王帥鋒，劉娜女，段曉磊，羅亦欣，范三紅，奚緒光

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

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熱脫硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表達、純化及功能分析

王帥鋒，劉娜女，段曉磊，羅亦欣，范三紅，奚緒光

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 通過原核表達系統獲得熱脫硫弧菌(ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜熱特性和解旋機理。【方法】 將Typif1解旋酶編碼區(qū)和SUMO促溶標簽編碼區(qū)融合連入pET15b獲得重組表達載體pET15b-SUMO-TyPif1，將該重組載體導入大腸桿菌BL21(DE3)菌株誘導表達，經Ni-NTA柱親和純化獲得融合蛋白，SUMO蛋白酶切除標簽，再經Ni-NTA柱去除標簽蛋白及SUMO蛋白酶，經Heparin柱進一步純化最終獲得TyPif1全長蛋白。通過熒光各向異性、圓二色譜(CD)和熒光共振能量轉移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA結合活性、解旋活性以及二級結構的熱穩(wěn)定性?！窘Y果】 獲得了純度大于95%的TyPif1蛋白，1 L培養(yǎng)基可以獲得約10 mg純度大于95%的蛋白；TyPif1解旋酶結合單鏈DNA和G4 DNA的活性明顯高于雙鏈DNA；TyPif1具有較高的解旋G4 DNA的活性，在25～60 ℃下其二級結構相對穩(wěn)定，且解旋速率隨溫度升高而增大，25～50 ℃TyPif1的解旋速率由0.09 s-1增大到0.23 s-1?！窘Y論】 表達純化了熱脫硫弧菌TyPif1解旋酶，其不僅具有良好的熱穩(wěn)定性，同時具有特異的結合和解旋G4 DNA的能力。

熱脫硫弧菌；Pif1解旋酶；蛋白表達純化；DNA結合活性；DNA解旋活性

解旋酶是一類利用水解NTP釋放的能量沿著DNA磷酸骨架移動的分子“馬達”，參與核酸復制、轉錄、重組與修復等過程，在生物體內扮演著重要的角色[1-2]。其相關基因突變會導致遺傳病的發(fā)生，如Werner 綜合癥、Bloom 綜合癥等[3-4]。Pif1解旋酶是高度保守的5′→3′方向解旋酶，屬于解旋酶超家族Ⅰ的一個亞家族，廣泛存在于病毒、原核和真核生物中[5-6]。釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeH.)Pif1是第一個被發(fā)現的Pif1基因(ScPif1)，其編碼蛋白ScPif1參與線粒體DNA的復制、重組[7-9]；隨后的研究表明，ScPif1也參與了端粒長度調控及核內DNA的斷裂修復[10-12]，說明ScPif1同時參與了線粒體和核基因組穩(wěn)定性的維持。釀酒酵母中還存在另一種Pif1-like蛋白Rrm3，其作為復制體的一部分，可以與聚合酶ε的催化亞基Pol2作用并在復制過程中隨著復制叉移動[13]；同時，酵母雙雜交試驗表明，Rrm3 N端保守的motif(模體)可以與PCNA(增殖細胞核抗原)相互作用[14-15]。裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeH.)中只存在一個Pif1家族解旋酶基因Pfh1[5]，該基因編碼兩種形式的Pfh1蛋白，一種定位于線粒體，一種定位于細胞核，缺失線粒體定位Pfh1會引起線粒體DNA丟失，并最終導致細胞死亡；缺失核定位異構體會導致細胞停滯在G2期，并引起核DNA損傷位點的累積[16-17]。哺乳動物中人類和小鼠基因組都只編碼單一的Pif1-like蛋白，序列比對發(fā)現人類和小鼠Pif1蛋白相似度高達84%，人類Pif1(hPif1)同其他Pif1-like蛋白相似，其作用靶點在細胞核和線粒體[18-19]；而小鼠Pif1可以與端粒酶相互作用，但對端粒長度沒有明顯影響[5]。

生化研究表明，Pif1解旋酶具有依賴ATP和Mg2+的5′→3′方向的解旋活性，ScPif1和hPif1均可以解旋DNA/DNA、DNA/RNA和G4 DNA底物，且ScPif1解旋DNA/RNA雜合底物的速度要快于DNA/DNA底物[12,20-21]；近期研究發(fā)現，ScPif1更偏好解開G4 DNA結構，其解旋G4 DNA的速度高于雙鏈DNA，且G4 DNA的存在能夠激活對雙鏈DNA的解旋活力[22]。進化分析發(fā)現，原核生物中同樣存在Pif1家族解旋酶，它們也具有雙鏈DNA和G4 DNA解旋活力[23]。

獲取酶蛋白甚至蛋白/底物共結晶對于闡明特定酶的催化機理具有關鍵性作用，而嗜熱菌蛋白具有易表達純化、結構穩(wěn)定、易結晶等優(yōu)點，通常被用于大分子結構解析，如已報道的DnaB、RecG和XPD等嗜熱菌蛋白[24-26]。本研究以一種熱脫硫弧菌(ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.)(最適生長溫度為65 ℃)Pif1基因TyPif1[27]為材料，利用蛋白原核表達系統獲得高純度TyPif1蛋白，并對其熱穩(wěn)定性、DNA結合活性和解螺旋活性進行分析,以期拓展原核生物Pif1家族解旋酶活性研究，并為Pif1家族解旋酶結構解析提供素材。

1　材料與方法

1.1材料

表達載體pET15b、克隆菌株E.coli2984、表達菌株E.coliBL21(DE3)均為本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ購自NEB公司；T4 DNA連接酶、Prime STAR HS DNA polymerase購自大連寶生物公司；PageRuler預染蛋白Ladder購自Thermo Scientific公司；Ni-NTA Beads購自QIAGEN公司；HiTrap Heparin HP 5 mL預裝柱購自GE公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2方法

1.2.1底物制備用于底物制備的熒光標記和非標記單鏈DNA由上海生工生物公司合成；制備雙鏈和帶有G4結構的DNA底物時，將對應寡核苷酸溶于包含100 mmol/L KCl的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.0)緩沖液中，100 ℃加熱5 min，然后緩慢冷卻至室溫。DNA底物的序列長度見表1，其中前5種底物用于DNA結合活性測定，第6～8種底物用于DNA解旋活性測定。

表 1　試驗所用的DNA底物信息Table 1　DNA oligonucleotides used in the study

注：F代表熒光素；H代表六氯熒光素。

Note:F represents fluorescein;HF represents hexachloro fluorescein.

1.2.2表達載體的構建EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pBMH-TyPif1質粒(該質粒中包含TyPif1解旋酶編碼序列，由BioMatik公司合成)，獲得TyPif1基因編碼區(qū)序列；對編碼序列進行PCR擴增獲得SUMO編碼序列(本實驗室保存)，并用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將獲得的2個基因片段與同樣經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET15b載體混合連接；經菌落PCR、雙酶切檢測及測序確證后，最終獲得重組表達載體pET15b-SUMO-TyPif1。

1.2.3重組TyPif1解旋酶在大腸桿菌中的過量表達和純化將重組載體pET15b-SUMO-TyPif1轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單克隆活化，37 ℃擴大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時加入IPTG(終濃度0.2 mmol/L)，28 ℃誘導培養(yǎng)6～8 h。離心收獲菌體并稱質量，按照1∶5～1∶10的質量體積比加入lysis Buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，體積分數10% 甘油，10 mmol/L 咪唑)，高壓破碎細胞，并進一步超聲斷裂DNA，以降低溶液黏度，12 000 r/min離心20 min后用0.45 μm濾膜過濾，所得上清載入Ni-NTA親和柱，使用Elute Buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300 mmol/L NaCl，體積分數10% 甘油，300 mmol/L 咪唑)洗脫。按照1∶1 000物質的量比加入SUMO蛋白酶，4 ℃過夜酶切，透析除去咪唑后再次載入Ni-NTA親和柱，收集穿出液；用無鹽緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，體積分數10% 甘油)稀釋1倍，然后載入Heparin柱進一步純化。收集目標蛋白組分，使用30 ku的Millipore超濾管離心濃縮，分裝后液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。分離過程中使用10%SDS-PAGE電泳檢測各步驟獲得樣品的純度。

1.2.4TyPif1解旋酶的DNA結合活性測定用Infinite F200/M200型多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)測定TyPif1解旋酶的DNA結合活性，反應體系150 μL，其中包含5 nmol/L熒光標記DNA和TyPif1解旋酶， 37 ℃孵育5 min后測定每一個反應體系的各向異性值。由于鹽濃度和pH對解旋酶與DNA結合活性的影響很大，因此首先以18nt ssDNA為參考測定TyPif1結合DNA的最適緩沖液組分(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT)。在此條件下分別測定5種底物(表1中1～5底物)的各向異性值，用米氏方程擬合試驗結果，Binding size(結合步長)參考Dou等[28]的方法計算。

1.2.5TyPif1解旋酶的熱穩(wěn)定性分析使用Bio-Logic MOS450/AF-CD光學系統(法國Bio-Logic公司)，檢測TyPif1在波長190～260 nm下的圓二色光譜(CD)值，以在25 ℃生活的擬桿菌(Bacteroidesspp.)Pif1解旋酶(BsPif1)(本實驗室制備，分子質量50 ku)為對照。測定時將Pif1蛋白稀釋至0.5 mg/mL，注入厚度為1 mm的石英杯中，在不同溫度(25，30，37，45，50，55，60 ℃)下分別進行樣品的CD測試，每個溫度處理預平衡3 min，檢測步長1 nm，分辨率0.1 nm，掃描速度100 nm/min,每試驗重復3次。使用公式：θmoral,λ=θλ×100/m×d處理數據，其中，θλ為不同波長下的CD吸收峰(mdeg)，m為樣品的物質的量(mol)，d為石英杯的厚度(cm)[29]。

1.2.6TyPif1解旋酶的DNA解旋活性測定使用Bio-Logic SFM-400混合儀(法國Bio-Logic公司)，利用熒光共振能量轉移(FRET)原理測定TyPif1解開DNA螺旋的活性，以BsPif1為對照。DNA底物的2條鏈分別用熒光素和六氯熒光素標記，激發(fā)波長492 nm，檢測波長525 nm。反應體系緩沖液包含25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、10 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP，解旋酶濃度為100 nmol/L，底物濃度為4 nmol/L。用14nt-38bp底物研究溫度對Pif1蛋白解旋活性的影響，溫度設置為25，30，37，45，50，55 ℃；50nt-16bp和26nt-3G4-17bp底物用于TyPif1的解旋底物偏好性測定，解旋試驗數據處理參考Zhang等[30]的方法。

2　結果與分析

2.1TyPif1基因表達載體構建及編碼蛋白的表達純化

構建表達載體pET15b-SUMO-TyPif1的流程見圖1-A，該載體經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切檢測獲得預期條帶(圖1-B)。將重組質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)表達菌，28 ℃誘導表達后重組蛋白大部分以可溶形式存在(圖1-C泳道2)。上清經過Ni-NTA親和柱純化、SUMO蛋白酶切并再次過Ni-NTA親和柱及Heparin柱，純化后再用10%SDS-PAGE電泳檢測(圖1-C)。最終在1 L 發(fā)酵LB培養(yǎng)基中獲得了約10 mg純度大于95%的蛋白。

圖 1pET15b-SUMO-TyPif1載體構建(A)、雙酶切檢測(B)及TyPif1蛋白的表達純化(C)

(B)M.DS5000 DNA Marker,1.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET15b-SUMO-TyPif1載體；(C)M.蛋白Marker,1.不溶蛋白,2.可溶蛋白,3.Ni-NTA磁珠純化的重組蛋白,4.SUMO酶切的重組蛋白,5.再次被Ni-NTA磁珠純化的TyPif1蛋白,6.被Heparin柱純化的TyPif1蛋白,7.純化后的TyPif1蛋白

Fig.1Construction and double digestion of recombination vector(A),expression (B) and purification (C)of TyPif1 helicase analyzed by SDS-PAGE

(B)M.DS5000 DNA Marker,1.pET15b-SUMO-TyPif1 digested withEcoRⅠ andXhoⅠ;(C)M.Protein Marker,1.Insoluble protein induced by IPTG,2.Soluble protein induced by IPTG,3.Recombinant protein purified by Ni-NTA beads,4.Recombinant protein cleaved by SUMO protease,5.TyPif1 re-purified by Ni-NTA beads,6.TyPif1 purified by Heparin column,7.TyPif1 after final concentration

2.2TyPif1解旋酶的DNA結合活性

酶標儀試驗結果表明，TyPif1解旋酶結合單鏈、雙鏈以及G4螺旋DNA底物的活力具有差異性，依據米氏方程擬合，得到TyPif1結合24nt ssDNA、G4 DNA、24bp dsDNA的米氏常數Km依次為14.03±1.69，13.97±2.92，223.79±54.61，由Km值可知，解旋酶對不同底物的結合活性強弱依次為G4 DNA>24nt ssDNA?24bp dsDNA(圖2-A)。TyPif1解旋酶結合16、18、24 nt ssDNA的各向異性值經過數據處理后結果如圖2-B所示。由圖2-B可見，隨著DNA長度的延長，結合相同總量的底物所需要的解旋酶增多，表明DNA底物越長需要結合解旋酶的分子數量越多。數據處理后得到TyPif1結合單鏈DNA的化學計量數(N)與單鏈長度的線性關系，當化學計量數N=1時，表明在底物上只結合1個解旋酶分子，根據線性關系得出底物長度為11.27 nt，即Binding size=11.27 nt(圖2-C)。

圖 2TyPif1解旋酶的DNA結合活性

(A)TyPif1解旋酶結合單鏈DNA、雙鏈DNA和G4 DNA的比較；(B)TyPif1解旋酶結合不同單鏈DNA底物的比較；(C)單鏈DNA底物與化學計量數的線性關系

Fig.2DNA binding activity of TyPif1

(A)Comparison of binding to ssDNA,dsDNA and G4 DNA to TyPif1 helicase;(B)Comparison of TyPif1 helicase binding to different length ssDNA helicase;(C)The linear relationship of ssDNA substrate and number of stoichiometry

2.3TyPif1解旋酶的熱穩(wěn)定性

由圖3-A可知，TyPif1在216 nm處有一個強負峰，且隨著溫度升高其負峰強度逐漸減小，表明其二級結構以β折疊為主，且隨溫度升高β折疊含量逐漸減少；但是TyPif1隨溫度改變呈現相似的CD曲線，說明其二級結構在25～60 ℃變化不大。而BsPif1的CD圖譜隨著溫度升高負峰強度減小且溫度高于45 ℃后出現峰遷移現象(圖3-B)，由此可知BsPif1在溫度高于45 ℃后二級結構發(fā)生劇烈變化。

圖 3不同溫度下TyPif1(A)和BsPif1(B)二級結構的CD譜圖

Fig.3CD spectra of TyPif1(A) and BsPif1(B) at different temperatures

2.4TyPif1解旋酶的解旋活性

使用FRET方法檢測TyPif1解旋的DNA底物，結果如圖4所示。由圖4-A可知，嗜熱菌TyPif1的解旋速率低于BsPif1，然而溫度升高時TyPif1解旋DNA雙鏈的速率由25 ℃時的0.09 s-1增加到50 ℃時的0.23 s-1，而BsPif1的解旋速率則隨著溫度升高而降低，高于45 ℃解旋活性完全喪失。這表明溫度對TyPif1解旋酶具有激活作用，溫度升高有利于解旋反應的進行，這與該嗜熱細菌生活環(huán)境中的生長和代謝規(guī)律相吻合。圖4-B反映了TyPif1解旋G4 DNA和雙鏈DNA的差異，數據經雙指數擬合得到TyPif1解開G4 DNA和雙鏈DNA的速率分別為0.546和0.301 s-1，表明TyPif1解旋G4 DNA的活力明顯高于雙鏈DNA。

圖 4　TyPif1酶在不同溫度(A)和DNA底物(B)下的解旋活性

3　討　論

本研究利用原核系統表達純化了一種熱脫硫弧菌Pif1解旋酶，利用優(yōu)化的純化方法可從1 L菌液中得到約10 mg純度大于95%的全長TyPif1蛋白。試驗測定了TyPif1解旋酶與不同DNA底物的結合活性，發(fā)現其結合G4 DNA和單鏈DNA的活性要高于雙鏈DNA，TyPif1對G4 DNA的高親和力是其特異性解旋G4 DNA的保證。Dou等[28]研究大腸桿菌RecQ解旋酶的DNA結合特性時，得到大腸桿菌RecQ解旋酶的Binding size為8～12 nt。本研究通過對不同長度單鏈DNA結合活性的測定，得出TyPif1結合DNA底物的Binding size為11.27 nt，但是由于使用單鏈較少，獲得的Binding size可能會有所偏差。

Paeschke等[23]研究表明，Pif1解旋酶解旋G4 DNA的活力是RecQ家族解旋酶的1 000倍，此外，通過對比不同的解旋底物發(fā)現，RecQ家族解旋酶擅長解旋Y-結構底物，而Pif1家族擅長解旋G4 DNA底物。最新研究表明，ScPif1解旋酶以單體形式發(fā)揮作用，同時研究還證明，G4結構的存在能夠強烈激活ScPif1解旋酶的解旋雙鏈DNA底物活力[22]。本研究發(fā)現，TyPif1解旋酶同樣能解旋雙鏈DNA和G4 DNA，且解旋G4 DNA的速率高于雙鏈DNA，表明其更偏好于解旋含有G4結構的DNA底物，這與最近報道的ScPif1解旋酶的特性一致，然而ScPif1解旋酶解旋G4 DNA底物的速度高于TyPif1解旋酶[22-23]。

TyPif1解旋酶基因來自于一種生活在黃石湖熱水口的熱脫硫弧菌[27]，本研究通過圓二色譜(CD)分析發(fā)現，TyPif1解旋酶在25～60 ℃內二級結構穩(wěn)定，其DNA解螺旋活性隨著溫度升高而增大；而在25 ℃環(huán)境中生活的擬桿菌BsPif1解旋酶活力隨著溫度升高逐漸喪失。TyPif1的這一現象與其在生活環(huán)境中的生長和代謝規(guī)律吻合，而有關真核生物Pif1解旋酶如ScPif1和hPif1卻無此報道。

Pif1解旋酶家族其他成員如hPif1、Rrm3、Pfh1不能獲得全長蛋白[23]，而TyPif1解旋酶具有該家族成員共有的DNA結合特性和解旋活性，同時具有良好的熱穩(wěn)定性。選擇熱脫硫弧菌Pif1解旋酶作為研究材料，一方面可拓展Pif1解旋酶的研究范圍，另一方面則是由于嗜熱菌蛋白相對容易結晶。本研究建立的表達純化體系為后續(xù)功能和結構研究提供了一個理想的素材，為基于Pif1解旋酶的新藥開發(fā)提供了理論依據。

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Prokaryotic expression,purification and functional analysis ofThermodesulfovibrioyellowstoniiH.TyPif1

WANG Shuaifeng,LIU Nanü,DUAN Xiaolei,LUO Yixin,FAN Sanhong,XI Xuguang

(CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This research used prokaryotic expression system to obtain Pif1 helicase fromThermodesulfovibrioyellowstoniiH.(TyPif1),and studied the mechanism of thermophilic characteristic and unwinding mechanism of TyPif1 helicase.【Method】 ThePif1 gene ofThermodesulfovibrioyellowstoniiH.(Typif1) and a SUMO protein folding tag gene were synthesized to pET15b to construct recombinant plasmid pET15b-SUMO-TyPif1.Then,the plasmid was transformed intoEscherichiacolihost strain BL21 (DE3),and the TyPif1 helicase was purified by two-step Ni-NTA affinity chromatography and one-step Heparin chromatography at 4 ℃ using FPLC.Fluorescence anisotropy,fluorescence resonance energy transfer (FRET) and circular dichroism spectrum (CD) were used to analyze the DNA binding and unwinding activity of TyPif1 as well as the stability of its secondary structure.【Result】 The full-length TyPif1 helicase with high purity of >95% was obtained.Its binding activity with ssDNA and G-quadruplex (G4) DNA was much higher than that of dsDNA.TyPif1 has high activity to unwound G4 DNA.The secondary structure was relatively stable under 25-60 ℃,and the unwinding rate increased from 0.09 s-1to 0.23 s-1with the increase of temperature from 25 to 50 ℃.【Conclusion】 TyPif1 helicase was expressed and purified.TyPif1 helicase not only had good thermal stability,but also had specific ability of binding and unwinding G4 DNA.

ThermodesulfovibrioyellowstoniiH.;Pif1 helicase;protein expression and purification;DNA binding activity;DNA unwinding activity

時間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.028

2015-03-06

國家自然科學基金項目(31370798,11304252)

王帥鋒(1989-)，男，河南平頂山人，在讀碩士，主要從事生物大分子結構與功能研究。E-mail:phoonwang@163.com

奚緒光(1958-)，男，吉林公主嶺人，教授，博士，博士生導師，主要從事生物大分子結構及功能研究。

E-mail：xxi01@ens-cachan.fr

Q781；Q814.1

A

1671-9387(2016)09-0207-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0941.056.html