林碧璇何惠芳吳蔚苗

（1.佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科佛山528300；2.佛山市順德區(qū)中醫(yī)院藥劑科佛山528300）

中藥制劑中農(nóng)藥高通量監(jiān)測(cè)的技術(shù)研究△

林碧璇1何惠芳1吳蔚苗2

（1.佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科佛山528300；2.佛山市順德區(qū)中醫(yī)院藥劑科佛山528300）

本文基于2015版《中國(guó)藥典》（通則2341）中就農(nóng)藥殘留量測(cè)定法的要求，分析美、日、歐洲等國(guó)外藥典中對(duì)植物藥農(nóng)藥殘留量的限量規(guī)定，提出實(shí)現(xiàn)中藥制劑農(nóng)殘高通量篩查必要性的同時(shí)，聚焦“樣品前處理”與“檢測(cè)手段選擇”關(guān)鍵技術(shù)研究進(jìn)展，為快速、靈敏、簡(jiǎn)便的中藥制劑農(nóng)殘分析平臺(tái)的建立提供參考。

中藥制劑 農(nóng)藥殘留 高通量分析

隨著中成藥需求的日益增長(zhǎng)，野生藥材資源告急，采用人工種植的藥材已成為中藥制劑原料的重要來(lái)源。盡管國(guó)家藥品監(jiān)督管理局制定了中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP），對(duì)中藥材生產(chǎn)基地的選定、品種栽培、采收加工、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作出了規(guī)定，但在實(shí)施過(guò)程中，部分種植戶為防止病、蟲、草害不合理噴用農(nóng)藥，或在藥材加工、儲(chǔ)存過(guò)程中不科學(xué)施用農(nóng)藥的現(xiàn)象常有發(fā)生。過(guò)度用藥后殘留的有機(jī)農(nóng)藥很可能通過(guò)中草藥經(jīng)加工積蓄到由其制成的中成藥，對(duì)藥品使用者的健康造成威脅。可見(jiàn)，中藥材與中藥制劑的農(nóng)藥殘留問(wèn)題已成為我國(guó)藥物安全性評(píng)價(jià)系統(tǒng)中迫切需要解決的難題。

在全球中草藥市場(chǎng)中，農(nóng)藥殘留問(wèn)題是我國(guó)中藥出口的瓶頸之一，使其銷售量仍然處于低端徘徊狀態(tài)[1]，2015版《中國(guó)藥典》對(duì)中藥農(nóng)藥殘留的規(guī)定遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)。為此，筆者擬對(duì)我國(guó)藥典與美、日、歐洲等國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于植物藥農(nóng)藥殘留量的限量規(guī)定進(jìn)行對(duì)比分析，并就中成藥農(nóng)藥殘留分析過(guò)程中的核心環(huán)節(jié)——“樣品前處理”與“檢測(cè)手段選擇”的研究現(xiàn)狀作一綜述，旨在為建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便的中藥制劑中農(nóng)藥多殘留高通量篩查平臺(tái)提供參考。

1　國(guó)內(nèi)外施行標(biāo)準(zhǔn)差異

市售有機(jī)農(nóng)藥按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，主要為有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類以及擬除蟲菊酯類[1，2]。其中有機(jī)氯類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，禁用多年后仍可在水域、土壤內(nèi)測(cè)出較高的殘留量，由外界環(huán)境的殘留引起的植物體內(nèi)蓄積，很可能引起中藥制劑不同程度的污染。有報(bào)道[3，4]參照藥典9種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法評(píng)價(jià)臨床常用的幾種成藥制劑的安全性，結(jié)果部分樣品檢出含有六六六與滴滴涕，所幸其殘留量低于0.01mg/kg。亦有報(bào)道[1，5]檢出部分中藥制劑中含有有機(jī)磷、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。

2015版《中國(guó)藥典》僅對(duì)人參（人參莖葉總皂苷、人參總皂苷）、甘草、西洋參、黃芪藥材品種中有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量有所規(guī)定，未涉及中藥制劑中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后[6]。盡管藥典四部“通則2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中除常用的第一法（9種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法、22種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法）外，尚有第二法（機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法-色譜法）、第三法（擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定法-色譜法）與第四法（農(nóng)藥多殘留量測(cè)定法-質(zhì)譜法）的表述[7]，但在藥典一部中成藥制劑下的檢查項(xiàng)未有農(nóng)藥殘留量的限量要求。相比之下，其他國(guó)家與地區(qū)已對(duì)植物藥和植物提取物的農(nóng)藥殘留有嚴(yán)格的規(guī)定。

香港中成藥注冊(cè)安全性資料技術(shù)指引把艾氏劑、狄氏劑、氯丹等9類20種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留列為中成藥安全性的必檢項(xiàng)目[8]。歐洲藥典與美國(guó)藥典為目前規(guī)定植物藥的農(nóng)藥殘留限量品種較為全面的藥典，除有機(jī)氯類農(nóng)藥還規(guī)定了有機(jī)磷類農(nóng)藥限量，涉及70余種農(nóng)藥[9]。除品種涉及面較我國(guó)藥典廣泛外，上述標(biāo)準(zhǔn)收載的方法具有較強(qiáng)的適用性與嚴(yán)謹(jǐn)性[10]：樣品前處理包括凝膠滲透色譜法GPC+固相萃取小柱（SPE）、混合固相萃取小柱（SPE）法或磺化反應(yīng)法，適用于多種農(nóng)藥的檢測(cè)；為防止實(shí)驗(yàn)中外源性污染，對(duì)溶劑、試劑、玻璃器皿洗滌等作出規(guī)定，對(duì)最低檢測(cè)限、加樣回收率等有所要求；若出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，要求使用不同極性的毛細(xì)管氣相色譜柱或GC-MS聯(lián)用進(jìn)行驗(yàn)證。顯然，我國(guó)藥典對(duì)中成藥的農(nóng)藥殘留限量暫無(wú)一品種要求的現(xiàn)狀，滯后于國(guó)際上對(duì)天然藥物中農(nóng)藥殘留的規(guī)定，建立快速、靈敏、全面的中藥制劑農(nóng)藥多殘留分析平臺(tái)已迫在眉睫。

2　分析技術(shù)現(xiàn)狀

中藥制劑所含化學(xué)成分復(fù)雜，涵蓋黃酮、生物堿、萜類、色素、油脂等，劑型復(fù)雜，而制劑中的農(nóng)藥殘留量屬痕量級(jí)（ng～pg級(jí)），使農(nóng)藥的提取、凈化難度較高，檢測(cè)方式選擇更為復(fù)雜。過(guò)去的學(xué)者們就樣品的前處理與檢測(cè)手段的選擇兩大關(guān)鍵技術(shù)積累了豐富的工作經(jīng)驗(yàn)。

2.1樣品前處理技術(shù)：目前在農(nóng)殘分析中應(yīng)用較為廣泛的提取凈化方法為QuEChERS法、儀器提取法（超臨界流體萃取、加速溶劑萃取、微波萃?。?、吸附提取法（固相萃取、固相微萃取、基質(zhì)固相分散）、凝膠滲透色譜等，并逐步向免疫親和色譜、分子印跡技術(shù)等操作簡(jiǎn)便、環(huán)境污染小的新型技術(shù)發(fā)展。

QuEChERS法集樣品萃取、凈化為一體，適合大批量樣品的分析，Xu R等[11]采用改良的QuEChERS法完成80種中草藥中15種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的樣品前處理，但此法去除色素及中弱極性干擾物的能力不甚理想[12]。通過(guò)柱凈化處理亦為一研究熱點(diǎn)，劉曉霞等[1]對(duì)比活性炭吸附+乙酸乙酯超聲提取、有機(jī)溶劑超聲提取+柱凈化處理，結(jié)果后者可除去大量雜質(zhì)；有報(bào)道[13，14]采用凝膠滲透色譜（GPC）凈化-毛細(xì)管氣相色譜完成仙靈骨葆膠囊、化痔栓中20種有機(jī)氯農(nóng)藥的測(cè)定；但此類SPE和離線GPC在進(jìn)行多樣品凈化時(shí)，存在溶劑消耗量大、操作煩瑣、制樣時(shí)間長(zhǎng)等局限性[15]。較為經(jīng)典的磺化反應(yīng)法，對(duì)樣品中的色素、油脂類干擾物質(zhì)凈化效果明顯，但不適用于對(duì)酸不穩(wěn)定的狄氏劑、異狄氏劑、五氯苯胺等農(nóng)藥測(cè)定。

針對(duì)不同提取凈化手段的屬性，Huang ZQ等[16]聯(lián)合凝膠滲透色譜與固相萃取凈化樣品，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行測(cè)定，成功建立了茶葉中102種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。本例的成功得益于前處理技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)與檢測(cè)手段的日漸成熟，提示同時(shí)測(cè)定多種農(nóng)藥殘留成為可能，該思路拓展到藥材、制劑等對(duì)象的農(nóng)藥多殘留分析，更是中藥安全性評(píng)價(jià)系統(tǒng)往后發(fā)展的重要風(fēng)向標(biāo)。

2.2樣品檢測(cè)技術(shù)：隨著農(nóng)藥殘留前處理方法的逐漸成熟，檢測(cè)技術(shù)手段多種多樣?，F(xiàn)較常用的方法有氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法和生物傳感器技術(shù)等。

2.2.1氣相色譜法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：在眾多的檢測(cè)手段中，氣相色譜法在實(shí)際農(nóng)殘檢測(cè)中使用最多，相關(guān)文獻(xiàn)資源豐富[4，8，17]主要適用于相對(duì)分子量小、沸點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性較好的農(nóng)藥品種，其檢測(cè)器主要分為電子捕獲檢測(cè)器（ECD）、氮磷檢測(cè)器（NPD）與火焰光度檢測(cè)器（FPD）：ECD用于高電負(fù)性農(nóng)藥如擬除蟲菊酯類、有機(jī)氯類農(nóng)藥的檢測(cè)[18]；NPD用于氨基甲酸酯類和有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)[19]；FPD為含磷、硫類化合物的特異性檢測(cè)器，用于有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)[20]。盡管氣相色譜法的不同檢測(cè)器可滿足不同性質(zhì)的農(nóng)藥檢測(cè)，但存在：①FPD、NPD檢測(cè)器專屬性較強(qiáng)，只能檢測(cè)某一特定種類的農(nóng)藥；②進(jìn)行復(fù)雜樣品測(cè)定時(shí)易受到背景噪音和雜質(zhì)的干擾；③多成分測(cè)定時(shí)分離度較差等問(wèn)題。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)彌補(bǔ)了氣相色譜法檢測(cè)器的缺陷，質(zhì)譜檢測(cè)器屬通用性檢測(cè)器，可通過(guò)選擇監(jiān)測(cè)離子模式降低背景噪音與雜質(zhì)干擾從而提高靈敏度，適用于中藥制劑中農(nóng)藥多殘留分析，可同時(shí)完成不同類別的百余種農(nóng)藥殘留的快速掃描、定性定量。郭青等[21]對(duì)比GC-ECD和GC-MS法測(cè)定甘草鋅顆粒及復(fù)心片中二十種有機(jī)氯農(nóng)藥，結(jié)果顯示GC-ECD在痕量分析時(shí)易受假陽(yáng)性及背景干擾。謝耀軒等[22]采用GC-MS法完成安宮降壓丸、喉必清膠囊、消石靈膠囊等12種香港中成藥的20種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的分析。

2.2.2液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：高效液相色譜法配置紫外可見(jiàn)光光度檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、二級(jí)管陣列檢測(cè)器等檢測(cè)器后，適用于氣相色譜難以測(cè)定的沸點(diǎn)高、熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥檢測(cè)[23]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用較液相色譜法的優(yōu)勢(shì)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用雷同，可完成大分子量的成分檢測(cè)，其種類涉及有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、苯并咪唑、三唑類等[24，25]。

2.2.3其他：在農(nóng)藥殘留分析中，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)、超臨界流體色譜-檢測(cè)器聯(lián)用、免疫分析法、生物傳感器法檢測(cè)手段的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。毛細(xì)管電泳技術(shù)具有分析速度快、選擇性強(qiáng)、溶劑和試樣用量極少的特點(diǎn)；超臨界流體色譜-檢測(cè)器聯(lián)用應(yīng)用于沸點(diǎn)低、熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥檢測(cè)；免疫分析法與生物傳感器法操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)，在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景。

3　結(jié)語(yǔ)

針對(duì)全世界農(nóng)藥使用量迅猛增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，日、韓、美等國(guó)已日漸加強(qiáng)天然藥物開發(fā)的法制化工作，對(duì)植物藥中農(nóng)藥殘留的法律法規(guī)規(guī)定監(jiān)測(cè)的農(nóng)藥殘留品種和有關(guān)國(guó)家藥典中的農(nóng)藥規(guī)定較為完善。而我國(guó)現(xiàn)行藥典僅對(duì)人參（人參莖葉總皂苷、人參總皂苷）、甘草、西洋參、黃芪藥材品種中有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量有所規(guī)定，未涉及中成藥品種的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后。為此，筆者基于學(xué)者們?cè)谥谐伤庌r(nóng)殘分析的文獻(xiàn)材料，就中藥制劑的農(nóng)藥高通量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提出拙見(jiàn)：①參照2015版《中國(guó)藥典》“通則2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”中第四法“農(nóng)藥多殘留量測(cè)定法-質(zhì)譜法”與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中蔬菜水果農(nóng)藥多殘留監(jiān)測(cè)方法，嘗試建立臨床常用、服用療程長(zhǎng)的中成藥中多種農(nóng)藥同時(shí)測(cè)定的方法；②根據(jù)成藥不同劑型中基質(zhì)、輔料的干擾，對(duì)高通量監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化；③參考《殘留分析質(zhì)量控制指南》對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)進(jìn)一步規(guī)范，如實(shí)驗(yàn)試劑的純度、玻璃器皿的洗滌方法、農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的存放條件、陽(yáng)性結(jié)果用以驗(yàn)證的色譜柱類型等；④重視中藥制劑原料的溯源，登記藥材的農(nóng)藥使用情況，尤其關(guān)注其他地區(qū)和國(guó)家規(guī)定的農(nóng)藥品種；⑤重視藥品技術(shù)人員樣品提取、凈化、分析等操作的規(guī)范化。隨著人們對(duì)中藥制劑用藥安全性的關(guān)注日漸升溫，中成藥農(nóng)藥殘留問(wèn)題的解決迫在眉睫，建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便的中藥制劑中多種農(nóng)殘高通量監(jiān)測(cè)平臺(tái)具有現(xiàn)實(shí)意義，保障患者用藥安全的同時(shí)利于出口產(chǎn)品與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌。

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R284.1

B

1672-8351（2016）10-0156-02

△佛山市科技局立項(xiàng)科研課題編號(hào)：（2014AB002333），項(xiàng)目名稱：中藥制劑中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)研究。