豬流行性腹瀉病毒繁殖條件的研究

王靚靚，白會新

(1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 大慶 163311；大慶市畜牧技術(shù)推廣站，黑龍江 大慶 163311)

豬流行性腹瀉病毒繁殖條件的研究

王靚靚1，白會新2*

(1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 大慶 163311；大慶市畜牧技術(shù)推廣站，黑龍江 大慶 163311)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病可導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水，并且致死率極高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。實驗為了提高PEDV的繁殖滴度，對PEDV的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化并連續(xù)體外傳代培養(yǎng)，分別從改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)方式三個方面進(jìn)行了PEDV的傳代培養(yǎng)，最終提高了病毒的滴度（TCID50），從而降低了該病毒的致病性。

豬流行性腹瀉病毒；疫苗；培養(yǎng)特性

PEDV是一種有包膜的單鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，該病毒引起的臨床癥狀一般表現(xiàn)為嚴(yán)重的水樣腹瀉，病豬在腹瀉3～4 d后，會因嚴(yán)重脫水而死亡。PEDV經(jīng)口傳染仔豬，在腹瀉的早期階段，它富集在小腸內(nèi)的組織內(nèi)容物中。隨著PEDV在許多國家的暴發(fā)，國內(nèi)外很多學(xué)者始終致力于研究PEDV的培養(yǎng)條件［1］，提高病毒的滴度［2］，為PEDV的疫苗研制提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，由于其復(fù)雜的培養(yǎng)條件，病毒在細(xì)胞中繁殖滴度等問題仍是急需解決的難題之一。為了解決此問題，本實驗通過改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)條件等方面對PEDV HLJBX株進(jìn)行培養(yǎng)，確立了PEDV的最佳培養(yǎng)條件，從而提高了病毒的滴度，為下一步疫苗開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1??毒株、細(xì)胞系和引物

本實驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防與獸醫(yī)學(xué)實驗室進(jìn)行，PEDV HLJBX株由實驗室分離并保存，非洲綠猴傳代腎細(xì)胞（Vero）細(xì)胞系于實驗室保存， PEDV鑒定引物均由實驗室設(shè)計并由博仕生物公司合成。

2??實驗方法

2.1??細(xì)胞庫的建立

將Vero細(xì)胞的復(fù)蘇后，進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞庫性狀穩(wěn)定后進(jìn)行無菌檢測和支原體檢測。

2.2??PEDV的特異性檢測

2.2.1 間接免疫熒光檢測

接種病毒的Vero細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗細(xì)胞標(biāo)本片3次，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫20 min后用PBS漂洗3次，用甘氨酸溶液350μL/孔處理細(xì)胞，室溫10 min，再用PBS漂洗3次，將殘留液棄凈后，加入一抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次后，再加二抗，37 ℃避光孵育60 min，最后用中性甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.2 RT-PCR檢測

取150μL的PEDV放入EP管中，管中加入RA2液500μL，充分顛倒10次，靜置1 min。將PEDV裂解物全部吸入內(nèi)套管中，離心1 min。取出內(nèi)套管，棄掉外套管中的液體，在內(nèi)套管中加入500 μL洗液，離心1 min。重復(fù)一次上面的步驟后，取出內(nèi)套管棄掉外套管中的液體，再將內(nèi)套管放回到外套管中，不加洗液離心1 min。將內(nèi)套管移入新的EP管中，在內(nèi)套管膜的中央加入洗脫液25 μL，室溫靜置1 min后離心1 min，獲得總RNA。之后用PEDV引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)參數(shù)為42 ℃、1 h，72 ℃、15 min，冰上冷卻。

將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物使用上游引物及下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2.2.3 PEDV滴度的測定采用96孔板進(jìn)行測定。首先將細(xì)胞進(jìn)行消化，分裝到96孔板內(nèi)，待細(xì)胞長滿80 %時，棄去DMEM液，用PBS洗3次，將病毒稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，

10-9，10-10，10個稀釋度，每一稀釋度接種5孔細(xì)胞，接種量為100 μL/孔，并設(shè)立一行作為細(xì)胞對照，在接毒后72 h，判定細(xì)胞病變，當(dāng)病變細(xì)胞在80 %以上時，判定為病變細(xì)胞孔，進(jìn)行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech 氏法）。

2.2.4 PEDV滴度的提高

2.2.4.1 不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化，分裝到24孔板中，觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長滿80%時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，將病毒液和無血清的DMEM液混合，同時胰酶終濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/ mL、5 μg/ mL、10 μg/ mL、15 μg/ mL、20 μg/ mL、25 μg/mL、50 μg/ mL、60 μg/ mL和75 μg/ mL，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)共同吸附1 h后加入不含血清的DMEM，同時設(shè)立細(xì)胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行TCID50測定。

2.2.4.2 不同吸附時間對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化，分裝到24孔板中，觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長滿80 %時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)共同吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后加入不含血清的DMEM，同時設(shè)立細(xì)胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行 TCID50測定。

2.2.4.3 不同培養(yǎng)條件對病毒滴度的影響

取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化，分裝到24孔板中，觀察細(xì)胞，待長滿80 %時，棄去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合，接種在Vero細(xì)胞上，在到達(dá)最適吸附時間時，一孔直接加入無血清的DMEM，一孔棄去吸附液后加入無血清的DMEM，并設(shè)立細(xì)胞對照孔，37 ℃培養(yǎng)，72 h收毒，繁殖8代后，均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行 TCID50測定。

3??實驗結(jié)果

3.1??Vero細(xì)胞的培養(yǎng)

待細(xì)胞長滿單層時進(jìn)行傳代，接種密度是1×106/ mL，細(xì)胞狀態(tài)良好。鏡檢可見，長滿單層的細(xì)胞緊貼于細(xì)胞壁，生長致密，呈長梭形，輪廓清晰，折光性強(qiáng)（如圖1A）。將PEDV病毒接種在Vero細(xì)胞上，在30 h時出現(xiàn)明顯的CPE，有部分細(xì)胞腫脹變圓，折光性增強(qiáng)，顆粒物質(zhì)增多（如圖1D），細(xì)胞對照未出現(xiàn)異常（如圖1B）。培養(yǎng)48 h，細(xì)胞間隙變大，有少量細(xì)胞脫落（如圖1E），對照細(xì)胞生長良好，仍然未見異常（如圖1C）。在72 h時，細(xì)胞脫落已達(dá)80 %以上，細(xì)胞間隙變大、皺縮、融合，細(xì)胞單層形成網(wǎng)眼狀，收毒（如圖1F）。

圖1 在不同時間點接種PEDV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生的病變（20X）

3.2??細(xì)胞的純凈檢測結(jié)果

3.2.1 Vero細(xì)胞的細(xì)菌、霉菌檢測結(jié)果

用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）

對Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測，未見細(xì)菌、霉菌污染。

3.2.2 Vero細(xì)胞的支原體檢測結(jié)果

用支原體培養(yǎng)基對Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測，均未見支原體污染。

3.3??PEDV的鑒定結(jié)果

3.3.1 間接免疫熒光檢測結(jié)果

取Vero細(xì)胞培養(yǎng)物接種長滿單層的Vero細(xì)胞48 h后，經(jīng) PEDVN蛋白單克隆抗體間接免疫熒光檢測，在未接種PEDV的Vero細(xì)胞中，未見到任何特異性綠色熒光斑點（圖 2A），而在感染PEDV的Vero細(xì)胞中觀察到大量特異性綠色熒光斑點（圖 2B）。表明PEDV在Vero細(xì)胞中復(fù)制增殖。

圖2 間接免疫熒光檢測 PEDV（20 X）

3.3.2 RT-PCR檢測結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物片段約467 bp，與預(yù)期結(jié)果相一致（見圖3）。

圖3 PEDV的RT-PCR結(jié)果

3.4??PEDV滴度的測定結(jié)果

采用96孔板進(jìn)行測定，在接毒后72 h，判定細(xì)胞病變，當(dāng)病變細(xì)胞在80 %以上時，判定為病變細(xì)胞孔，進(jìn)行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech 氏法）結(jié)果見表1。

其確切稀釋倍數(shù)可按下列公式計算：

將由上式獲得的0.73加在高于50 %死亡的稀釋度的對數(shù)（3）上，因此該病毒的 TCID50應(yīng)是10-3.73/0.1 mL。

3.5??PEDV滴度的提高

3.5.1 不同的胰酶濃度對滴度的影響

設(shè)立了胰酶濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進(jìn)行PEDV的培養(yǎng)，當(dāng)胰酶濃度在50 μg/mL及以上時，PEDV無法進(jìn)行培養(yǎng)。達(dá)到該濃度時可以觀察到細(xì)胞拉網(wǎng)成堆，很難觀察出病變。

表1 TCID50測定結(jié)果

圖4 不同的胰酶濃度對病毒滴度的影響

3.5.2 不同吸附時間對滴度的影響

在培養(yǎng)PEDV毒株時，分別設(shè)立在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后，加入無血清的DMEM溶液，72 h收毒，測定病毒滴度。

圖5 不同吸附時間對病毒滴度的影響

3.5.3 不同培養(yǎng)方式對滴度的影響

培養(yǎng)PEDV時采用2種培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，分別為留吸附液和棄吸附液，之后在加入維持液，72 h收毒，測定病毒滴度。

圖6 不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響

4??討論

近年來，有關(guān)PEDV疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展［3］，疫苗滴度的高低可以直接影響到疫苗接種的效果，因此準(zhǔn)確測定疫苗滴度十分重要。本文通過改變胰酶終濃度、孵育時間和培養(yǎng)方式，來提高病毒的滴度，最終將PEDV的滴度維持在10-6.0/0.1 mL至10-7.0/0.1 mL之間。Hofinann和Wy1er實驗表明，在培養(yǎng)PEDV時，若不加胰酶，那么PEDV感染細(xì)胞的能力會大大減弱，連續(xù)培養(yǎng)幾代后，會使病毒在細(xì)胞上發(fā)生丟失［4］。所以PEDV的繁殖是有賴于胰酶的存在的。但是很多研究學(xué)者在培養(yǎng)PEDV時，對于胰酶的終濃度的選擇都有一定的差別［5-6］。在本實驗中，對PEDV HLJBX毒株進(jìn)行培養(yǎng)時，設(shè)立了胰酶終濃度為1μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進(jìn)行PEDV的培養(yǎng)，結(jié)果表明當(dāng)胰酶濃度在50 μg/mL及以上時，PEDV無法進(jìn)行培養(yǎng)。達(dá)到該濃度時可以觀察到細(xì)胞拉網(wǎng)成堆，很難觀察出病變。在胰酶終濃度1～25 μg/mL之間，都適合PEDV的培養(yǎng)，但是在胰酶終濃度為2.5 μg/mL時，我們測得PEDV的病毒滴度高于其他組的病毒滴度。

本實驗對不同吸附時間對病毒滴度的影響進(jìn)行了研究，分別設(shè)立了0.5 h、1 h、1.5 h和2 h 4個時間點。結(jié)果表明，吸附時間為1.5 h，病毒的滴度最高，到2 h時病毒的滴度反而有所下降，但是下降不明顯。這可能是由于吸附時間過長，導(dǎo)致一些狀態(tài)不好的細(xì)胞貼在了培養(yǎng)瓶底部，因此影響了病毒的滴度。本實驗還研究了不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響，分別采用棄吸附液和留吸附液兩種方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用棄吸附液的培養(yǎng)方式PEDV的病毒滴度明顯比留吸附液的培養(yǎng)方式要高。這可能是由于在吸附液中存在一些感染能力較弱的病毒，當(dāng)棄去吸附液后，感染能力較弱的病毒也隨之棄去，那么感染細(xì)胞能力較強(qiáng)的病毒就會吸附在細(xì)胞上。如果留吸附液，對于感染能力較弱的病毒便會留在吸附液中，繁殖幾代后便失去感染細(xì)胞的能力，從而影響了病毒的滴度。

［1］ 周靚靚，孫心，吳蕾. 豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉疫苗病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014，39（6）：33-35.

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2016-07-17）

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊基金資助項目（2011TD001）

王靚靚（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，獸醫(yī)師，獸醫(yī)碩士，主要從事工作：動物衛(wèi)生監(jiān)督和疫病防控。E-mail：383456366@qq.com 聯(lián)系電話：18345587338

白會新（1986-），男，黑龍江望奎人，畜牧師，博士，研究方向：分子營養(yǎng)學(xué)與免疫學(xué)。E-mail：dqxmjbhx@163.com