9株，腹瀉病人分離株0株。香港海鷗型菌病人分離株HKU1和魚分離株ZSU1由廣州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本培養(yǎng) 病人大便標(biāo)本及淡水魚、青蛙腸道內(nèi)容物用棉拭子直接涂布接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，置37℃恒溫箱培養(yǎng)48h。挑取淺灰色、半透明圓形、略凸起、直徑在1.0～1.5 mm之間的光滑菌落接種營養(yǎng)瓊脂平板分純，置37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2 生化鑒定 根據(jù)LH的主要生化特性，選定生化試驗項。將單個可疑菌落穿刺接種尿素瓊脂和三糖鐵瓊脂，進(jìn)行氧化酶、觸酶、精氨酸雙水解酶試驗。以大腸桿菌ATCC25922作為陰性對照。

1.2.3 PCR鑒定 用水煮法提取所有LH可疑菌株的DNA。挑取若干個純菌落于200μl無菌蒸餾水，振蕩混勻，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12000 r/min，離心5 min，取上清作為模板。針對LH的16 S rRNA基因序列自行設(shè)計的引物，上游序列為：5′ATC CCTAAG GCT AAT ACC CT 3′，下游序列為：5′AATCTC TTCGAG GTTCGG TA 3′，擴(kuò)增片段大小為550 bp。使用50μl反應(yīng)體系，包括10× PCR緩沖液5μl，25 mmol/L MgCl224μl，2.5 mmol/L dNTPs 4μl，5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.25μl，0.6 mmol/ L的引物各1μl，模板DNA 5μl，雙蒸水29.75μl。反應(yīng)條件為94.0℃5min，94.0℃30 s，53.0℃40 s，72.0℃40 s，35個循環(huán)，72.0℃5 min。用DL2000作為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的marker，并以LH魚源株ZSU1為陽性對照。

1.2.4 耐藥性測定 采用K-B紙片擴(kuò)散法測定，用金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC 25922作質(zhì)控菌株，判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國臨床與實驗室（CLSI）執(zhí)行?？股丶埰ǎ喊逼S西林、氨芐西林/蘇巴坦、頭孢他啶、安曲南、環(huán)丙沙星、阿米卡星、慶大霉素和美羅培南。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 此次臨床研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以（%）表示，組間數(shù)據(jù)比較采取χ2檢驗，而率的檢驗采取Fisher的概率檢驗法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

24株香港海鷗型菌分離株的耐藥性分析（見表1）。耐藥率從高到低依次如下：氨芐西林（100%），頭孢他啶（75%），環(huán)丙沙星（50%），阿米卡星（20.8%），慶大霉素（8.3%），而氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、美羅培南耐藥率為0。

不同來源香港海鷗型菌分離株的耐藥性比較（見表2）。應(yīng)用卡方檢驗，按照α=0.05水準(zhǔn)，蛙源株對環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶的耐藥率高于魚源株，而慶大霉素fisher=0.526、P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 24株香港海鷗型菌分離株的耐藥率例（%）

表2 魚源株和蛙源株對各種抗生素耐藥性卡方分析%

3 討 論

香港海鷗型菌的宿主已經(jīng)證實主要為淡水魚類與蛙類，有研究者推測香港海鷗型菌引起人群腹瀉的途徑是通過食入未經(jīng)煮熟的水產(chǎn)品或在加工過程中交叉污染食物而引起的感染，臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，部分患者有血便。其可能的源頭、傳播途徑、造成人類的可能感染方式和高危因素以及如何進(jìn)行有效的疾病預(yù)防和控制等多方面的的問題都亟待解決。

目前，發(fā)展中國家抗生素濫用情況十分普遍?？股刈鳛榇偕L劑和動物疾病防治被廣泛加于動物飼料中，在抗生素選擇的壓力下，可能導(dǎo)致食源性細(xì)菌耐藥性增加。如此廣泛的耐藥率，不排除與農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不規(guī)則使用抗生素有關(guān)，人們有可能通過攝入含有香港海鷗型多重耐藥株污染的食物而獲得抗生素耐藥性的潛在危險。本次檢測的24株香港海鷗型菌分離株對八種常用的抗生素藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥性。蛙源株對環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶的耐藥率高于魚源株。其中分離的11株分離株（45.8%）對3個種類及以上抗生素表現(xiàn)耐藥，為多重耐藥株。

順德地區(qū)淡水魚養(yǎng)殖與貿(mào)易有悠久的歷史，淡水魚是絕大部分順德人口的日常菜肴，食用魚生（生淡水魚片）是有順德特色的飲食習(xí)慣。然而，未經(jīng)煮熟的魚肉極易攜帶腸道疾病相關(guān)的病原菌，每年都有很多食用生魚片后的胃腸炎病例。香港海鷗型菌寄居在淡水魚腸道中，如制作魚類食品尤其是生魚片時發(fā)生腸道內(nèi)容物污染，該菌很可能隨食物進(jìn)入人體，引起相關(guān)感染疾病。

在流行病學(xué)調(diào)查中，常規(guī)的血清學(xué)鑒定往往重復(fù)性低、操作復(fù)雜和費(fèi)時等，延誤疫情的控制，而分子生物學(xué)技術(shù)為細(xì)菌的基因分型提供了有效手段，可以快速鑒定病原菌的種屬。本實驗對環(huán)境和臨床標(biāo)本中的香港海鷗型菌進(jìn)行分離鑒定，調(diào)查該菌在養(yǎng)殖魚類、蛙類和腹瀉病人中的分布，揭示該菌在順德地區(qū)的流行規(guī)律，并進(jìn)一步對分離菌株作臨床常用抗生素的耐藥性分析，測定了香港海鷗型菌分離株對抗生素的敏感性，為香港海鷗型菌食源性疾病的預(yù)防和控制、流行病學(xué)調(diào)查和溯源提供了研究依據(jù)，香港海鷗型菌的耐藥表型與基因分型之間的關(guān)系仍有待進(jìn)一步的研究。

［1］KIM SY，SONG D，PARK BK.Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR［J］.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13（6）：516-520.

［2］MANUELA，ONORI，LUANA，et al.Evaluation of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of bacterial and viral enteropathogens in stool samples of paediatric patients［J］.Diagnosticmicrobiology and infectious disease，2014，79（2）：149-154.

［3］TOLENTINO-RUIZ R，MONTOYA-VARELA D，GARCíA-ESPITIA M，etal.Development of amultiplex PCR assay to detect gastroenteric pathogens in the feces of Mexican children［J］.Currentmicrobiology，2012，65（4）：361-368.

［4］張淑紅，韓艷青，申玉學(xué)，等.河北省淡水魚香港海鷗型菌分布及耐藥性研究［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17（11）：2137-2139.

［5］KABAYIZA JC，ANDERSSONME，NILSSON S，etal. Diarrhoeagenic microbes by real-time PCR in Rwandan children under 5 years of age with acute gastroenteritis［J］.Clinical microbiology and infection，2014，20（12）：1128-1135.

［6］陳冰，馮嘉麗，李美霞，等.耐復(fù)方新諾明香港海鷗型菌中Ⅰ類整合子、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2）的檢測［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2012，28（3）：223-225.

［7］朱江峰，鄭南才，廖如燕，等.廣東省香港海鷗菌感染性腹瀉1例分析［J］.中國公共衛(wèi)生，2011，27（4）：403-405.

［8］賈宇靜，賀小峰，張歐，等.廣州市腹瀉病人香港海鷗形菌和產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌感染情況調(diào)查及耐藥性檢測［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（3）：455-457，462.

［9］譚海芳，譚翰清，丁麗娜，等.篩選與確診試驗在檢測香港海鷗菌中的建立與應(yīng)用［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10（6）：675-677，680.

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.025

2016-03-09）

2015年佛山市醫(yī)學(xué)科研基金立項（2015112）