毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的非酶褐變?cè)蚪馕?/h1>
2016-11-14 12:37:56李世燕任躍英牛廣財(cái)魏文毅
食品科學(xué) 2016年15期
朱 丹，李世燕，任躍英*，牛廣財(cái)，魏文毅，王 贏(yíng)
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）
毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的非酶褐變?cè)蚪馕?/p>
朱 丹1，2，李世燕3，任躍英1，*，牛廣財(cái)3，魏文毅3，王 贏(yíng)3
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）
以毛酸漿為原料，同時(shí)接入酵母菌和乳酸菌，在25、30 ℃和37 ℃條件下對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵。以褐變度（browning degree，BD）為指標(biāo)，檢測(cè)其在發(fā)酵過(guò)程中引起非酶褐變的抗壞血酸（VC）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態(tài)氮等化學(xué)組分的變化。采用通徑系數(shù)分析方法，解析毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。結(jié)果表明，在25、30 ℃和37 ℃等不同發(fā)酵條件下，毛酸漿發(fā)酵液中5-HMF含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量等變化與褐變度的變化密切相關(guān)。在25 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和還原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在30 ℃發(fā)酵條件下，氨基酸態(tài)氮含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和氨基酸態(tài)氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，同時(shí)，也是決定褐變度的首要因素。美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。
毛酸漿；發(fā)酵；非酶褐變；通徑分析
朱丹， 李世燕， 任躍英， 等. 毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的非酶褐變?cè)蚪馕觯跩］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 204-208. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn
ZHU Dan， LI Shiyan， REN Yueying， et al. Analysis of mechanism of non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during fermentation［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 204-208. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn
毛酸漿（Physalis pubescens L.）別名洋菇娘、黃菇娘等，為茄科酸漿屬多年生草本植物［1］。毛酸漿是一種藥食兩用植物，具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預(yù)防動(dòng)脈硬化和心血管疾病的發(fā)生和保護(hù)皮膚等作用［2-4］。利用微生物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，是毛酸漿的一種較常見(jiàn)的深加工方式。但是，在其發(fā)酵過(guò)程中，非酶褐變現(xiàn)象非常嚴(yán)重，產(chǎn)品顏色發(fā)生改變，降低了毛酸漿發(fā)酵產(chǎn)品的商品價(jià)值。目前普遍認(rèn)為導(dǎo)致非酶褐變（non-enzymatic browning）的主要原因有：美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）、抗壞血酸（VC）氧化分解、多酚類(lèi)物質(zhì)氧化縮合反應(yīng)以及焦糖化反應(yīng)等［5-8］。由于焦糖化反應(yīng)的發(fā)生條件約在150 ℃以上，而本研究中毛酸漿發(fā)酵的溫度較低（小于40 ℃），在此條件下發(fā)生焦糖化反應(yīng)的概率非常小。因此，主要研究前3 種非酶褐變反應(yīng)。
近年來(lái)，通徑分析在生物科學(xué)研究中的應(yīng)用日益增多，可以用來(lái)闡述生物學(xué)科中諸多理論問(wèn)題。通徑分析是建立在通徑系數(shù)概念基礎(chǔ)上的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法［9］。通徑系數(shù)能夠有效地表示相關(guān)變量間的原因?qū)Y(jié)果的直接影響效應(yīng)，能夠估計(jì)出原因因素對(duì)效應(yīng)因素的間接效應(yīng)，從而比較各因素的相對(duì)重要性［10］。本研究通過(guò)檢測(cè)毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中引起非酶褐變的VC、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態(tài)氮等化學(xué)組分的含量變化，采用通徑分析得出各種發(fā)酵條件下引起非酶褐變的主要因素，以及各個(gè)因素之間的相互作用程度，以期為有效控制其褐變提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
毛酸漿，購(gòu)于黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
安琪牌葡萄酒用高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；植物乳酸菌 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；白砂糖黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；沒(méi)食子酸、5-HMF（分析純） 美國(guó)Sigma公司；福林-酚試劑、3，5-二硝基水楊酸（分析純）、草酸（優(yōu)級(jí)純）、硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉、抗壞血酸、三氯乙酸、氫氧化鈉、偏重亞硫酸鉀（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；2，6-二氯酚靛酚（分析純） Alfa Aesar（中國(guó)）化學(xué)有限公司；Pectinex XXL果膠酶 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
HR7633型打漿機(jī) 珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPH-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器公司；Exploter分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；WS113手持糖度儀上海測(cè)維光電技術(shù)有限責(zé)任公司；BCN-1360型超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷諾儀器廠(chǎng)；湘儀L420臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1毛酸漿發(fā)酵工藝流程與操作要點(diǎn)
毛酸漿→挑選→去萼片→清洗→破碎→酶解→調(diào)糖→加SO2→冷卻→接種→發(fā)酵→發(fā)酵液→測(cè)定↓
酵母菌、乳酸菌→活化→擴(kuò)大培養(yǎng)
操作要點(diǎn)：選取成熟度好、粒大飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后熱燙30 s，瀝干后將其破碎，得到毛酸漿果汁原漿；按照1.6 mL/kg的比例加入Pectinex XXL果膠酶到毛酸漿原漿中，于50 ℃水浴酶解2 h［11-12］，用蔗糖調(diào)整糖度至22%，加入80 mg/kg的SO2后，攪動(dòng)30 min。在無(wú)菌操作臺(tái)上按0.2%和1%同時(shí)接入已活化好的酵母菌和乳酸菌，分別置于25、30、37 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。每隔1 d取樣一次，在3 600 r/min離心15 min后，取上清液用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。
1.3.2指標(biāo)測(cè)定方法
多酚含量：采用福林-酚法［13］；VC含量：采用2，6-二氯酚靛酚法［14］；還原糖含量：3，5-二硝基水楊酸法［15］；5-HMF含量：參考Cohen等［16］的測(cè)定方法；褐變度（browning degree，BD）：參考文獻(xiàn)［17］的方法；氨基酸態(tài)氮含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》［18］進(jìn)行測(cè)定。
1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
以VC含量（X1）、5-HMF含量（X2）、多酚含量（X3）、還原糖含量（X4）、氨基酸態(tài)氮含量（X5）為自變量因子，以BD為應(yīng)變量Y，對(duì)引起發(fā)酵液非酶褐變的各因子進(jìn)行通徑分析。得到各因子間的相關(guān)系數(shù)，并求出直接通徑系數(shù)P1、P2、P3、P4、P5和各因子間的間接通徑系數(shù)Pij。直接通徑系數(shù)Pi反映各因素對(duì)毛酸漿發(fā)酵液BD的直接效應(yīng)，間接通徑系數(shù)Pij用來(lái)表示某一因素對(duì)毛酸漿發(fā)酵液在發(fā)酵過(guò)程中BD的影響的間接效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn)［19-20］進(jìn)行處理，運(yùn)用SPSS 20.0軟件，采用Duncan’s極差法對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
表1 毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Physicochemical properties of Physalis pubescens L. during fermentation
2.225 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
表2 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
在25 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，通徑分析見(jiàn)表3。25 ℃發(fā)酵條件下，被研究的5 個(gè)因子對(duì)BD的影響由大到小順序依次是：5-HMF含量（P2=0.841 0）、還原糖含量（P4= -0.787 0）、VC含量（P1=0.337 0）、氨基酸態(tài)氮含量（P5=-0.166 0）和多酚含量（P3=0.146 0）。從表3還可以看出，X2與其余4 個(gè)因素的交互作用十分明顯，而X3和X5與其他成分的交互作用很弱。
表3 通徑分析Table 3 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescens L. fermented at 25 ℃
決定系數(shù)表示各因素對(duì)結(jié)果的相對(duì)決定程度，由相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)計(jì)算決定系數(shù)d。
根據(jù)（1）和（2）計(jì)算，得到的決定系數(shù)d如下：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響25 ℃發(fā)酵條件下褐變度的第一決定因素，d24=1.318 4；5-HMF含量是影響褐變度的第二決定因素，d2=0.707 3；還原糖含量（X4）是影響褐變度的第三決定因素，d4=0.619 3；其余以此類(lèi)推?！芼表示各Xi決定的褐變度增加量（Y）的變異平方和占褐變度的總變異平方和之比率。Pe為剩余通徑系數(shù)，表示未被考慮的一切可能影響Y的因素和試驗(yàn)誤差［21］。本試驗(yàn)中Pe較小，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。
2.330 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
在30 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4，通徑分析見(jiàn)表5。對(duì)30 ℃發(fā)酵條件下的褐變度起首要作用的是氨基酸態(tài)氮含量（X5），其P5= 0.646 0；其次是5-HMF含量（X2）、VC含量（X1）、多酚含量（X3），而還原糖含量（X4）所起的作用最小。
表4 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
表5 通徑分析Table 5 Table of path analysis at 30℃
決定系數(shù)計(jì)算結(jié)果如下（方法同2.2節(jié)式（1）、（2））：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）和氨基酸態(tài)氮含量（X5）的交互作用是影響30 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d25=0.593 8；氨基酸態(tài)氮含量（X5）是影響褐變度的第二決定因素，d5=0.417 3；5-HMF含量（X2）是影響褐變度的第三決定因素，d2= 0.212 6；其余以此類(lèi)推。∑d=0.994 1，Pe= 0.076 6，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。
2.437 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
表6 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
在37 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表6，通徑分析見(jiàn)表7。對(duì)37 ℃發(fā)酵條件下的褐變度起首要作用的是5-HMF含量（X2），其P2= 0.887 0；其次是氨基酸態(tài)氮含量（P5=0.191 0）、還原糖含量（P4=0.041 0）、多酚含量（P3=0.033 0）、VC含量（P1= -0.004 0）。5-HMF含量（X2）與其他因子的交互作用也比較明顯。
表7 通徑分析Table 7 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescceennss LL.. fermented at 377 ℃
決定系數(shù)計(jì)算結(jié)果如下（方法同2.2節(jié)中式（1）、（2））：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）是影響37 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d2=0.786 7；5-HMF含量（X2）和氨基酸態(tài)氮含量（X5）的交互作用是影響褐變度的第二決定因素，d25=0.314 4；5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響褐變度的第三決定因素，d24=-0.069 8；其余以此類(lèi)推?！芼=0.998 5，Pe= 0.038 7，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。因此，在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量（X2）對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，也是決定褐變度的首要因素。
3 討論與結(jié)論
非酶褐變通常是多種反應(yīng)共同作用的結(jié)果，但在不同的產(chǎn)品中，有不同的主導(dǎo)反應(yīng)類(lèi)型。例如，香蕉汁在貯藏過(guò)程中則主要發(fā)生美拉德反應(yīng)［22］；柑橘汁貯藏期間的非酶褐變主要是由VC降解引起［23］；而Damasceno等［24］指出在橙汁等抗壞血酸含量高的果汁中抗壞血酸降解才是引起褐變的主要因素。混濁蘋(píng)果汁在貯藏中發(fā)生的非酶褐變主要是由酚類(lèi)的氧化聚合而引起［25］。美拉德反應(yīng)是一種十分復(fù)雜的羰氨反應(yīng)，即羰基化合物（還原糖類(lèi)）與氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）經(jīng)過(guò)一系列重排、脫水、縮合及聚合反應(yīng)生成擬黑素的過(guò)程。主要有3 種反應(yīng)途徑：在酸性條件下經(jīng)1，2-烯醇化反應(yīng)，形成呋喃（furural）及5-HMF；在堿性條件下經(jīng)2，3-烯醇化反應(yīng)形成還原酮及脫氧還原酮；在高溫條件下，經(jīng)Amadori裂解最終生成類(lèi)黑素［26］。VC是果汁中的一種主要營(yíng)養(yǎng)成分，其氧化分解主要有兩種途徑：有氧分解反應(yīng)最終生成還原酮；無(wú)氧分解的主要產(chǎn)物為糠醛［27］。近年來(lái)的研究表明，多酚的化學(xué)性質(zhì)活潑，易氧化成苯醌，醌類(lèi)物質(zhì)能自發(fā)與親核物質(zhì)結(jié)合（如酚類(lèi)、巰基化合物及某些胺類(lèi)），反應(yīng)中生成的二聚體或多聚體可能通過(guò)結(jié)構(gòu)重排，產(chǎn)生新的二酚二聚體，而新的二聚體更容易被氧化從而進(jìn)入下一輪的循環(huán)，加快了酚的聚合，結(jié)果是形成褐色多聚體和更多的
本實(shí)驗(yàn)在25、30 ℃和37 ℃發(fā)酵條件下，將毛酸漿的VC含量、5-HMF含量、多酚含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量等成分與褐變度進(jìn)行通徑系數(shù)分析，結(jié)果表明：1）在25 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和還 原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。2）在30 ℃發(fā)酵條件下，氨基酸態(tài)氮含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和氨基酸態(tài)氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。3）在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，也是決定褐變度的首要因素。從整個(gè)發(fā)酵期看，在不同發(fā)酵溫度下，5-HMF都大量積累，氨基酸和還原糖參與整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，從而說(shuō)明毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的非酶褐變主要由美拉德反應(yīng)在酸性途徑下產(chǎn)生。綜上所述，美拉德反應(yīng)是毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。
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Analysis of Mechanism of Non-Enzymatic Browning of Physalis pubescens L. during Fermentation
ZHU Dan1，2， LI Shiyan3， REN Yueying1，*， NIU Guangcai3， WEI Wenyi3， WANG Ying3
（1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China；3. College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）
The mixed culture fermentation of the fruit juice of Physalis pubescens L. with yeast and lactic acid bacteria was carried out at 25， 30 and 37 ℃， respectively. Changes in the contents of vitamin C， total phenols， 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF）， reducing sugar and amino acid nitrogen， associated with non-enzymatic browning occurring during the fermentation process， were examined in order to explore the mechanism of non-enzymatic browning through path coefficient analysis. The results indicated that the change of browning degree （BD） was closely related to 5-HMF， reducing sugar，and amino acid nitrogen in the fruit juice of Physalis pubescens L. fermented at three temperatures. In addition， 5-HMF had the strongest direct impact on BD， while interaction between 5-HMF and reducing sugar was the chief determinant of non-enzymatic browning during fermentation at 25 ℃. When fermentation was done at 30 ℃， amino acid nitrogen had the strongest direct impact on BD and the major cause of non-enzymatic browning was interaction between 5-HMF and amino acid nitrogen. During fermentation at 37 ℃， the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. was mainly caused by 5-HMF as the principal determinant of BD. Therefore， Maillard reaction is the major cause of the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during the fermentation process.
Physalis pubescens L.； fermentation； non-enzymatic browning； path coefficient analysis
10.7506/spkx1002-6630-201615034
TS255.3
A
1002-6630（2016）15-0204-05
2016-01-19
朱丹（1972—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参?。E-mail：623016878@qq.com
任躍英（1958—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参?。E-mail：381717169@qq.com
引文格式：
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朱 丹，李世燕，任躍英*，牛廣財(cái)，魏文毅，王 贏(yíng)
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）
毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的非酶褐變?cè)蚪馕?/p>
朱 丹1，2，李世燕3，任躍英1，*，牛廣財(cái)3，魏文毅3，王 贏(yíng)3
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）
以毛酸漿為原料，同時(shí)接入酵母菌和乳酸菌，在25、30 ℃和37 ℃條件下對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵。以褐變度（browning degree，BD）為指標(biāo)，檢測(cè)其在發(fā)酵過(guò)程中引起非酶褐變的抗壞血酸（VC）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態(tài)氮等化學(xué)組分的變化。采用通徑系數(shù)分析方法，解析毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。結(jié)果表明，在25、30 ℃和37 ℃等不同發(fā)酵條件下，毛酸漿發(fā)酵液中5-HMF含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量等變化與褐變度的變化密切相關(guān)。在25 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和還原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在30 ℃發(fā)酵條件下，氨基酸態(tài)氮含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和氨基酸態(tài)氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，同時(shí)，也是決定褐變度的首要因素。美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。
毛酸漿；發(fā)酵；非酶褐變；通徑分析
朱丹， 李世燕， 任躍英， 等. 毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的非酶褐變?cè)蚪馕觯跩］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 204-208. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn
ZHU Dan， LI Shiyan， REN Yueying， et al. Analysis of mechanism of non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during fermentation［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 204-208. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn
毛酸漿（Physalis pubescens L.）別名洋菇娘、黃菇娘等，為茄科酸漿屬多年生草本植物［1］。毛酸漿是一種藥食兩用植物，具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預(yù)防動(dòng)脈硬化和心血管疾病的發(fā)生和保護(hù)皮膚等作用［2-4］。利用微生物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，是毛酸漿的一種較常見(jiàn)的深加工方式。但是，在其發(fā)酵過(guò)程中，非酶褐變現(xiàn)象非常嚴(yán)重，產(chǎn)品顏色發(fā)生改變，降低了毛酸漿發(fā)酵產(chǎn)品的商品價(jià)值。目前普遍認(rèn)為導(dǎo)致非酶褐變（non-enzymatic browning）的主要原因有：美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）、抗壞血酸（VC）氧化分解、多酚類(lèi)物質(zhì)氧化縮合反應(yīng)以及焦糖化反應(yīng)等［5-8］。由于焦糖化反應(yīng)的發(fā)生條件約在150 ℃以上，而本研究中毛酸漿發(fā)酵的溫度較低（小于40 ℃），在此條件下發(fā)生焦糖化反應(yīng)的概率非常小。因此，主要研究前3 種非酶褐變反應(yīng)。
近年來(lái)，通徑分析在生物科學(xué)研究中的應(yīng)用日益增多，可以用來(lái)闡述生物學(xué)科中諸多理論問(wèn)題。通徑分析是建立在通徑系數(shù)概念基礎(chǔ)上的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法［9］。通徑系數(shù)能夠有效地表示相關(guān)變量間的原因?qū)Y(jié)果的直接影響效應(yīng)，能夠估計(jì)出原因因素對(duì)效應(yīng)因素的間接效應(yīng)，從而比較各因素的相對(duì)重要性［10］。本研究通過(guò)檢測(cè)毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中引起非酶褐變的VC、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態(tài)氮等化學(xué)組分的含量變化，采用通徑分析得出各種發(fā)酵條件下引起非酶褐變的主要因素，以及各個(gè)因素之間的相互作用程度，以期為有效控制其褐變提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
毛酸漿，購(gòu)于黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
安琪牌葡萄酒用高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；植物乳酸菌 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；白砂糖黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；沒(méi)食子酸、5-HMF（分析純） 美國(guó)Sigma公司；福林-酚試劑、3，5-二硝基水楊酸（分析純）、草酸（優(yōu)級(jí)純）、硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉、抗壞血酸、三氯乙酸、氫氧化鈉、偏重亞硫酸鉀（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；2，6-二氯酚靛酚（分析純） Alfa Aesar（中國(guó)）化學(xué)有限公司；Pectinex XXL果膠酶 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
HR7633型打漿機(jī) 珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPH-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器公司；Exploter分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；WS113手持糖度儀上海測(cè)維光電技術(shù)有限責(zé)任公司；BCN-1360型超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷諾儀器廠(chǎng)；湘儀L420臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1毛酸漿發(fā)酵工藝流程與操作要點(diǎn)
毛酸漿→挑選→去萼片→清洗→破碎→酶解→調(diào)糖→加SO2→冷卻→接種→發(fā)酵→發(fā)酵液→測(cè)定↓
酵母菌、乳酸菌→活化→擴(kuò)大培養(yǎng)
操作要點(diǎn)：選取成熟度好、粒大飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后熱燙30 s，瀝干后將其破碎，得到毛酸漿果汁原漿；按照1.6 mL/kg的比例加入Pectinex XXL果膠酶到毛酸漿原漿中，于50 ℃水浴酶解2 h［11-12］，用蔗糖調(diào)整糖度至22%，加入80 mg/kg的SO2后，攪動(dòng)30 min。在無(wú)菌操作臺(tái)上按0.2%和1%同時(shí)接入已活化好的酵母菌和乳酸菌，分別置于25、30、37 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。每隔1 d取樣一次，在3 600 r/min離心15 min后，取上清液用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。
1.3.2指標(biāo)測(cè)定方法
多酚含量：采用福林-酚法［13］；VC含量：采用2，6-二氯酚靛酚法［14］；還原糖含量：3，5-二硝基水楊酸法［15］；5-HMF含量：參考Cohen等［16］的測(cè)定方法；褐變度（browning degree，BD）：參考文獻(xiàn)［17］的方法；氨基酸態(tài)氮含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》［18］進(jìn)行測(cè)定。
1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
以VC含量（X1）、5-HMF含量（X2）、多酚含量（X3）、還原糖含量（X4）、氨基酸態(tài)氮含量（X5）為自變量因子，以BD為應(yīng)變量Y，對(duì)引起發(fā)酵液非酶褐變的各因子進(jìn)行通徑分析。得到各因子間的相關(guān)系數(shù)，并求出直接通徑系數(shù)P1、P2、P3、P4、P5和各因子間的間接通徑系數(shù)Pij。直接通徑系數(shù)Pi反映各因素對(duì)毛酸漿發(fā)酵液BD的直接效應(yīng)，間接通徑系數(shù)Pij用來(lái)表示某一因素對(duì)毛酸漿發(fā)酵液在發(fā)酵過(guò)程中BD的影響的間接效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn)［19-20］進(jìn)行處理，運(yùn)用SPSS 20.0軟件，采用Duncan’s極差法對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果
表1 毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中的各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Physicochemical properties of Physalis pubescens L. during fermentation
2.225 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
表2 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
在25 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，通徑分析見(jiàn)表3。25 ℃發(fā)酵條件下，被研究的5 個(gè)因子對(duì)BD的影響由大到小順序依次是：5-HMF含量（P2=0.841 0）、還原糖含量（P4= -0.787 0）、VC含量（P1=0.337 0）、氨基酸態(tài)氮含量（P5=-0.166 0）和多酚含量（P3=0.146 0）。從表3還可以看出，X2與其余4 個(gè)因素的交互作用十分明顯，而X3和X5與其他成分的交互作用很弱。
表3 通徑分析Table 3 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescens L. fermented at 25 ℃
決定系數(shù)表示各因素對(duì)結(jié)果的相對(duì)決定程度，由相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)計(jì)算決定系數(shù)d。
根據(jù)（1）和（2）計(jì)算，得到的決定系數(shù)d如下：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響25 ℃發(fā)酵條件下褐變度的第一決定因素，d24=1.318 4；5-HMF含量是影響褐變度的第二決定因素，d2=0.707 3；還原糖含量（X4）是影響褐變度的第三決定因素，d4=0.619 3；其余以此類(lèi)推?！芼表示各Xi決定的褐變度增加量（Y）的變異平方和占褐變度的總變異平方和之比率。Pe為剩余通徑系數(shù)，表示未被考慮的一切可能影響Y的因素和試驗(yàn)誤差［21］。本試驗(yàn)中Pe較小，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。
2.330 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
在30 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4，通徑分析見(jiàn)表5。對(duì)30 ℃發(fā)酵條件下的褐變度起首要作用的是氨基酸態(tài)氮含量（X5），其P5= 0.646 0；其次是5-HMF含量（X2）、VC含量（X1）、多酚含量（X3），而還原糖含量（X4）所起的作用最小。
表4 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
表5 通徑分析Table 5 Table of path analysis at 30℃
決定系數(shù)計(jì)算結(jié)果如下（方法同2.2節(jié)式（1）、（2））：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）和氨基酸態(tài)氮含量（X5）的交互作用是影響30 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d25=0.593 8；氨基酸態(tài)氮含量（X5）是影響褐變度的第二決定因素，d5=0.417 3；5-HMF含量（X2）是影響褐變度的第三決定因素，d2= 0.212 6；其余以此類(lèi)推。∑d=0.994 1，Pe= 0.076 6，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。
2.437 ℃發(fā)酵條件下非酶褐變通徑分析
表6 各因子間相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens
在37 ℃發(fā)酵條件下，非酶褐變因子X(jué)1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表6，通徑分析見(jiàn)表7。對(duì)37 ℃發(fā)酵條件下的褐變度起首要作用的是5-HMF含量（X2），其P2= 0.887 0；其次是氨基酸態(tài)氮含量（P5=0.191 0）、還原糖含量（P4=0.041 0）、多酚含量（P3=0.033 0）、VC含量（P1= -0.004 0）。5-HMF含量（X2）與其他因子的交互作用也比較明顯。
表7 通徑分析Table 7 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescceennss LL.. fermented at 377 ℃
決定系數(shù)計(jì)算結(jié)果如下（方法同2.2節(jié)中式（1）、（2））：
由決定系數(shù)可知，5-HMF含量（X2）是影響37 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d2=0.786 7；5-HMF含量（X2）和氨基酸態(tài)氮含量（X5）的交互作用是影響褐變度的第二決定因素，d25=0.314 4；5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響褐變度的第三決定因素，d24=-0.069 8；其余以此類(lèi)推?！芼=0.998 5，Pe= 0.038 7，說(shuō)明已考慮了影響毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要因素。因此，在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量（X2）對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，也是決定褐變度的首要因素。
3 討論與結(jié)論
非酶褐變通常是多種反應(yīng)共同作用的結(jié)果，但在不同的產(chǎn)品中，有不同的主導(dǎo)反應(yīng)類(lèi)型。例如，香蕉汁在貯藏過(guò)程中則主要發(fā)生美拉德反應(yīng)［22］；柑橘汁貯藏期間的非酶褐變主要是由VC降解引起［23］；而Damasceno等［24］指出在橙汁等抗壞血酸含量高的果汁中抗壞血酸降解才是引起褐變的主要因素。混濁蘋(píng)果汁在貯藏中發(fā)生的非酶褐變主要是由酚類(lèi)的氧化聚合而引起［25］。美拉德反應(yīng)是一種十分復(fù)雜的羰氨反應(yīng)，即羰基化合物（還原糖類(lèi)）與氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）經(jīng)過(guò)一系列重排、脫水、縮合及聚合反應(yīng)生成擬黑素的過(guò)程。主要有3 種反應(yīng)途徑：在酸性條件下經(jīng)1，2-烯醇化反應(yīng)，形成呋喃（furural）及5-HMF；在堿性條件下經(jīng)2，3-烯醇化反應(yīng)形成還原酮及脫氧還原酮；在高溫條件下，經(jīng)Amadori裂解最終生成類(lèi)黑素［26］。VC是果汁中的一種主要營(yíng)養(yǎng)成分，其氧化分解主要有兩種途徑：有氧分解反應(yīng)最終生成還原酮；無(wú)氧分解的主要產(chǎn)物為糠醛［27］。近年來(lái)的研究表明，多酚的化學(xué)性質(zhì)活潑，易氧化成苯醌，醌類(lèi)物質(zhì)能自發(fā)與親核物質(zhì)結(jié)合（如酚類(lèi)、巰基化合物及某些胺類(lèi)），反應(yīng)中生成的二聚體或多聚體可能通過(guò)結(jié)構(gòu)重排，產(chǎn)生新的二酚二聚體，而新的二聚體更容易被氧化從而進(jìn)入下一輪的循環(huán)，加快了酚的聚合，結(jié)果是形成褐色多聚體和更多的
本實(shí)驗(yàn)在25、30 ℃和37 ℃發(fā)酵條件下，將毛酸漿的VC含量、5-HMF含量、多酚含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量等成分與褐變度進(jìn)行通徑系數(shù)分析，結(jié)果表明：1）在25 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和還 原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。2）在30 ℃發(fā)酵條件下，氨基酸態(tài)氮含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，5-HMF含量和氨基酸態(tài)氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。3）在37 ℃發(fā)酵條件下，5-HMF含量對(duì)褐變度起到的直接作用最強(qiáng)，也是決定褐變度的首要因素。從整個(gè)發(fā)酵期看，在不同發(fā)酵溫度下，5-HMF都大量積累，氨基酸和還原糖參與整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，從而說(shuō)明毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的非酶褐變主要由美拉德反應(yīng)在酸性途徑下產(chǎn)生。綜上所述，美拉德反應(yīng)是毛酸漿發(fā)酵過(guò)程中非酶褐變的主要原因。
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Analysis of Mechanism of Non-Enzymatic Browning of Physalis pubescens L. during Fermentation
ZHU Dan1，2， LI Shiyan3， REN Yueying1，*， NIU Guangcai3， WEI Wenyi3， WANG Ying3
（1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China；3. College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）
The mixed culture fermentation of the fruit juice of Physalis pubescens L. with yeast and lactic acid bacteria was carried out at 25， 30 and 37 ℃， respectively. Changes in the contents of vitamin C， total phenols， 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF）， reducing sugar and amino acid nitrogen， associated with non-enzymatic browning occurring during the fermentation process， were examined in order to explore the mechanism of non-enzymatic browning through path coefficient analysis. The results indicated that the change of browning degree （BD） was closely related to 5-HMF， reducing sugar，and amino acid nitrogen in the fruit juice of Physalis pubescens L. fermented at three temperatures. In addition， 5-HMF had the strongest direct impact on BD， while interaction between 5-HMF and reducing sugar was the chief determinant of non-enzymatic browning during fermentation at 25 ℃. When fermentation was done at 30 ℃， amino acid nitrogen had the strongest direct impact on BD and the major cause of non-enzymatic browning was interaction between 5-HMF and amino acid nitrogen. During fermentation at 37 ℃， the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. was mainly caused by 5-HMF as the principal determinant of BD. Therefore， Maillard reaction is the major cause of the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during the fermentation process.
Physalis pubescens L.； fermentation； non-enzymatic browning； path coefficient analysis
10.7506/spkx1002-6630-201615034
TS255.3
A
1002-6630（2016）15-0204-05
2016-01-19
朱丹（1972—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参?。E-mail：623016878@qq.com
任躍英（1958—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参?。E-mail：381717169@qq.com
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