血瘀質(zhì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死基因多態(tài)性研究

李盛華 周明旺 郭鐵峰 柳海平 葉丙霖 王承祥

摘要：目的 研究非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）高發(fā)體質(zhì)類型血瘀質(zhì)與ApoA1位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)性。方法 選擇93例NONFH患者作為病例組，隨機(jī)選取無血緣關(guān)系健康志愿者83例作為對(duì)照組。對(duì)病例組進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)問卷調(diào)查，將NONFH患者分為血瘀質(zhì)32例、非血瘀質(zhì)61例。受試者取血樣2 mL，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，檢測(cè)PAF-AH G994T、NOS1基因rs9658282位點(diǎn)多態(tài)性，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)AA基因型（OR：2.578；95%CI：1.174-5.663；P=0.018）與A等位基因（OR：1.726；95%CI：1.121-2.658；P=0.013）可能是NONFH發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。結(jié)論 ApoA1基因-75G/A可能與NONFH發(fā)病相關(guān)。ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)基因多態(tài)性與血瘀質(zhì)NONFH發(fā)病無相關(guān)性，ApoA1基因+83C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與血瘀質(zhì)NONFH發(fā)病無相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：非創(chuàng)傷性股骨頭壞死；ApoA1基因-75bp/+83bp位點(diǎn)；中醫(yī)體質(zhì)；血瘀質(zhì)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.005

中圖分類號(hào)：R272.968.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0017-05

Abstract： Objective To study the correlation between nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH） and ApoA1 polymorphism of blood stasis type. Methods Totally 93 cases of NONFH were selected as the case group， and 83 healthy volunteers were randomly selected as the control group. With TCM constitution questionnaire survey， the case group was screened out 32 cases of blood stasis NONFH type and 61 cases of non blood stasis NONFH type. In the case group and control group， the subjects took blood samples 2 mL， extracted DNA for PCR amplification， PCR products for DNA sequencing. G994T PAF-AH and rs9658282 gene NOS1 site polymorphism were detected for tatistical analysis. Results -75G/A gene AA ApoA1 genotype （OR： 2.578； 95%CI： 1.174-5.663； P=0.018） and A allele （OR： 1.726； 95%CI： 1.121-2.658； P=0.013） may be one of the risk factors of NONFH. Conclusion -75G/A gene ApoA1 may be related to the pathogenesis of NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of -75G/A gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of +83C/T gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH.

Key words： nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH）； ApoA1 gene-75bp/+83bp point； TCM constitutions； blood stasis

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，其治療有一定的盲目性和經(jīng)驗(yàn)性。對(duì)其病因分子生物學(xué)機(jī)制及藥物防治早期NONFH的研究是當(dāng)今骨科研究熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥防治NONFH顯示出了一定的優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在中醫(yī)辨證論治的治療原則重視對(duì)個(gè)體體質(zhì)狀態(tài)的辨析，在治療過程中發(fā)揮“因人制宜”的防治思想。本課題組前期研究顯示，血瘀質(zhì)是NONFH的高發(fā)體質(zhì)類型之一。本研究通過檢測(cè)血瘀質(zhì)NONFH患者ApoA1基因多態(tài)性，探討中醫(yī)血瘀體質(zhì)與NONFH的相關(guān)性，為通過體質(zhì)辨別運(yùn)用中醫(yī)藥干預(yù)NONFH提供新的思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

NONFH診斷、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科學(xué)組提出的《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》[1]及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[2]制定。

1.2 中醫(yī)體質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[3]制訂“非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中醫(yī)體質(zhì)類型及相關(guān)基因多態(tài)性研究”調(diào)查表，中醫(yī)體質(zhì)分為平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)9種類型。

1.3 一般資料

應(yīng)用臨床流行病學(xué)方法，于2011年1月-2013年8月在甘肅省中醫(yī)院骨科門診、住院部對(duì)NONFH患者及非血緣關(guān)系健康志愿者進(jìn)行問卷調(diào)查，以NONFH患者作為病例組，無血緣關(guān)系健康志愿者為對(duì)照組。病例組93例，其中血瘀質(zhì)32例，非血瘀質(zhì)61例；對(duì)照組83例，與病例組在居住地分布上基本一致。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），體質(zhì)指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。本研究方法經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論并批準(zhǔn)。受試者均簽訂知情同意書。

1.4 病例調(diào)查與樣本采集

對(duì)調(diào)查者進(jìn)行相關(guān)理論知識(shí)、調(diào)查方法及實(shí)驗(yàn)方法培訓(xùn)。因NONFH分布不集中，故指定專職調(diào)查者進(jìn)行病例的收集，并采取空腹外周血2 mL，置入裝有EDTA抗凝劑的無菌管中，混勻，-80 ℃冰箱保存。

1.5 試驗(yàn)材料

TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），Premix Ex Taq Version2.0，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。引物1（10 ?mol/L）、引物2（10 ?mol/L），TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。QuickCutTM MspI限制性內(nèi)切酶試劑盒，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。滅菌蒸餾水，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院水處理系統(tǒng)，高壓滅菌。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）自血液中提取DNA。

1.6.2 PCR擴(kuò)增 ApoA1基因-75bp/+83bp位點(diǎn)引物序列：上游5'-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACT CTTAAG-3，下游5'-TTAGGGGACACCTAGCCCTCA GGAAGAGCA-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度433 bp。PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 25 ?L，上游引物（10 ?mol/L）2 ?L，下游引物（10 ?mol/L）2 ?L，模板DNA 4 ?L，滅菌三蒸水17 ?L，總體積50 ?L。將上述體系加入0.5 mL Eppendorf離心管后瞬時(shí)離心，防止體系內(nèi)液體附壁。ApoA1基因-75bp/+83bp位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；保存溫度4 ℃。瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。

1.6.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切 ApoA1基因-75bp、+83bp位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在快速酶切反應(yīng)體系中37 ℃溫浴30 min。①ApoA1基因-75bp位點(diǎn)酶切產(chǎn)物檢測(cè)：配制1.5%瓊脂糖凝膠。取5 ?L DL500 DNA Marker加入1.5%瓊脂糖凝膠第一個(gè)樣品槽中；因10×QuickCut Green Buffer中含有電泳時(shí)所必需的色素等試劑，酶切產(chǎn)物可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，取6 ?L酶切產(chǎn)物依次按標(biāo)記序號(hào)直接加樣于瓊脂糖凝膠板其他樣品槽中，電泳槽內(nèi)加入1×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。設(shè)定電壓為125 V，電流保持在80 mA以上進(jìn)行電泳分離。20 min后，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm，DL500 DNA Marker條帶散開可辨時(shí)停止電泳。電泳結(jié)果使用YLNCCAP OF OLP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。ApoA1基因-75bp位點(diǎn)G被A取代，MspI酶切位點(diǎn)丟失，-75bp處由于堿基的變異而形成GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）和AA（179bp片段）3種等位基因型。②ApoA1基因+83bp位點(diǎn)酶切產(chǎn)物檢測(cè)：方法同上。ApoA1基因+83bp處C被T取代后，MspI酶切位點(diǎn)丟失，+83bp處的堿基變異形成CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp片段）、TT（254bp片段）或GG、GA、AA 3種等位基因型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。首先通過χ2檢驗(yàn)分析總體上各基因型及等位基因分布差異（P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），基因型分布符合Hardy- Weinberg遺傳平衡定律，其次通過多項(xiàng)logitic分析找到具有顯著差異（P<0.05）的基因型或等位基因。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)及分型結(jié)果

176例樣品中，MspI酶切共檢測(cè)出6種基因型：GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）、AA（179bp片段）、CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp）、TT（254bp片段）。結(jié)果見圖2。

2.2 ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)多態(tài)性與血瘀質(zhì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的關(guān)系

ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)病例組與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.391，P<0.05；χ2=6.183，P<0.05），病例組AA基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的2.578倍，A等位基因的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.726倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。提示ApoA1基因-75G/A的突變使NONFH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。

將病例組血瘀質(zhì)、非血瘀質(zhì)與對(duì)照組兩兩比較，其中血瘀質(zhì)與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.434，P>0.05；χ2=2.657，P>0.05），非血瘀質(zhì)與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.848，P>0.05；χ2=2.377，P>0.05），血瘀質(zhì)與非血瘀質(zhì)總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.664，P>0.05；χ2=0.100，P>0.05），見表3。提示ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)多態(tài)性與血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH不具有相關(guān)性。

2.3 ApoA1基因+83C/T位點(diǎn)多態(tài)性與血瘀質(zhì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的關(guān)系

ApoA1基因+83C/T位點(diǎn)病例組與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.168，P>0.05；χ2=0.650，P>0.05），見表4。提示ApoA1基因+83C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性與NONFH發(fā)病無相關(guān)性。

將病例組血瘀質(zhì)、非血瘀質(zhì)與對(duì)照組兩兩比較，其中血瘀質(zhì)與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.353，P>0.05；χ2=0.345，P>0.05），非血瘀質(zhì)與對(duì)照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.138，P>0.05；χ2=0.504，P>0.05），血瘀質(zhì)與非血瘀質(zhì)總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.141，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），見表5。提示ApoA1基因+83C/T位點(diǎn)多態(tài)性與血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH不具有相關(guān)性。

3 討論

我們前期研究結(jié)果顯示，NONFH的病因病機(jī)以過量攝入激素類藥物及酒精中毒引起脂代謝紊亂為主[4]，脂代謝紊亂是NONFH發(fā)病的重要機(jī)制之一，血脂的異常升高可引起一系列的血管病變，如血管栓塞（脂肪滴隨血流流經(jīng)較細(xì)的股骨頭微小動(dòng)脈時(shí)，形成栓塞，阻斷微循環(huán)血供）[5]、血管損傷（血液中游離脂肪酸增多造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，主要包括活性氧的產(chǎn)生、凋亡的誘導(dǎo)以及內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張功能的異常）[6]、血管修復(fù)功能異常（游離脂肪酸破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞增值與凋亡的平衡，導(dǎo)致血管修復(fù)功能減弱），以及凝血異常（游離脂肪酸引起促凝血狀態(tài)，纖維溶解活性降低，血小板的活性和功能增強(qiáng)）。由此可見，脂代謝紊亂引起血脂增高是NONFH血管病變的重要因素。ApoA1作為構(gòu)成高密度脂蛋白的重要載脂蛋白，是脂質(zhì)代謝過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。如果ApoA1的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量發(fā)生變化，則可引起血脂代謝的紊亂，導(dǎo)致血中脂肪酸含量異常，進(jìn)一步引起上述的血管病變。ApoA1基因結(jié)構(gòu)的改變影響著ApoA1的分子結(jié)構(gòu)、生成和向血液中釋放的速率，進(jìn)而影響血中ApoA1與HDL的水平。本研究選取ApoA1 -75G/A和+83C/T多態(tài)性位點(diǎn)，以血瘀質(zhì)NONFH患者為研究對(duì)象，并將血瘀質(zhì)NONFH、非血瘀質(zhì)NONFH及對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，探討血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T的相關(guān)性。結(jié)果表明，AA基因型及A等位基因可能是發(fā)生NONFH的分子生物學(xué)機(jī)制之一。但并未發(fā)現(xiàn)血瘀質(zhì)NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T具有相關(guān)性。

ApoA1-75G/A多態(tài)性不僅可以破壞MspI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，還能夠改變GGGCCGG序列，后者是ApoA1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，具有激活轉(zhuǎn)錄的作用。當(dāng)該序列發(fā)生變化時(shí)，可能會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響ApoA1的合成。早期報(bào)道顯示，ApoA1基因啟動(dòng)子-75bp A等位基因與血漿ApoA1和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平密切相關(guān)，并認(rèn)為是A堿基的置換促進(jìn)了ApoA1基因的表達(dá)及合成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，A等位基因分布頻率低可能與NONFH的發(fā)病相關(guān)。說明ApoA1表達(dá)量過低可能與本病的發(fā)生相關(guān)。如ApoA1的表達(dá)及合成減少，首先影響血漿中脂類的傳輸，其次影響激活卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶（LCAT），阻礙成熟HDL的形成，從而增加肝外組織細(xì)胞及血漿中脂類的沉積，進(jìn)一步使血脂升高并引起血管病變。主要可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降并形成高凝血、低纖溶的病理狀態(tài)，脂質(zhì)過氧化形成xo-LDL沉積于血管局部，參與脂質(zhì)斑塊的形成，最終阻塞微血管，血管局部氧化性損傷及舒張性降低可阻斷微血管血流，是微循環(huán)障礙的重要因素。而這些血管病變有可能是股骨頭局部血運(yùn)障礙的主要因素，這與本課題組前期研究NONFH發(fā)病的重要機(jī)制“脂代謝紊亂-血管病變”一致。本研究結(jié)果亦顯示，ApoA1-75G/A位點(diǎn)及A等位基因與NONFH相關(guān)。所以推斷ApoA1基因-75G/A位點(diǎn)A等位基因可能與NONFH發(fā)病具有相關(guān)性。也有報(bào)道顯示，ApoA1的生成率在GG純合子中顯著高于GA雜合子，同時(shí)體外觀察發(fā)現(xiàn)A等位基因伴有啟動(dòng)子活性降低，并且表達(dá)水平降低[8]。本研究未發(fā)現(xiàn)GG、GA基因型與NONFH具有相關(guān)性。而A等位基因?qū)poA1表達(dá)的影響，本課題組會(huì)在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步研究，并擴(kuò)充樣本量，探討NONFH高發(fā)體質(zhì)類型的分子生物學(xué)機(jī)制。

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