孫玉英，張繼泉，王淑軍，嚴(yán)翠

（1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005；2.中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071）

蠟狀芽孢桿菌幾丁質(zhì)脫乙?；缚寺『捅磉_(dá)

孫玉英1，2，張繼泉2，王淑軍1，嚴(yán)翠1

（1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港222005；2.中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071）

從產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus M1）中獲得了幾丁質(zhì)脫乙?；窧cCDA基因序列，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了其高效分泌表達(dá)以及一步親和法純化重組幾丁質(zhì)脫乙酰基酶BcCDA，經(jīng)SDS-PAGE檢測該酶為單一條帶，其分子量約為23 kD，所得重組BcCDA的具有脫乙?；富钚?，其比活力為11 608.31 U/mg。該研究為BcCDA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究和BcCDA的利用鑒定基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)脫乙?；?；蠟狀芽孢桿菌；分泌表達(dá)；純化

幾丁質(zhì)（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的多聚體，是天然多糖中十分重要的一類，其數(shù)量僅次于世界上資源最豐富的纖維素，但其利用價值比纖維素更高，是自然界中數(shù)量第二多的的含氮類有機(jī)化合物，被歐美學(xué)術(shù)界稱為世界第六生命要素。很多類似于蝦蟹等節(jié)肢動物的外殼里都存在幾丁質(zhì)；像昆蟲、動物體表及消化道里也含有豐富的幾丁質(zhì)。

據(jù)估計，自然界中的幾丁質(zhì)的生物合成量超過1 000億t，而人類每年所需幾丁質(zhì)的量也高達(dá)3.7× 104t，主要是海洋動物產(chǎn)品加工的廢棄物。另外，海洋中產(chǎn)生的大量廢棄物中，幾丁質(zhì)將近一億t，而且海洋生物圈中產(chǎn)生的幾丁質(zhì)占全球幾丁質(zhì)總量的絕大部分，可以說是一種取之不盡的生物寶庫。

而殼聚糖（脫乙酰甲殼素，chitosan）是幾丁質(zhì)的一類最重要的衍生物，也是自然存在的唯一一種堿性低聚多糖，可以應(yīng)用于食品、化妝品、紡織、醫(yī)療、印染、保健、廢水處理等許多領(lǐng)域，其利用價值很高，是市場推廣和產(chǎn)品研發(fā)的有力組成部分。

目前工業(yè)上生產(chǎn)殼聚糖普便采用強(qiáng)堿熱化學(xué)法，該方法生產(chǎn)殼聚糖存在較多的缺陷和不足，主要包括以下幾方面：生產(chǎn)過程耗能大、消耗大量強(qiáng)堿，嚴(yán)重污染環(huán)境，不能獲得質(zhì)量均一、具有特定脫乙酰度的殼聚糖等。幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）能夠催化幾丁質(zhì)生成殼聚糖，具有工藝條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)。采用幾丁質(zhì)脫乙酰酶生產(chǎn)殼聚糖則可以解決強(qiáng)堿熱化學(xué)法制備殼寡糖的諸多缺陷和不足，生產(chǎn)出質(zhì)量均一、性能穩(wěn)定的殼聚糖，滿足生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)ぞ厶堑母哔|(zhì)量要求。目前發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生CDA的微生物多數(shù)為真菌，從真菌中分離得到的CDA主要為糖蛋白，分子量大多為75 kD～150 kD［1-8］。Srinivasan等［9］從城市污水中分離到1株產(chǎn)堿桿菌屬的細(xì)菌Alcaligenes sp.ATCC55938，其可以分泌CDA胞外酶，在大規(guī)模發(fā)酵體系中比真菌容易培養(yǎng)，生長較快而且不需提取純化CDA，只需與甲殼素共同培養(yǎng)即可生產(chǎn)出殼聚糖，這是關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)生CDA的首次報道。此后產(chǎn)CDA的細(xì)菌陸續(xù)被報道，有芽孢桿菌［10］、副溶血弧菌［11］、炭疽菌［12］、菜豆炭疽菌［13-16］和紅平紅球菌［17］等。細(xì)菌相對于真菌，發(fā)酵時間短，基因結(jié)構(gòu)簡單容易被改造。

但是目前酶法生產(chǎn)殼聚糖仍然存在缺少產(chǎn)高活性CDA的菌株的問題。因?yàn)楫a(chǎn)CDA菌株的篩選和誘變工作還進(jìn)行的較少，較少能夠篩選出高產(chǎn)率的CDA產(chǎn)生菌，而且篩選出的菌株也存在產(chǎn)酶性質(zhì)不穩(wěn)定，專一性高，酶活力低等問題。利用基因工程菌異源表達(dá)CDA是提高產(chǎn)酶能力的重要手段。作者在前期研究中，從自然界篩選到一株幾丁質(zhì)脫乙?；父弋a(chǎn)菌株，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus M1），通過生物信息學(xué)分析并設(shè)計一對蠟狀芽孢桿菌幾丁質(zhì)脫乙?；父叨缺Ｊ氐囊飳Γ@得了一種幾丁質(zhì)脫乙?；福˙cCDA）基因序列，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了其高效分泌表達(dá)以及一步法純化重組幾丁質(zhì)脫乙?；窧cCDA。所得重組BcCDA的具幾丁質(zhì)脫乙?；富钚?，該研究為BcCDA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究和BcCDA的利用鑒定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus M1）由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院海洋微生物與酶工程課題組從自然界中分離并保存。

1.2方法

1.2.1基因克隆

以NCBI中提供的13個B.cereus全基因組序列中注釋為幾丁質(zhì)脫乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）的序列信息設(shè)計引物（BcCDA-dF/BcCDA-dR）用于擴(kuò)增B.cereus M1的幾丁質(zhì)脫乙?；富颍˙cCDA）。引物具體為：

BcCDA-dF：ATGTTTTTCTTTTTTATTACGAG

BcCDA-dR：TTATTGAACATCTTTACTTTTCG

提取B.cereus M1的DNA，作為模板。

PCR的反應(yīng)體系為：模板1 μL；5 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTP（10 mmol/L），2 μL引物BcCDA-dF（10 μmol/L），2 μL引物BcCDA-dR（10 μmol/L），1 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O補(bǔ)至體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，將PCR產(chǎn)物切膠，利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收PCR產(chǎn)物連接pMD 19-T載體（按照使用說明書進(jìn)行），16℃連接30 min。將連接產(chǎn)物（pMD 19-BcCDA）轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37℃培養(yǎng)過夜，以M13-F/M13-R為引物對，利用PCR方法對LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測，將PCR檢測陽性克隆搖菌后進(jìn)行DNA測序。

1.2.2重組表達(dá)載體pCT7-CHISP6H-BcCDA的構(gòu)建

結(jié)合分泌表達(dá)載體pCT7-CHISP6H［18］和In-fusionRHD Clontech kit使用說明書，設(shè)計引物擴(kuò)增其含有Polysacc_deac_1功能域部分的序列（對應(yīng)氨基酸序列為51-254），引物序列如下：

pCT7-CHISP6H-BcCDAF：CATCACCATCACCA C AAAGGCGACACCTCTAAAAAACA（下劃線部分序列為與線性化載體pCT7-CHISP6H匹配的15 bp序列）。

pCT7-CHISP6H-BcCDAR：AAGCTTCGAATTCAC TTATTGAACATCTTTACTTTTCG（下劃線部分序列為與線性化載體pCT7-CHISP6H匹配的15 bp序列）。

以 pCT7-CHISP6H-BcCDAF/pCT7-CHISP6HBcCDAR為引物對，測序質(zhì)粒pMD19-BcCDA為模板（100 ng/μL），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如下：

PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳后進(jìn)行產(chǎn)物回收，利用NanoDrop測定回收片段濃度。

利用PmaC I對質(zhì)粒pCT7-CHISP6H進(jìn)行酶切，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物，回收酶切片段，測定回收片段濃度。

根據(jù)In-fusionRHD Clontech kit使用說明，將回收的PCR產(chǎn)物和PmaC I酶切的pCT7-CHISP6H線性化質(zhì)粒進(jìn)行反應(yīng)，具體反應(yīng)體系與反應(yīng)條件為：回收的PCR產(chǎn)物1 μL，回收的單酶切載體2 μL，5×In-fusionRHD 2 μL，無菌水5 μL，混勻后，在50℃反應(yīng)15 min后立即置于冰上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37℃培養(yǎng)過夜，以T7-F/T7-ter為引物對，利用PCR方法對LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測，將PCR檢測陽性克隆經(jīng)搖菌后進(jìn)行DNA測序，由此篩選到構(gòu)建的重組載體，命名為pCT7-CHISP6H-BcCDA。

1.2.3幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性測定及蛋白質(zhì)濃度測定

測定酶活的原理為：以對硝基乙酰苯胺為底物，CDA可脫除對硝基乙酰苯胺的乙酰基生成對硝基苯胺，對硝基苯胺在400 nm處有最大吸收峰。通過測定產(chǎn)物溶液在400 nm處的吸光值，來反映BcCDA的酶活值。具體測定方法為：10 mL具塞試管中加入1 mL 200 mg/L的對硝基乙酰苯胺溶液、3 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液，50℃水浴3 min，加入1 mL酶液，50℃水浴15 min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，加水定容至10 mL，若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，在3 000 r/min條件下離心10 min，在400 nm處測定吸光值?？瞻讓φ战M添加1 mL滅活酶液，其余同上。在該反應(yīng)條件下每小時產(chǎn)生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）［19］。

采用Bradford法測定蛋白質(zhì)的含量［20］。

1.2.4重組BcCDA的誘導(dǎo)表達(dá)

抽提pCT7-CHISP6H-BcCDA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）中，37℃條件下，在含有100 μg/mL氨芐青霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中搖菌，待菌體濃度達(dá)到OD600為0.6左右，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)6 h。4℃，10 000 g離心10 min后，取上清液檢測重組幾BcCDA的活性。

1.2.5重組BcCDA的分離純化及SDS-PAGE分析

重組工程菌經(jīng)活性檢測具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚院?，進(jìn)行放大試驗(yàn)，放大至400 mL體積。發(fā)酵液離心后，上清液直接利用His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱His－TrapTMFF Crude（5 mL）進(jìn)行親和層析法純化。具體步驟如下：

HisTrapTMFF Crude（5 mL）柱經(jīng)10倍柱體積的超純水沖洗后，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液（50 mmol/L pH7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）平衡；發(fā)酵液中分別添加5 mol/L咪唑母液、5 mol/L NaCl母液以及0.5 mol/L pH7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液至發(fā)酵液中各組分濃度與結(jié)合緩沖液中一致，混勻，4℃，10000g離心10min，取上清液上HisTrapTMFFCrude柱，流速控制在3mL/min；上樣結(jié)束后，利用結(jié)合緩沖液沖洗10倍柱體積；利用洗脫液（50 mmol/L pH7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫。經(jīng)檢測酶活力，親和層析純化的含有重組BcCDA目的蛋白的組分，利用HiPrep 26/10脫鹽柱在AKTA avant 25上進(jìn)行脫鹽，并利用12%的SDS-PAGE分析純化重組蛋白的純度。

2　結(jié)果與分析

2.1蠟狀芽孢桿菌幾丁質(zhì)脫乙?；富虻目寺?/p>

利用引物（BcCDA-dF/BcCDA-dR）成功從B. cereus M1中克隆到一個幾丁質(zhì)脫乙?；富颍˙c－CDA）全長序列，其序列及編碼氨基酸序列如圖1所示。序列全長765 bp，編碼254個氨基酸，其理論等電點(diǎn)pI為9.46，預(yù)測分子量為28 552.69 Da。

圖1　蠟狀芽孢桿菌BcCDA基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1　BcCDA nucleotide sequence and deduced amino acid

利用Signalp4.1信號肽預(yù)測軟件［21］分析，結(jié)果顯示該序列沒有信號肽。經(jīng)在線分析（http：//smart.emblheidelberg.de/）蠟狀芽孢桿菌BcCDA基因推導(dǎo)的氨基酸序列特征，發(fā)現(xiàn)位置為51-176的氨基酸序列注釋為Polysacc_deac_1功能域（見圖2），其對應(yīng)的閾值為7e-27。該功能域廣泛存在于各類多糖脫乙?；钢校渲袔锥」烟敲撘阴；福╟hitooligosaccharide deacetylase）中也存在該功能域。

圖2　蠟狀芽孢桿菌BcCDA氨基酸結(jié)構(gòu)特征Fig.2　Structure charaterization of BcCDA deduced amino acid

2.2BcCDA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用本課題組構(gòu)建的大腸桿菌分泌表達(dá)載體pCT7-CHISP6H［18］成功構(gòu)建了含有BcCDA基因Polysacc_ deac_1功能域的分泌型表達(dá)載體pCT7-CHISP6HBcCDA。pCT7-CHISP6H-BcCDA轉(zhuǎn)化BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)檢測發(fā)酵上清液含有幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的活性，其最大比活力為235.43 U/mg。

2.3重組BcCDA的分離純化及SDS-PAGE純度檢測

重組工程菌經(jīng)活性檢測具有幾丁質(zhì)脫乙?；富钚院螅M(jìn)行放大試驗(yàn)，放大至400 mL體積。發(fā)酵液離心后，上清液直接利用His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱His－TrapTMFF Crude（5 mL）進(jìn)行親和層析法純化，經(jīng)線性洗脫后，獲得了洗脫目的蛋白如圖3所示。經(jīng)檢測酶活力知圖中峰1是BcCDA組分。

圖3　重組蛋白BcCDA經(jīng)親和層析純化色譜圖Fig.3　Affinity chromatogram of recombinant BcCDA during purification process

親和層析純化的含有重組BcCDA組分，利用HiPrep 26/10脫鹽柱在AKTA avant 25上進(jìn)行脫鹽。對分離純化的樣品進(jìn)行12%的SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示通過一步親和層析分離可以得到電泳純的重組幾丁質(zhì)脫乙酰基酶，其分子量大小約為23 kD（見圖4），與預(yù)測的重組蛋白理論分子量為23 529.5 Da相一致。純化后溶液中幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的比活力為11608.31U/mg，經(jīng)親和層析后，其純度提高了49.31倍。

圖4　分離純化的重組幾丁質(zhì)脫乙?；窼DS-PAGE分析結(jié)果Fig.4　SDS-PAGE analysis of purified recombinant BcCDA

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙?；傅南灎钛挎邨U菌（Bacillus cereus M1）中獲得了幾丁質(zhì)脫乙酰基酶Bc－CDA基因序列，并對其序列特征進(jìn)行了細(xì)致分析。利用課題組前期構(gòu)建的高效分泌表達(dá)載體，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了其高效分泌表達(dá)，獲得了具有脫乙酰基活性的重組BcCDA。利用親和層析的方法，獲得了電泳純的重組BcCDA。

目前已經(jīng)有許多利用基因工程手段進(jìn)行CDA體外重組表達(dá)的報道。Tokuyasu等［22］將Colletotrichum lindemuthianum的CDA基因成功克隆到大腸桿菌，并借助于Streptomyces lividans的甲殼素酶信號肽序列，使CDA分泌到胞外，并且酶活力與野生型真菌的CDA相比沒有明顯差別。Kang等［23］將來自Colletotrichum lindemuthianum的CDA基因，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，運(yùn)用酵母的信號肽構(gòu)建組成型重組表達(dá)載體HMB905A，實(shí)現(xiàn)了CDA在畢赤酵母（Pichia pastoris GS115）中的分泌表達(dá)，表達(dá)水平為77.27 U/mg蛋白，表達(dá)的CDA部分被糖基化。Wang等［24］克隆了Aspergillus nidulans的CDA基因，利用pET28a表達(dá)載體構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21，經(jīng)誘導(dǎo)后的酶活力達(dá)到4.17 U/mg，但是該CDA以包涵體的形式表達(dá)，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本研究重組表達(dá)的BcCDA在初始發(fā)酵液中的最高酶活力為235.43 U/mg，經(jīng)親和層析后純度提高了49.31倍，比活力達(dá)到了11 608.31 U/mg，酶的比活力比較目前微生物源CDA經(jīng)基因工程菌表達(dá)后的酶比活力是相當(dāng)高的。

本研究所得分泌性重組BcCDA的具幾丁質(zhì)脫乙?；富钚?，該研究為BcCDA作用機(jī)制的進(jìn)一步研究和BcCDA的利用鑒定基礎(chǔ)。

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Cloning and Recombinant Expression of Chitin Deacetylase from Bacillus cereus

SUN Yu-ying1，2，ZHANG Ji-quan2，WANG Shu-jun1，YAN Cui1
（1.Marine College，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China；2.Key Laboratory of Experimental Marine Biology，Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，Shandong，China）

A gene encoding chitin deacetylase from Bacillus cereus M1（BcCDA）was obtained.BcCDA was recombinant expressed in Escherichia coli at the secretion form and purified by affinity chromotagraphy.The purity of the purified BcCDA was tested by SDS-PAGE，which molecular weight was approximately 23 kD.The recombinant BcCDA had deacetylase activity，which specific activity was 11 608.31 U/mg.The research would provide a basis for studying the action mechnism and harness of BcCDA.

chitindeacetylase；Bacilluscereus；secretoryexpression；purify

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.035

碳谷-江蘇海資院海洋先進(jìn)材料聯(lián)合研究中心項(xiàng)目（TG-201402）；連云港市第五期“521工程”科研項(xiàng)目

孫玉英（1974—），女（漢），副教授，博士，研究方向：微生物酶技術(shù)。

2015-10-04