艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州金山350002）

〈產(chǎn)業(yè)論壇〉

超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌種及其特性和生產(chǎn)性能*

艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜**

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州金山350002）

菌種退化是食用菌在保藏過程中易出現(xiàn)的一個難題。該研究通過比較分析由超干燥基質(zhì)保藏分離的杏鮑菇菌株P(guān)le-tm與子實體組織分離的菌株P(guān)le-fs的形態(tài)特征、生長速度及酶活，探索超干燥基質(zhì)保藏法的可行性。研究結(jié)果顯示，菌株P(guān)le-tm菌絲生長潔白濃密，生長速度明顯快于菌株P(guān)le-fs，分別為1.08 cm·d-1和0.86 cm·d-1，兩者間具有極顯著差異。酶活測定結(jié)果表明Ple-tm各酶活均高于同期生長的Ple-fs，漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶活分別為205.65 U·L-1、446.55 U·L-1、2.34 U·L-1、40.77 U·L-1和22.93 U·L-1。經(jīng)出菇培養(yǎng)，Ple-tm比Ple-fs具有明顯優(yōu)勢，產(chǎn)量為27.28 g·瓶-1，生物學(xué)效率比Ple-fs高26.3%，Pletm的菌絲生長速度、菌株生長周期、產(chǎn)量均保持原種優(yōu)勢。該實驗表明超干燥基質(zhì)保藏法可有效防止菌種退化，為食用菌菌種保藏方法的探究開辟新思路。

杏鮑菇；菌種退化；原種優(yōu)勢；生物學(xué)效率

食用菌菌種是食用菌生產(chǎn)的重要生產(chǎn)資料[1]，菌種的質(zhì)量直接影響食用菌的栽培結(jié)果，是影響經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素之一[2]。菌種在栽培和保藏過程中，如果營養(yǎng)或培養(yǎng)環(huán)境控制不當，其生長代謝，菌種次生代謝物數(shù)量及質(zhì)量均會受到影響[3]，發(fā)生退化現(xiàn)象。表現(xiàn)為菌種出現(xiàn)菌落生長速度不一致，菌絲體“吃料”速度減慢，出菇期延長，菇潮不明顯，品質(zhì)、產(chǎn)量下降，抗性降低等。此外，菌絲的代謝能力[4]、菌絲對基質(zhì)降解能力，影響菌株生產(chǎn)周期的胞外酶活力[5-6]也會發(fā)生變化。菌種退化原因來自多方面，由遺傳學(xué)、細胞學(xué)及基因突變[7]等因素導(dǎo)致的退化于常規(guī)條件不易改變，但保藏方法、繼代次數(shù)的影響卻可以優(yōu)化和避免。目前常用的保藏方法有低溫定期移植保藏法[3]、冷凍干燥保藏法和液氮超低溫保藏法，3種方法均需要低溫，成本高。其中低溫定期移植保藏法需要每隔4月～6月移植轉(zhuǎn)管1次[7]，易增加繼代次數(shù)，不利于長期保藏。目前盡管不斷有新品種被發(fā)現(xiàn)與研究，但品種的老化或退化現(xiàn)象依然普遍存在。菌種保藏技術(shù)成熟與否關(guān)系到食用菌產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展，因此，對菌種長期保藏技術(shù)的探究具有重要意義。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel），別名剌芹側(cè)耳，屬真菌門（Eumycota）擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）。因其具有杏仁香味和菌肉肥厚如鮑魚的口感[8]，是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍稀食用菌新品種[9]，深受廣大消費者喜愛，已成為當今國內(nèi)市場最具發(fā)展?jié)摿Φ氖秤镁贩N之一[10]。目前，中國、日本、韓國等都已實現(xiàn)杏鮑菇工廠化周年栽培[11]，在我國栽培主要集中于山東、河南、江西、福建、臺灣等地。但杏鮑菇生產(chǎn)過程中易出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象，即專用菌種[9]的退化，因此，對專用菌種保藏技術(shù)的探究尤為重要。

本研究以杏鮑菇為試材，首次采用超干燥基質(zhì)保藏法，通過對超干燥基質(zhì)保藏分離的杏鮑菇菌株P(guān)le-tm與子實體組織分離的菌株P(guān)le-fs的形態(tài)特征、生長速度及酶活比較分析，探索超干燥基質(zhì)保藏法的可行性。該研究將為杏鮑菇菌種保藏提供新方法，并為食用菌菌種保藏提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

Ple-tm為試管超干燥基質(zhì)保藏3年后分離所得的杏鮑菇菌株，首次從子實體分離；Ple-fs為杏鮑菇成熟子實體直接組織分離菌株，二者均為實驗室保藏的同種杏鮑菇菌種。

1.1.2供試培養(yǎng)基

超干燥基質(zhì)培養(yǎng)基：木屑25%、麩皮35%、玉米芯24%、玉米粉5%、米糠10%、石灰1%，含水量30%。

PDA加富培養(yǎng)基（1L）：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、蔗渣1 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、瓊脂20 g·L-1，pH自然。0.11 MPa、121℃高壓滅菌20 min。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

生產(chǎn)培養(yǎng)基：木屑32.5%、玉米芯35%、麩皮15%、玉米粉5%、米糠10%、碳酸鈣1.5%、石灰1%，含水量65%，pH6.5～7.0。

1.2方法

1.2.1超干燥基質(zhì)保藏法

超干燥基質(zhì)保藏法的具體做法：按照超干燥基質(zhì)培養(yǎng)基配方，配制試管保藏基質(zhì)，121℃，180 min滅菌冷卻，每個試管接種1個杏鮑菇菌塊（直徑1 cm），于24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿試管（約2個月），然后轉(zhuǎn)移至室溫避光保藏。

1.2.2菌絲生長速度與生物量測定試驗

固體培養(yǎng)：將菌株P(guān)le-tm、Ple-fs接種于PDA加富培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接2次，24℃恒溫培養(yǎng)10 d，每個菌株做3個重復(fù)，每隔1 d測量菌絲生長直徑、觀察菌絲形態(tài)。

液體培養(yǎng)：將菌株接種至裝有100 mL完全培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶7塊（直徑1 cm），每個菌株做3個重復(fù)，120 r·min-1，24℃搖床培養(yǎng)9 d，測定菌株生物量濕重與干重。

1.2.3粗酶液的提取

從第3天開始，每隔3 d取一次上述液體培養(yǎng)發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.4酶活測定

參照文獻方法[12]，分別測定兩菌株分別于3 d、6 d、9 d的漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

1.2.5出菇試驗

根據(jù)生產(chǎn)培養(yǎng)基配方，以栽培料干重50 g·瓶-1的標準配備，裝入300 mL栽培瓶中，每個菌株設(shè)置14個重復(fù)，按照工廠化栽培流程培養(yǎng)至收獲。

收集子實體，記錄產(chǎn)量，計算生產(chǎn)周期、生物學(xué)效率。生產(chǎn)周期為接種發(fā)菌到采收完畢時間。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS 7．05數(shù)據(jù)處理軟件，采用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株菌絲生長速度及生物量

菌株菌絲生長速度及生物量見表1，菌絲生長形態(tài)特征見圖1。

表1　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇的菌絲生長速度及生物量Tab．1Mycelial growth rate and biomass of Pleurotus eryngii strain from the strain preservation of ultra dry substrate

圖1　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的菌絲形態(tài)特征Fig．1Mycelial morphology characteristics of Pleurotus.eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

由表1可知，菌株P(guān)le-tm生長直徑為8．63 cm，生長速度為1．08 cm·d-1，明顯快于菌株P(guān)le-fs。兩者菌絲生長直徑和速度均達極顯著差異。菌株P(guān)le-tm和Ple-fs菌絲生物量干重分別為1．07 g/100mL和 0．95 g/100mL，相比無明顯差異；菌絲濕重達極顯著差異。

由圖1可知，Ple-tm長勢均勻，菌絲潔白濃密，邊緣整齊，優(yōu)于Ple-fs。兩者菌絲生長速度差異較大，Ple-tm生長速度較快，8 d長滿平皿，而Ple-fs生長較慢，10 d才長滿平皿。由此可知，保藏3年后分離得到的菌株P(guān)le-tm生長活性依然高于Ple-fs，而后者顯現(xiàn)出較為明顯的菌種退化特征。

2.2酶活測定結(jié)果

漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶酶活力比較見圖2。

從圖2可知，2個菌株在不同酶活上都體現(xiàn)出一定差異。Ple-tm的5種主要酶活力最高分別為205．65 U·L-1、446．55 U·L-1、2．34 U·L-1、40．77 U·L-1和22．93 U·L-1，后4種較Ple-fs同期酶活達極顯著差異。

漆酶酶活力：前期（3 d～6 d）菌株P(guān)le-tm漆酶酶活的較高，后期（9 d）Ple-fs菌株漆酶酶活上升，而Ple-tm漆酶酶活下降。推測由于菌株P(guān)le-tm生長速度快于Ple-fs，后者生長滯后，于后期才表現(xiàn)出較高的酶活[4]（圖2A)。錳過氧化物酶活力：呈現(xiàn)與漆酶相似的趨勢（圖2B)。由圖2C可知，2個菌株前期木質(zhì)素酶酶活力都較低，后期才表現(xiàn)出活性，Pletm酶活明顯高于Ple-fs。木聚糖酶活力：Ple-tm、Ple-fs菌株木聚糖酶酶活力都隨時間增加而升高，但菌株P(guān)le-tm木聚糖酶酶活一直顯著高于Ple-fs；后期兩者仍較高但酶活已下降至第6天時的一半(圖2D)?？赡苡捎谂囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)[2]消耗過快導(dǎo)致。纖維素酶活力：在菌絲生長階段（3 d～9 d）菌株P(guān)letm、Ple-fs纖維素酶酶活力都隨時間增加而升高，但菌株P(guān)le-tm纖維素酶酶活一直高于菌株P(guān)le-fs，并在第9天達極顯著差異（圖2E）。

綜上可知，菌株P(guān)le-tm的主要酶活皆優(yōu)于同期Ple-fs菌株，由于酶活力高低程度與食用菌的生長發(fā)育及生物量息息相關(guān)[5]，體現(xiàn)了菌株生長活力和對基質(zhì)的降解能力[6]，因此該結(jié)果間接表明Ple-tm菌株具有更強的生長代謝能力。

表2　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的出菇結(jié)果Tab．2Mushroom cultivation results of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

2.3出菇試驗結(jié)果

菌株P(guān)le-tm、Ple-fs出菇結(jié)果見表2，在栽培料干重相同、培養(yǎng)條件一致的條件下，對比2個菌株菌絲滿袋、原基形成、出菇時間、出菇產(chǎn)量、生物學(xué)效率。2個菌株不同時期對照見圖3。

由表2可見，菌株P(guān)le-tm在栽培過程中顯著地表現(xiàn)出原種優(yōu)勢，在菌絲出現(xiàn)、滿袋、原基形成、子實體成熟時間、菌絲長勢及菇的質(zhì)量等方面遠遠超過菌株P(guān)le-fs，菌絲滿袋只用了17 d，出菇45 d，生物學(xué)效率為54．56%，而Ple-fs菌株長勢弱，出菇時間延長，品質(zhì)下降，菌種退化嚴重。

圖2　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇菌株的5種酶活力Fig．25 kinds of enzyme activity of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

圖3　超干燥基質(zhì)保藏杏鮑菇的菌株栽培對照Fig．3Mushroom cultivation comparison of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

3　討論

菌種是國家重要的生物資源，是生產(chǎn)、教學(xué)和科學(xué)研究的基本材料。菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡可能少發(fā)生變異[13]。從1980年至今，世界各國都非常重視菌種的保藏工作，并作了大量研究[14]。本研究在前人的基礎(chǔ)上優(yōu)化配方，探索出超干燥基質(zhì)保藏法，該法在文獻中并無報道，也未應(yīng)用于其他菌種。

研究表明，超干燥基質(zhì)保藏法保藏3年后的菌株長勢、主要酶活及菌株生長周期均保持原種活性，與常規(guī)保種方法比較顯現(xiàn)絕對優(yōu)勢。探究機理，筆者認為可以從以下三個方面考慮：超干燥條件下水分含量極少，不能滿足菌絲的進一步生長，使其生長停滯，保持于原有水平，且干燥環(huán)境不利于雜菌生長及營養(yǎng)物質(zhì)的流失，因此，長期保藏之后菌種活性亦能保持；該方法僅需常溫保藏，菌絲長期生長停滯，但不受低溫刺激，既防止原基的生成，又使其保持于正常環(huán)境溫度內(nèi)；保藏時需避光，亦是防止光照的刺激，理由同上。這與李紅等[7]提出的在保藏過程中光照、溫度刺激也可引起菌種退化的觀點一致，具體機理待進一步研究。

[1]劉新宇，祁玉良，熊在東，等.食用菌菌種退化的遺傳學(xué)分析[J].信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2001（2）：16-18.

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[3]赫朝燦.菌種退化的原因、處理措施及菌種保藏探析[J].生物技術(shù)世界，2015（2）：1.

[4]張淵，王謙，張筱梅，等.白靈側(cè)耳木質(zhì)素酶、纖維素酶高活性菌株的誘變選育[J].河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，

Characteristics and Production Performance of Pleurotus eryngii Strain from Preservation of Ultra Dry Substrate

AI Liu-ying,LV Shu-yi,ZHANG Jie,CHEN Wen-xing,LAI Chun-fen,WANG Hong-tao,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Strain degradation appears easily in the strain preservation of edible fungi.In this study,in order to investigate the feasibility of ultra dry substrate used in strain preservation,the comparative analysis was performed by determining the mycelial morphology,growth speed and enzyme activity of Ple-tm strain isolated from preservation ultra dry substrate and Ple-fs strain isolated from Pleurotus eryngii fruitbody tissue.The results showed that the mycelial growth rate of Ple-tm(1.08 cm·d-1)was faster than that of Ple-fs(0.86 cm·d-1),and the difference was extremely significant.At the same time,the hyphae of Ple-tm were denser,neater and whiter.Moreover,the laccase,manganese peroxidase,lignin peroxidease,xylanase and cellulase activity of Ple-tm reached 205.65 U·L-1,446.55 U·L-1,2.34 U·L-1,40.77 U·L-1and 22.93 U·L-1,respectively.These enzymatic activities were significantly higher than those of Ple-fs during the same growth period.The mushroom cultivation experiments showed that the fruitbody production of Ple-tm strain reached 27.28 g per bottle and the biological efficiency was 26.3%higher than that of Ple-fs strain.Furthermore,Ple-tm strain could maintain the protospecies advantages in terms of mycelial growth rate,growth period and fruitbody production.These results showed that the strain preservation of ultra dry substrate can inhibit the strain degradation effectively,which will develop new strategies on the research of preservation methods of edible fungi.

Pleurotus eryngii;strain degradation;protospecies advantages;biological efficiency

S646.1

A

1003-8310（2016）04-0072-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.018

福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大農(nóng)技推廣服務(wù)體系建設(shè)（KNJ-153011C）；福建省發(fā)改委農(nóng)業(yè)五新工程項目（閩發(fā)改委投資[2012]931號）；福建省政府專項項目（K8114002A）；福建省食用菌產(chǎn)業(yè)重大研發(fā)平臺（2014N2101）；福建省發(fā)改委生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)專項（2011878）。

艾柳英（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為食用真菌學(xué)。E-mail:1178884710@qq.com

**通信作者：孫淑靜（1978-），女，博士，副教授，主要從事食（藥）用菌子實體生長發(fā)育機理、食用菌酶制備、食用菌遺傳育種研究。

E-mail:shjsun2004@126.com

2016-05-18