陸　斌， 李建武， 楊　艷

(中國人民武裝警察部隊陜西省總隊醫(yī)院骨科，西安　710054；*通訊作者，E-mail：lubin0008@163.com)

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microRNA-365在骨肉瘤患者血漿中的表達及其意義

陸斌*， 李建武， 楊艷

(中國人民武裝警察部隊陜西省總隊醫(yī)院骨科，西安710054；*通訊作者，E-mail：lubin0008@163.com)

目的探討microRNA-365(miR-365)在骨肉瘤患者血漿中的表達水平及其臨床意義。方法采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)方法檢測35例骨肉瘤患者和40例健康對照者血漿中miR-365的表達水平，并統(tǒng)計分析骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平與臨床病理參數之間的關系。結果骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平為0.38±0.16，明顯低于正常對照組血漿中miR-365的表達水平(0.61±0.24)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達水平在不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型及Enneking分期中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論miR-365在骨肉瘤患者血漿中的水平降低，miR-365可能參與骨肉瘤的發(fā)病。

microRNA-365；骨肉瘤；定量逆轉錄聚合酶鏈反應

骨肉瘤(osteosarcoma)是一種好發(fā)于兒童和青少年的骨骼系統(tǒng)的惡性腫瘤，起源于間葉組織，占惡性骨腫瘤的35%。由于骨肉瘤發(fā)展快、惡性程度高，骨肉瘤早期診斷及治療較為困難[1-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)一種長度約22-24個堿基內源性表達的非編碼單鏈小RNA，參與了早期發(fā)育、細胞增殖、分化及凋亡等生理過程。大量研究表明許多miRNAs可作為原癌基因或者抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[6]，國內外研究證實多種miRNAs在骨肉瘤組織或細胞中異常表達，參與了骨肉瘤的病理過程[7-11]。國內學者研究發(fā)現(xiàn)miR-365可能通過調節(jié)KRAS基因表達來抑制骨肉瘤細胞SOSP9607增殖并促進其凋亡[12]，本實驗為了進一步研究miR-365在骨肉瘤發(fā)病中的作用，利用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測miR-365在骨肉瘤患者血漿中的表達水平，并分析miR-365表達水平與臨床病理參數之間的關系，以便為骨肉瘤的早期診斷提供新的理論依據和實驗基礎。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取2012-01～2015-12在中國人民武裝警察部隊陜西省總隊醫(yī)院骨科住院且經過影像學及病理學確診的骨肉瘤患者35例，其中男性20例，女性15例，年齡10-38歲(平均19.2±8.4歲)。Enneking分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期23例，Ⅲ期7例；骨肉瘤部位：股骨17例，脛骨13例，其他5例；瘤體大?。褐睆健? cm 23例，直徑>5 cm 12例；參照Dahlin標準的組織學分型：骨母細胞型15例，軟骨母細胞型9例，纖維母細胞型7例，其他4例。40例正常對照組為中國人民武裝警察部隊陜西省總隊醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康人，其中男性23例，女性17例，年齡10-42歲，平均(21.3±9.5)歲。兩組研究對象性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)、內參照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)引物購自天根生化科技(北京)有限公司。紫外分光光度儀為美國Thermo Scientific公司產品，高速冷凍離心機為德國Eppendorf公司產品，定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.2.2方法無菌采集所有研究對象EDTA抗凝外周靜脈血5.0 ml，其中骨肉瘤患者在手術、放療或化療等抗腫瘤治療前進行樣本采集。血液分別經過3 000 r/min離心10 min、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后收集上層血漿置于EP管中-80 ℃保存待用。取200 μl血漿采用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒提取RNA，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。RNA溶于10 μl的DEPC水中，用紫外分光光度儀檢測RNA溶液的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.1的RNA用于進行逆轉錄反應。利用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA合成，20 μl反應體系具體如下： RNA 2 μl、2×miRNA RT 反應緩沖液10 μl、miRNA 逆轉錄酶2 μl、無RNA酶水6 μl，逆轉錄反應條件：42 ℃ 60 min、95 ℃ 3 min，合成的cDNA反應液放置于-20 ℃保存待用。采用內參照U6(CD201-0145)及miR-365(CD201-0367)的引物進行PCR擴增，20 μl PCR反應體系包括：2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA 1 μl、50×ROX Reference Dye 2 μl、雙蒸水6.2 μl，反應條件：95 ℃ 預變性15 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s 共40個循環(huán)。反應結束后獲得溶解曲線及循環(huán)閾值(Ct值)，每個樣本做3個復孔，采用2-ΔΔCt分析miR-365的表達水平。

1.3統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1兩組血漿中miR-365表達水平的比較

qRT-PCR檢測血漿中miR-365的表達水平結果顯示，骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平為0.38±0.16，明顯低于正常對照組血漿中miR-365的表達水平(0.61±0.24)，二者差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.899，P<0.01)。

2.2骨肉瘤患者血漿miR-365表達水平與臨床病理參數之間的關系

根據qRT-PCR檢測miR-365表達結果的中位值，將骨肉瘤患者分為低表達組(n=20)和高表達組(n=15)，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達水平在不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理類型及Enneking分期中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

3　討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于脛骨近端和股骨遠端等長管狀骨的干骺端，具有惡性程度高、侵襲能力強等特點。外科手術及放療是目前主要的治療方法，雖然隨著醫(yī)療技術的不斷提高，骨肉瘤患者的5年生存率有了大幅度提高，但由于早期容易發(fā)生肺轉移及化療藥物耐藥，骨肉瘤患者的總體預后較差[1-5]。目前骨肉瘤的診斷主要根據臨床癥狀及影像學檢查，缺乏臨床檢測指標以便早期診斷、評價預后，因此迫切需要尋找新的有效的骨肉瘤的早期診斷腫瘤標志物以進一步提高骨肉瘤的早期診斷和治療水平。

表1骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平與臨床病理參數的關系(例)

Table 1Relationships between plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters in patients with osteosarcoma(cases)

臨床病 理指標 n低表達(n=20)高表達(n=15)χ2P年齡1.390.24 ≥16歲1486 <16歲21129性別0.060.81 男20119 女1596腫瘤部位1.050.59 股骨17116 脛骨1376 其他523腫瘤大小2.720.10 >5cm1275 ≤5cm231310病理類型0.760.86 骨母細胞型1587 軟骨母細胞型954 纖維母細胞型752 其他422Enneking分期1.190.55 Ⅰ期523 Ⅱ期231310 Ⅲ期752

初級miRNA (primary miRNA)和前體miRNA (precursor miRNA，pre-miRNA)在 Drosha 復合體和 Dicer 酶的作用下在胞質中由剪切成為成熟miRNA，miRNA主要通過與靶基因 mRNA 的3′UTR結合導致靶基因降解或者抑制靶基因的表達，從而在轉錄后水平阻斷靶基因的表達，進而發(fā)揮基因調節(jié)作用，參與調控發(fā)育、細胞增殖、凋亡、分化等多個生理過程，miRNA廣泛存在真核生物中，具有組織特異性和時序性。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，扮演著“癌基因”和/或“抑癌基因”的重要角色[6]。國內學者采用miRNA芯片技術檢測骨肉瘤組織和正常組織異常表達的miRNA，結果發(fā)現(xiàn)54個異常表達miRNA[13]，Lulla等[14]在骨肉瘤組織及細胞株中也發(fā)現(xiàn)22個miRNA差異表達。Namls等[15]采用定量PCR技術方法發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中103個miRNA表達上調，74個miRNA表達下調。此外多項研究分析發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達水平與骨肉瘤的臨床病理參數及預后密切相關[16-19]。

miR-365基因定位16p13.12，miR-365的功能非常復雜，在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。國內外學者利用miRNA芯片技術或定量PCR技術研究發(fā)現(xiàn)miR-365在結腸癌[20]、肺癌[21,22]、肝癌[23,24]、惡性黑色素瘤[25]、兒童白血病[26]及胃癌[27]等腫瘤組織或細胞系中表達下調。但有研究發(fā)現(xiàn)在浸潤性導管胰腺癌[28]、皮膚鱗狀細胞癌[29]中miR-365的表達水平增高，這也表明miR-365在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。miRNA在外周血中由于包裝機制而不易被RNA酶降解，可以非常穩(wěn)定地存在，血液中miRNA的濃度較高，達到作為生物標記物的檢測濃度，血漿或血清miRNA均可以用作生物標記物。我們前期研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-181b水平增高，miR-181b可能參與了骨肉瘤的發(fā)病過程[19]。有學者利用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)非小細胞肺患者血清中miR-365表達水平明顯降低[30]。國內學者研究發(fā)現(xiàn)miR-365的模擬物可以抑制骨肉瘤細胞SOSP-9607的增殖，促進細胞凋亡，下調KRAS基因的表達；而miR-365的抑制物則可以促進細胞增殖，抑制凋亡，上調KRAS基因的表達[12]，提示miR-365可能通過調節(jié)KRAS基因的表達而發(fā)揮抑癌作用。我們利用qRT-PCR檢測了骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平，結果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平明顯低于正常對照組(P<0.01)，提示miR-365可能參與骨肉瘤的發(fā)病。國內外研究還發(fā)現(xiàn)miR-365的表達水平與腫瘤的淋巴結轉移、臨床分期及預后有關[22-25]。我們也統(tǒng)計分析了骨肉瘤患者血漿中miR-365表達水平與臨床病理參數的關系，結果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血漿中miR-365的表達水平在不同年齡、不同性別、不同腫瘤部位、不同腫瘤大小、不同病理類型及不同Enneking分期中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能與我們的病例數量較少有關，需要擴大樣本量進一步研究，同時本研究缺乏隨訪，無法分析miR-365在骨肉瘤患者預后中的價值。

綜上所述，骨肉瘤患者血漿miR-365中表達水平降低，提示miR-365可能參與了骨肉瘤的病理過程，但miR-365的作用機制及在骨肉瘤預后中的作用有待進一步研究，相信隨著研究的不斷深入miR-365有可能作為骨肉瘤的診斷標志物、預后及治療靶標。

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Plasma levels of microRNA-365 in patients with osteosarcoma and its clinical significance

LU Bin*，LI Jianwu，YANG Yan

(DepartmentofOrthopaedics,ChinesePeople’sArmedPoliceTroopsShaanxiProvinceCorpsHospital,Xi’an710054,China;*Correspondingauthor,E-mail:lubin0008@163.com)

ObjectiveTo explore the plasma levels of microRNA-365(miR-365) and its clinical significance in patients with osteosarcoma.MethodsThe plasma levels of miR-365 were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) in 35 patients with osteosarcoma and 40 healthy controls. The relationships between the plasma levels of miR-365 and clinical pathological parameters of osteosarcoma were analyzed.ResultsThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma were statistically lower than in healthy controls(0.38±0.16vs0.61±0.24,P<0.01). There was no statistical difference in plasma levels of miR-365 in different age, gender, tumor site, tumor size, histological type and Enneking stage of patients with osteosarcoma(P>0.05).ConclusionThe plasma levels of miR-365 in patients with osteosarcoma decrease，which suggests that miR-365 may participate in the pathogenesis of osteosarcoma.

microRNA-365；osteosarcoma；quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

陜西省科技計劃基金資助項目(2012k16-09-01)

陸斌，男，1975-09生，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:lubin0008@163.com

2016-07-26

R738.1

A

1007-6611(2016)10-0930-04DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.012