李渡酒業(yè)元代古窖與新窖窖泥微生物的比較研究

湯向陽(yáng),陳金魁,朱棟才,李新社,肖長(zhǎng)元

(1.江西李渡酒業(yè)有限公司,江西 南昌331725；2.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系,湖南 邵陽(yáng) 422000)

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李渡酒業(yè)元代古窖與新窖窖泥微生物的比較研究

湯向陽(yáng)1,陳金魁2,朱棟才1,李新社2,肖長(zhǎng)元2

(1.江西李渡酒業(yè)有限公司,江西 南昌331725；2.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系,湖南 邵陽(yáng) 422000)

以江西李渡酒業(yè)有限公司元代古窖與新窖窖泥為研究對(duì)象,對(duì)窖泥微生物種類與數(shù)量、窖泥理化指標(biāo)及窖池原漿酒理化指標(biāo)進(jìn)行比較研究。研究結(jié)果顯示：元代古窖窖泥中細(xì)菌、霉菌、酵母菌、放線菌等主要功能菌種類與新窖基本一致,但數(shù)量均多于新窖窖窖泥；窖泥水分含量、窖泥總磷和鉀含量隨著窖齡的增加有上升的趨勢(shì),窖泥腐殖質(zhì)含量隨著窖齡的增加有下降的趨勢(shì),兩窖窖泥 pH 值均為弱酸性；元代窖池原漿酒的酒精度、總酸、總酯含量高于新窖池原漿酒,而固形物含量低于新窖池原漿酒。研究結(jié)果表明,窖池窖齡對(duì)大曲酒風(fēng)味和品質(zhì)有一定影響,老窖出好酒的根本原因是隨著窖齡的增長(zhǎng),功能菌的數(shù)量和種類增加,產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)和香味物質(zhì)更多,生產(chǎn)的大曲酒品質(zhì)更優(yōu)。

窖泥；微生物；功能菌；原漿酒；理化指標(biāo)

窖池是中國(guó)白酒特色發(fā)酵容器,窖池窖泥質(zhì)量影響白酒質(zhì)量。自然老熟的窖泥是歷經(jīng)幾年甚至上千年轉(zhuǎn)化積累而成,窖泥中的微生物不斷演變,酒糟中的物質(zhì)互相滲透,香味物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等成分的持續(xù)累積以形成優(yōu)質(zhì)老窖泥,是微生物生長(zhǎng)和富集的溫床,因此窖泥微生物對(duì)大曲酒產(chǎn)量和質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用[1～2]。窖泥中的細(xì)菌主要有乳酸菌、丁酸菌、己酸菌、甲烷菌、丙酸菌[3]等；霉菌主要有根霉,曲霉,毛霉等[4]；酵母菌主要有酒精酵母,漢遜氏酵母,假絲酵母[5]等；放線菌主要有鏈霉菌,諾卡氏菌,小單孢菌等[6]。

對(duì)于窖泥微生物的研究,主要集中在窖泥微生物區(qū)系分析、功能菌鑒定及窖泥微生物功能菌對(duì)酒質(zhì)的影響：施安輝[7]對(duì)濃香型酒窖中微生物隨發(fā)酵過(guò)程中微生物的變化情況,從入窖至出窖窖泥中微生物區(qū)系分析的結(jié)果說(shuō)明,窖泥中的好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而有規(guī)律地變化。吳飛[8]對(duì)滬州窖池與全興窖池中酵母菌的變化情況作了研究,結(jié)果表明,發(fā)酵工藝對(duì)微生物消長(zhǎng)情況有較大的影響。從優(yōu)勢(shì)菌群來(lái)看,每個(gè)窖池都有各屬的酵母優(yōu)勢(shì)菌群,但是各個(gè)窖池中分布的優(yōu)勢(shì)菌又有所差異。白酒微生物是形成白酒香型的一個(gè)重要因素,它在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,即白酒微生物影響著白酒的香味和風(fēng)格。白酒微生物區(qū)系研究表明在濃香型酒曲中細(xì)菌總數(shù)高于醬香型酒曲,而醬香型酒曲中的芽孢菌總數(shù)高于濃香型酒曲,另外濃香型酒曲中的產(chǎn)酸菌,分解菌高于醬香型酒曲。王治國(guó)等[9]在應(yīng)用產(chǎn)醋酵母提高濃香型白酒質(zhì)量的研究中指出,濃香型白酒中應(yīng)用產(chǎn)醋酵母,對(duì)己酸醋化成己酸乙醋有促進(jìn)作用而且可以大幅度提高乙酸乙醋的含量;當(dāng)產(chǎn)醋酵母和己酸菌液混合使用時(shí),可以較大的提高己酸乙醋的含量,而且可以相對(duì)降低乳酸乙醋的含量。張付旺等[10]研究發(fā)現(xiàn),由于丙酸菌具有分解乳酸的特性,因此當(dāng)將丙酸菌應(yīng)用到白酒發(fā)酵中時(shí),白酒中的乳酸和乳酸乙醋的含量降低而且己酸乙醋含量增加,提高了酒體的風(fēng)味,取得了非常顯著的效果。乳酸菌在白酒發(fā)酵過(guò)程中有著重要的作用,研究表明它對(duì)美拉德反應(yīng)有促進(jìn)作用,而且維持發(fā)酵環(huán)境的偏酸性,有利于糖化和發(fā)酵的順利進(jìn)行。另外乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸是乳酸乙醋及其他香味成分的重要前提物質(zhì)。 吳飛等[[11]從發(fā)酵7d的濃香型白酒發(fā)酵酒醅中分離到84株酵母菌,通過(guò)形態(tài)特征、生理特性檢測(cè)及18SrDNA分子生物學(xué)水平鑒定方法將其歸為6個(gè)類群,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,樣品酒醅中可培養(yǎng)酵母以伊薩酵母屬和畢赤酵母屬為主,得巴利酵母屬和假茲酵母屬也占有相當(dāng)?shù)谋壤?其中還有一定數(shù)量的其他屬種,如酵母屬和紅酵母屬。張文學(xué)等[12]為探索中國(guó)濃香型白酒發(fā)酵糟醅中細(xì)菌類微生物區(qū)系的形成和演變規(guī)律,通過(guò)發(fā)酵全過(guò)程跟蹤取樣和借助PCR擴(kuò)增技術(shù),對(duì)窖池中心糟醅樣品進(jìn)行了DGGE分析和16SrDNA同源性比較。研究發(fā)現(xiàn),11個(gè)以上的細(xì)菌分類屬;隨著發(fā)酵的進(jìn)行,Lactobacillus屬細(xì)菌成為主要優(yōu)勢(shì)菌,檢出的有效克隆達(dá)到全部克隆的56.1%,并全部為L(zhǎng)uc.Acetotolerans(98%)菌株。主要細(xì)菌菌群的數(shù)量分布及變化趨勢(shì)顯示,在濃香型白酒糟醅發(fā)酵過(guò)程Lactobacillus屬細(xì)菌可能充當(dāng)著重要的角色。

本研究旨在對(duì)李渡酒業(yè)元代古窖與建于上世紀(jì)八十年代的新窖窖泥微生物進(jìn)行比較研究,以探究大曲酒品質(zhì)與窖泥質(zhì)量之間的聯(lián)系,為老窖出好酒提供科學(xué)理論依據(jù),為李渡酒業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

窖泥：采自李渡酒業(yè)32#元代古窖與李渡酒業(yè)新窖(建于二十世紀(jì)八十年代)

原漿酒：李渡酒業(yè)元代古窖與新窖原漿酒由李渡酒業(yè)提供。

試劑：硝酸、亞硝酸鈉(天津鵬坤化工有限公司);硝酸鉀、硝酸鈷(廣州市榕晟化工有限公); 硫酸、高錳酸鉀(南京化學(xué)試劑有限公司); 草酸鈉、重鉻酸鉀、氫氧化鈉(天津鵬坤化工有限公司);鄰啡羅啉(沈陽(yáng)金天源化工有限公司);蛋白胨、胰蛋白胨(生工生物工程股份有限公司);牛肉膏、酵母膏(上海生化試劑撫生有限公司);葡萄糖、瓊脂(武漢萬(wàn)榮科技發(fā)展有限公司);檸檬酸氫二銨、氯化鈣(浙江大成鈣業(yè)有限公司);氯化鈷(上海芃碩生物科技有限公司)。

培養(yǎng)基：包括細(xì)菌培養(yǎng)基；酵母菌培養(yǎng)基；霉菌培養(yǎng)基；放線菌培養(yǎng)基。配制各微生物特征培養(yǎng)基,參照GB4789.2-2010 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定的方法進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

MBMJ-78A高壓蒸汽滅菌鍋(北京東西儀科技有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；HPX-9272MBE恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；標(biāo)準(zhǔn)單人型超凈工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；菌落計(jì)數(shù)器(無(wú)錫久平儀器有限公司)等。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣品采集及預(yù)處理

選取窖池四壁和窖底中央五點(diǎn)進(jìn)行窖泥取樣。取樣后及時(shí)進(jìn)行感官評(píng)定、水分含量檢測(cè)及微生物數(shù)目檢測(cè)；剩余樣品自然風(fēng)干后粉碎、100目過(guò)篩,用于腐殖質(zhì)、有效鉀和有效磷等的檢測(cè)。

1.2.2 微生物種類與數(shù)量檢測(cè)

配制各微生物特征培養(yǎng)基,參照GB4789.2-2010 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定的方法進(jìn)行：

窖泥樣液制備(25g+225ml無(wú)菌水)→窖泥稀釋液的制備(十倍稀釋法)→平板涂布分離(做3個(gè)連續(xù)的稀釋度,每稀釋度做2-4套平行平板,真菌培養(yǎng)需加細(xì)菌抑制劑)法→培養(yǎng)箱適溫培養(yǎng)至生長(zhǎng)完全→計(jì)數(shù)→挑取菌落編號(hào)后劃線純化→純種移接斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 窖泥理化指標(biāo)測(cè)定方法[13]

(1)水分的測(cè)定：采用恒重法[14];(2) PH測(cè)定：采用PH計(jì)法[15];(3)有效磷測(cè)定：浸提—鉬銻4抗比色法[16];(4)腐殖質(zhì)的測(cè)定：采用焦磷酸鈉提取重鉻酸鉀法[17]。

1.2.4 原漿酒理化指標(biāo)檢測(cè)方法

(1)總酸的測(cè)定：采用中和滴定法[18];

(2)總脂的測(cè)定：采用氫氧化鈉滴定法[19];(3)酒精度的檢測(cè)：采用酒精計(jì)測(cè)定法[20];(4)酒精中固形物檢測(cè)：采用恒重法[21];

2 結(jié)果和分析

2.1 窖泥中微生物檢測(cè)

2.1.1 窖泥中主要微生物類群檢測(cè)

分別配制細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌常規(guī)培養(yǎng)基,滅菌后倒平板備用。將窖泥樣品制成樣液,進(jìn)行十倍稀釋后,采用平板活菌計(jì)數(shù)法,檢測(cè)窖泥中微生物數(shù),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 窖泥中主要微生物類群檢測(cè)結(jié)果(cfu/g)

由表1可知,元代古窖窖泥四大主要微生物類群數(shù)量均多于新窖窖泥。這主要是由于隨著窖齡的增加,窖池中的環(huán)境更加有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖以及演變演化,微生物逐漸富集的結(jié)果。元代古窖窖泥中細(xì)菌總數(shù)高于新窖窖泥,因而能產(chǎn)生更多的酸類和香味物質(zhì)。元代古窖窖泥霉菌略多于現(xiàn)代窖泥,使古窖窖泥的糖化能力更強(qiáng),可產(chǎn)生更多的形成大曲酒風(fēng)味的物質(zhì)。元代古窖窖泥酵母菌高于現(xiàn)代窖泥,更有利于酒精的產(chǎn)生。相對(duì)而言,老窖與新窖放線菌數(shù)量差異小,是因?yàn)榉啪€菌為好氧菌,新窖窖齡短,窖泥中氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分比較充足,有利于好氧菌的生長(zhǎng)、繁殖。

2.1.2 窖泥中主要微生物種類與數(shù)量檢測(cè)

分別配制乳酸菌、己酸菌、甲烷菌、丙酸菌、丁酸菌、酒精酵母、漢遜氏酵母、假絲酵母根霉、曲霉、毛霉、鏈霉菌、諾卡氏菌、小單孢菌的特征性培養(yǎng)基,滅菌后倒平板。將窖泥樣品經(jīng)十倍稀釋后,采用平板活菌計(jì)數(shù)法,檢測(cè)各菌的數(shù)量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 窖泥中主要微生物檢測(cè)結(jié)果(cfu/g)

從表2中可以看出,元代古窖窖泥中被檢酵母菌的數(shù)量均比新窖窖泥多。由于酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中,主要進(jìn)行的是酒精發(fā)酵,酒精含量越高,能溶解的風(fēng)味和香味物質(zhì)更多,釀造的大曲酒的品質(zhì)更加優(yōu)良。元代古窖窖泥中乳酸菌、己酸菌、丁酸菌等功能菌顯著高于新窖窖泥。丁酸菌、己酸菌生長(zhǎng)在窖泥中,利用酒醅浸潤(rùn)到窖泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生丁酸和己酸；乳酸菌能發(fā)酵酒醅內(nèi)糖類產(chǎn)生乳酸,乳酸通過(guò)酯化產(chǎn)生乳酸乙酯且乳酸菌具有釀酒的發(fā)酵、維護(hù)與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用。元代古窖窖泥中的各被檢霉菌數(shù)量比新窖窖泥多。由于霉菌在大曲酒釀制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種酶,能促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程,并參與發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的形成,因而影響大曲酒的出酒率和質(zhì)量。在一定程度上霉菌數(shù)量越多,出酒的品質(zhì)也就越好。元代古窖窖泥中的放線菌多于新窖窖泥。在白酒發(fā)酵初期,放線菌可以分泌產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶等,作用于酒醅中的淀粉、蛋白質(zhì)及纖維素等,生成各種氨基酸類及糖類物質(zhì),為發(fā)酵產(chǎn)酒、產(chǎn)香提供前體物質(zhì)。隨著放線菌的數(shù)量增加,釀造過(guò)程中形成的風(fēng)味和生香物質(zhì)更多,在一定成度上影響酒的品質(zhì)。

2.2 窖泥理化指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 窖泥的感官檢測(cè)及窖泥的理化指標(biāo)檢測(cè)

從色澤、氣味、手感等方面對(duì)元代古窖與新窖窖泥進(jìn)行感官評(píng)價(jià)；指標(biāo)[22]。隨機(jī)選取20人對(duì)兩窖窖泥根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化打分,最后計(jì)算出平均值。采集兩窖窖泥樣品,對(duì)其中的水分含量、pH值、腐殖質(zhì)、有效鉀、有效磷等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 窖泥的感官檢測(cè)及窖泥的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表3可知,新窖窖泥呈黃褐色,無(wú)投入原料本色,有窖泥酯香、酒香味,略有生味,無(wú)其它異雜味,有明顯刺手感,窖泥質(zhì)地較為均勻,摻有少許雜質(zhì),稍有粘稠感。元代古窖窖泥呈灰褐色,聞之略有酯香、酒香,無(wú)其它異雜味,手感柔熟細(xì)膩,質(zhì)地均勻無(wú)雜質(zhì),有粘稠感,各項(xiàng)感官指標(biāo)顯示,基本符合優(yōu)質(zhì)窖泥的標(biāo)準(zhǔn)。新窖窖泥的水分含量明顯高于元代古窖窖泥,pH略高于元代古窖窖泥,而優(yōu)質(zhì)窖泥的含水量在45%～55%,元代古窖窖泥更符合優(yōu)質(zhì)窖泥的標(biāo)準(zhǔn)。隨著窖齡的增長(zhǎng),各類物質(zhì)的積累量增多,有機(jī)質(zhì)和各種元素的量也增加,元代古窖窖泥中的腐殖質(zhì)、有效鉀、有效磷均高于新窖窖泥,其構(gòu)成的物質(zhì)環(huán)境更有利于各類微生物生長(zhǎng)和合成各種風(fēng)味物質(zhì)。

2.3 原漿酒理化指標(biāo)檢測(cè)

分別采集元代古窖與新窖窖池釀制的原漿酒樣品,對(duì)它們進(jìn)行酒精度、總酸、總酯及固形物含量檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 原漿酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表4可知,元代古窖釀出的原漿酒酒精度、總酸、總酯含量均高于新窖釀出的原漿酒,而固形物含量則低于新窖釀出的原漿酒。這是由于元代古窖窖泥中酒精酵母略多于現(xiàn)代窖泥,故其產(chǎn)生的酒精量稍高,因此其原漿酒的酒精度略高于新窖釀出的原漿酒。元代古窖窖泥中乳酸菌、己酸菌、丁酸菌等產(chǎn)酸功能菌高于新窖窖泥,故而其原漿酒總酸更高。由于元代古窖窖泥中產(chǎn)酸、產(chǎn)醇微生物數(shù)目較新窖窖泥多,因此,形成的酯類芳香物質(zhì)也更多。新窖窖泥相對(duì)而言不夠成熟,在發(fā)酵過(guò)程中生成過(guò)多的乳酸、乙酸等酸類物質(zhì),易在之后的生產(chǎn)加工過(guò)程中形成固形物,因此新窖原漿酒的固形物含量高于元代古窖的原漿酒。

3 結(jié)論

(1)兩窖窖泥的微生物種類沒(méi)有差異,差異在于微生物數(shù)量,表現(xiàn)為元代古窖窖泥待檢微生物數(shù)量均多于新窖窖泥.

(2)元代古窖窖泥呈灰褐色,有酯香、酒香,無(wú)其它異雜味,手感柔熟細(xì)膩,質(zhì)地均勻無(wú)雜質(zhì),有粘稠感,達(dá)到優(yōu)質(zhì)窖泥的標(biāo)準(zhǔn)；現(xiàn)代窖泥呈黃褐色,有窖泥酯香、酒香味,略有生味,無(wú)其它異雜味,有元顯刺手感,窖泥質(zhì)地較為均勻,摻有少許雜質(zhì),稍有粘稠感,窖泥感官指標(biāo)不及元代窖泥。

(3)元代古窖窖泥腐殖質(zhì)、有效鉀、有效磷含量高于新窖窖泥,而水分、pH值低于新窖窖泥。表明,窖泥水分含量隨著窖齡的增加有下降的趨勢(shì)；不同窖齡窖泥 pH 值均為弱酸性；窖泥腐殖質(zhì)含量隨著窖齡的增加有上升的趨勢(shì)。

(4)元代窖池原漿酒的酒精度、總酸、總酯含量高于新窖窖池原漿酒,而固形物含量則低于新窖窖池原漿酒。

因此,老窖出好酒的根本原因是功能菌的數(shù)量和種類。隨著窖齡的增長(zhǎng),窖泥中的有機(jī)物和各種元素含量增多,有利于各種微生物的生長(zhǎng)繁殖,微生物種類和數(shù)量隨之增加,微生物的豐富度更高,各類微生物相互協(xié)作,形成成熟穩(wěn)定的微生物區(qū)系,產(chǎn)生大曲酒風(fēng)味和香味的物質(zhì)更多,從而生產(chǎn)的大曲酒品質(zhì)更優(yōu)。通過(guò)檢測(cè)比較兩窖窖泥及原漿酒的理化指標(biāo),也充分印證了這一理論。

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Comparison of the pit mud microorganisms between Yuan dynasty old cellar and new cellar from Li Du wine Co.,Ltd.

TANG Xiangyang1,CHEN Jinkui2,ZHU Dongcai1,LI Xinshe2,XIAO Changyuan2

(1.Jiangxi Li Du wine Co.,Ltd,Nanchang Jiangxi 331725；2.The Department of Biology and Chemistry Engineering,Shaoyang University,Shaoyang ,Hunan 422004)

The pit mud of Yuan Dynasty old cellar and new cellar from Li Du wine Co.,Ltd were studied and compared.The number and species of microbes in pit mud,the physicochemical index of pit mud and the physiochemical indexes of the wine were compared.The results showed that: the main functions bacteria in the pit mud of the Yuan Dynasty were basically the same with the new cellar,but the number was more than that of the new pit mud.The content of water,K,P in pit mud increased and the content of pit mud humus decreased with the increase of age.The pH value of the two pit mud was weak acidity.The content of alcohol,total acid,total ester of Yuan Dynasty pits protoplasmic wine was higher than that of new pits protoplasmic wine and the content of solid is lower than that of the new pits.It showed that the pit age has a certain effect on the flavor and quality of liquor,with the cellar age growth,the number and variety of functional bacteria are increased and more flavor and flavor substances are produced,there,the quality of the wine is better.

pit mud;microorganism;functional bacteria;protoplasmic wine;physicochemical index

1672-7010(2016)03-0102-06

2016-05-18

湖南省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(CX2015B603)；邵陽(yáng)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2015SY008)

湯向陽(yáng)(1968-)，男，江西李渡酒業(yè)有限公司董事長(zhǎng)，從事生態(tài)釀酒研究

李新社(1965-),女，教授，碩士，從事應(yīng)用微生物教學(xué)與研究，E-mail：625959218@qq.com

TS262.3；TS261.1

A