周世娟

廣東省惠東縣人民醫(yī)院，廣東惠東 516300

一株罕見手感染克羅彭斯特諾卡菌的鑒定

周世娟

廣東省惠東縣人民醫(yī)院，廣東惠東 516300

目的 探討如何鑒定一株罕見克羅彭斯特菌諾卡菌的鑒定方法。 方法 將一株從患者手分離出來(lái)的菌株，采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、菌落生化特性分析、遺傳學(xué)分析（如質(zhì)譜技術(shù)、16S rRNA基因擴(kuò)增后做靶向DNA測(cè)序）等相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 臨床分離的該罕見菌通過鏡下菌體典型特征（革蘭染色呈90°分枝角G+分枝菌絲，改良Kinyoun染色為陽(yáng)性）；在血平板、巧克力平板生長(zhǎng)緩慢，菌落細(xì)小，時(shí)間延長(zhǎng)起皺褶；觸酶陽(yáng)性，分解葡萄糖、七葉苷、尿素酶，不分解甘露醇、肌醇、明膠；經(jīng)16S rRNA基因擴(kuò)增后做靶向DNA測(cè)序等綜合分析，最后鑒定為克羅彭斯特諾卡菌（Norcardia Kroppenstedtii)。 結(jié)論 各實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征、菌落生化特性結(jié)合遺傳學(xué)分析(如16S rRNA基因擴(kuò)增后進(jìn)行靶向DNA測(cè)序）鑒定諾卡菌屬，可及時(shí)、準(zhǔn)確鑒定出克羅彭斯特諾卡菌這類生長(zhǎng)緩慢、罕見菌種。

16SrRNA；測(cè)序；克羅彭斯特諾卡菌

諾卡菌（Norcardia）在自然界分布廣泛，多為腐生寄生菌，近年來(lái)諾卡菌病呈上升趨勢(shì)，主要引起肺部疾病、血流感染、皮膚感染及全身播散性感染，臨床病癥復(fù)雜多樣[1]。臨床患者感染較常見分離到星形諾卡菌（Norcardia asteroids）和巴西諾卡菌（Norcardia.Brasiliensis），而克羅彭斯特諾卡菌（Norcardia Kroppenstedtii）國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，國(guó)外罕見報(bào)道?，F(xiàn)將本院1例克羅彭斯特諾卡菌感染病例的臨床資料及鑒定過程報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

患者男，67歲，農(nóng)民，既往體健。2016年5月因“右食指進(jìn)行性紅腫伴疼痛”急性起病1周新入院。血常規(guī)提示：白細(xì)胞總數(shù)10.32×109/L，中性粒細(xì)胞比例84.3%，血紅蛋白141g/L，血小板總數(shù)130×109/L。予以局部穿刺抽膿，膿液送細(xì)菌培養(yǎng)。查體：T 36.3℃，P 74次/分，R 20次/min，BP 135/83mm Hg，一般狀況好，心肺腹無(wú)特殊，患者神志清，精神軟，?？魄闆r：見右手掌腫脹，以右食指及手掌骨側(cè)緣為甚，局部皮膚紅腫，表面無(wú)破潰，可見少量黑色藥殘留物（自敷草藥處理，癥狀未見好轉(zhuǎn)，腫脹呈進(jìn)行性增大，并向近節(jié)及手掌蔓延），有淤血，局部壓痛（+），可捫及右食指及手掌撓骨波動(dòng)感，右食指屈曲受損，指端血運(yùn)可，皮膚感覺無(wú)減退。于右食指中節(jié)、近節(jié)橈側(cè)緣及手掌膜層，縱向切開腱鞘，見切口流出咖啡色膿液，量約2mL取膿液送微生物室檢查。據(jù)患者口述：膿腫部位一年前曾被竹鍬刺傷后化膿發(fā)炎，當(dāng)時(shí)在當(dāng)?shù)劓?zhèn)醫(yī)院清創(chuàng)消炎半月痊愈。

1.2檢測(cè)用儀器、試劑

儀器：普通培養(yǎng)箱WS2-134-65型（上海躍進(jìn)）；Olympus CX21顯微鏡（奧林巴斯公司）；3730XL測(cè)序儀（ABI公司）等。

試劑：血平板（廣州迪景公司）、巧克力平板、麥康凱平板（梅里埃）等；快速革蘭染液、抗酸（萋-尼氏）染液（珠海貝索公司）；弱抗酸（改良Kinyoun）染液[2]（將抗酸染液Ⅱ液中的脫色劑鹽酸改成1%的鹽酸。改良抗酸染色具體步驟：石炭酸復(fù)紅5min→1%硫酸脫色3min→亞甲藍(lán)復(fù)染3～5min）。

1.3分離與鑒定

分離與鑒定參照《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版中的細(xì)菌鑒定方法，取咖啡色膿液接種血平板（SBA）、巧克力平板、和麥康凱（MAC）培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24、48h……觀察菌落。另取膿液直接涂片革蘭染色鏡檢。將血平板（培養(yǎng)48h菌落）上送廣州金域檢驗(yàn)中心做質(zhì)譜技術(shù)鑒定和靶向DNA測(cè)序（16SrRNA基因擴(kuò)增）鑒定細(xì)菌，同時(shí)采用微量生化鑒定管對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行測(cè)定，并延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間5d看結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1臨床治療與結(jié)果

此患者入院急診行“右食指膿腫切開引流手術(shù)”，術(shù)后經(jīng)驗(yàn)給藥：給予“頭孢噻肟鈉/舒巴坦鈉”抗感染、“七葉皂苷鈉”消腫止痛、“血栓通”改善循環(huán)等對(duì)癥治療效果不好，術(shù)口換藥時(shí)有膿性分泌物滲出，患者右手掌腫脹無(wú)好轉(zhuǎn)并前臂稍紅腫，夜間疼痛不能安睡，感染控制欠佳，后細(xì)菌培養(yǎng)經(jīng)靶向DNA鑒定為克羅彭斯特諾卡菌，依據(jù)《熱病》[3]調(diào)整抗菌藥，口服大劑量磺胺甲基異惡唑，定時(shí)清洗引流術(shù)口，術(shù)口逐步愈合，出院后仍堅(jiān)持服藥，定期隨防無(wú)復(fù)發(fā)。

2.2細(xì)菌表型特征

送檢的咖啡色膿液直接涂片進(jìn)行革蘭染色見大量白細(xì)胞及呈90°分枝角革蘭氏陽(yáng)性分枝菌絲（見圖1），末端不膨大，遂又加染抗酸及弱抗酸涂片，結(jié)果抗酸染色菌體為陰性，弱抗酸染色菌體為陽(yáng)性：大量白細(xì)胞藍(lán)色背景下呈90°分枝角的紅色分枝菌絲[4-5]（見圖2）。

圖1　膿液涂片，克羅彭斯特諾卡菌（革蘭染色×1000）

圖2　膿液涂片，克羅彭斯特諾卡菌 （改良抗酸染色×1000）

35℃需氧培養(yǎng)48h后，在血平板及巧克力平板上可見較純細(xì)小菌落，白色粗顆粒樣，表面干燥，無(wú)溶血現(xiàn)象，時(shí)間延長(zhǎng)則菌落出現(xiàn)淡黃色且起皺褶，表面出現(xiàn)粉狀菌絲，堆疊如皮革樣（血平板上較平坦少皺褶，見圖3；巧克力平板及普通瓊脂較多皺褶，見圖4），但無(wú)嵌入培養(yǎng)基內(nèi)現(xiàn)象，整個(gè)菌落不易乳化，菌落涂片后菌體形態(tài)結(jié)果與膿液直接涂片圖1、圖2一致，菌落有輕微泥土氣息。在麥康凱培養(yǎng)基不長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)形成白色菌膜，浮于液面，不易乳化，液體澄清。

圖3　克羅彭斯特諾卡菌 SBA6d

圖4　克羅彭斯特諾卡菌 巧克力平板6d

2.3普通生化反應(yīng)

酶（+）、葡萄糖（+）、七葉苷（+）、甘露醇（-）、肌醇（-）、明膠（-）、尿素酶（+）。

該菌的這些種種形態(tài)學(xué)特征、菌落生化特性，高度懷疑為諾卡菌。

2.4質(zhì)譜分析

對(duì)該分離疑為諾卡菌的菌株本實(shí)驗(yàn)室無(wú)相應(yīng)的配套板條鑒定，做質(zhì)譜，質(zhì)譜鑒定不出，原因可能是因?yàn)橘|(zhì)譜庫(kù)里邊缺少這些少見菌菌株信息，有待完善。

2.516S rRNA擴(kuò)增后測(cè)序

由于本微生物室條件有限，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離疑為諾卡菌的菌株，上送廣州金域檢驗(yàn)做靶向DNA測(cè)序鑒定細(xì)菌，通過16S rRNA基因擴(kuò)增后，在約1500pb處可見單一清晰目的條帶，再用ABI公司的3730XL測(cè)序儀檢測(cè)，產(chǎn)物序列片段結(jié)果經(jīng)NCBI（National Center of Biotechnology Information ，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）的BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，與克羅彭斯特諾卡菌（GenBank No.DQ157924.2）的同源性達(dá)100%，說明擴(kuò)增片段為目的基因。

3　討論

諾卡菌存在于土壤等自然環(huán)境中，為腐生性，為臨床不常見病原菌。主要由呼吸道、手術(shù)、外傷病原菌侵入機(jī)體，引起化膿性感染或肉芽腫性疾病，好發(fā)于肺部、足[6]和腿部（局限型），尤其對(duì)免疫力低下者易形成感染，感染后可播散到全身及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（播散型）。一般局限者預(yù)后佳，播散型者預(yù)后差，死亡率高，有報(bào)道諾卡菌顱內(nèi)感染死亡率為100%，肺部感染為41%，播散性感染為64%[7]。Nocard于1888年首次鑒定出諾卡菌，國(guó)內(nèi)自1964年以來(lái)陸續(xù)有報(bào)道，近年來(lái)諾卡菌病呈上升趨勢(shì)。我國(guó)諾卡菌病患者的老年人數(shù)量較多[8]，隨著逐漸進(jìn)入老年化社會(huì)，發(fā)病率也越來(lái)越高，這與老年人免疫功能低下相關(guān)。本病例也是一位老年人，原始病灶是手，國(guó)內(nèi)外罕見報(bào)道，經(jīng)靶向DNA測(cè)序鑒定的克羅彭斯特諾卡菌，國(guó)內(nèi)外也鮮見報(bào)道，因?yàn)榇司晔?014年新入庫(kù)NCBI的諾卡菌種，分離自肺移植患者肺部感染標(biāo)本[9]。

諾卡菌隸屬于細(xì)菌域、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科（Nocardiaceae），目前屬內(nèi)有89種[7]。諾卡菌屬革蘭染色陽(yáng)性或不定，不形成芽孢、無(wú)鞭毛。改良抗酸染色為弱陽(yáng)性，原始標(biāo)本直接涂片?？梢娋哂性\斷意義的呈90°分枝角的菌絲。培養(yǎng)為嚴(yán)格需氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基、沙保羅瓊脂即可緩慢繁殖生長(zhǎng)，初代分離常需孵育一周，在室溫或35℃普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48h才能看到針尖大小的菌落，并常會(huì)被一些其他普通大菌落覆蓋，在常規(guī)檢驗(yàn)中很容易被遺漏，需要與原始標(biāo)本涂片（特別是痰涂片）及臨床（懷疑諾卡菌）相結(jié)合，所以接收到標(biāo)本時(shí)建議在常規(guī)接種的同時(shí)涂片，在顯微鏡下見到G+桿菌呈分枝狀或革蘭氏染色著色不均勻的絲狀菌時(shí)，需要高度懷疑并延長(zhǎng)標(biāo)本培養(yǎng)時(shí)間觀察，否則容易造成漏診。培養(yǎng)三到四天該菌屬菌落表面干燥白色，或淡黃色，且該菌屬在不同培養(yǎng)基或不同時(shí)間菌落形態(tài)差異很大[4]（見圖3 ～ 4），不溶于生理鹽水（不易乳化），還可見淡黃色粗顆粒邊緣嵌入培養(yǎng)基中（俗稱咬瓊脂），但本病例中的克羅彭斯特諾卡菌例外（沒咬瓊脂現(xiàn)象）。

另外，諾卡菌在生長(zhǎng)和形態(tài)上的特點(diǎn)與非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）及鏈霉菌很相似，臨床上肺部諾卡菌病與肺部結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）病癥狀相似，容易引起誤診[10]，主要區(qū)別在于結(jié)核分支桿菌普通抗酸染色法抗酸性強(qiáng)，鹽酸乙醇不易脫色，諾卡菌抗酸染色弱陽(yáng)性，易被鹽酸乙醇脫色[11]，用弱抗酸染色法可以區(qū)分諾卡菌屬與分枝桿菌屬。諾卡菌與鏈霉菌的區(qū)別見表1。

表1　諾卡菌與鏈霉菌匠鑒別要點(diǎn)

諾卡菌因?yàn)槠渖磻?yīng)不典型，臨床少見，生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致傳統(tǒng)的分類、鑒定方法（形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)）可靠性不強(qiáng)，而且鑒定此菌種耗時(shí)費(fèi)力、低效，難以滿足臨床需求。近幾年新興的質(zhì)譜分析法暫還只能覆蓋常見菌種，而少見菌種等信息不夠齊全，仍有待完善，因此，最受矚目的仍然是遺傳學(xué)——分子生物學(xué)的診斷方法[12]，如靶向DNA測(cè)序（16S rRNA基因擴(kuò)增）鑒定。細(xì)菌16S rRNA的相對(duì)分子量大小適中，約1500bp，適合序列分析，又因其含有對(duì)所有細(xì)菌種及可變區(qū)的廣泛區(qū)段[13]，因此16S rRNA基因成為細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定的理想靶序列，也廣泛被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受和使用[14]。所以在DNA序列分析中，16S rRNA最常用于鑒定細(xì)菌的種，可以快速、簡(jiǎn)便、特異性好，準(zhǔn)確地診斷諾卡菌到種，也是目前對(duì)克羅彭斯特菌諾卡菌這些臨床少見菌的鑒定、檢測(cè)和新菌種發(fā)現(xiàn)方面最可靠的方法之一[1]。

本例患者為手局部感染，臨床醫(yī)生根據(jù)《熱病》[3]建議，首選采用復(fù)方新諾明（TMP-SMX）治療、清創(chuàng)處理皮膚壞死組織，隨后患者病情好轉(zhuǎn)，局部感染癥狀減輕，鞏固治療后出院，定期隨防無(wú)復(fù)發(fā)?！稛岵　穂3]對(duì)于諾卡菌的治療首選藥物為磺胺類藥物，但磺胺類藥物會(huì)引起不良反應(yīng)包括胃腸道癥狀、皮膚癥狀、腎功能損害、肝毒性和骨髓抑制。尤其在艾滋病患者不良反應(yīng)的發(fā)生率更高。所以對(duì)于磺胺類藥物過敏、發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)、對(duì)磺胺類藥物耐受或治療失敗時(shí)的患者應(yīng)更換其他敏感抗生素，如亞胺培南、利奈唑胺、阿米卡星、第三代頭孢菌素等進(jìn)行治療。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征、菌落生化特性[15]結(jié)合遺傳學(xué)分析（16S rRNA基因擴(kuò)增后做靶向DNA測(cè)序）鑒定諾卡菌屬，可及時(shí)、準(zhǔn)確鑒定出克羅彭斯特諾卡菌這類生長(zhǎng)緩慢、罕見細(xì)菌，對(duì)諾卡菌病的確診、治療、預(yù)后有著重大意義。

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The identification on an uncommon infection of Nocardia Kroppenstedtii in hand

ZHOU Shijuan
Huidong County People's Hospital,Huidong 516300,China

Objective To explore the method to identify the rare Nocardia Kroppenstedtii. Methods After isolating a strain from a patient’s hand, the method of combining bacterial morphology, colony biochemical characteristics analysis, genetic analysis (such as mass spectrometry, sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) etc. were used for the identification. Results Observed through microscope,the rare bacteria by the clinical isolates had typical cell feature (the result of Gram stain shows 90° branching angle and G+branching hyphae and improved Kinyoun staining shows positive result),slow growth in blood agar and chocolate plate, small colonies, extended time to fold, catalase positive, breakdown of glucose, Esculin, urease, not broken down mannitol, inositol, gelatin. Then a comprehensive analysis included targeting DNA sequencing after 16S rRNA gene amplification was analyzed, and it was finally identified as Nocardia Kroppenstedtii. Conclusion Morphology observation, colony sublimation characteristic analysis and genetic analysis (such as sequencing targeting DNA after 16S rRNA gene amplification) any laboratory can identify Nocardia and can quickly, accurately identify Nocardia Kroppenstedtii, which is a type of rare strain with slow growth.

16S rRNA;Sequencing;Nocardia Kroppenstedtii

R446.5

B

2095-0616（2016）18-221-04

廣東省惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20160806）。

（2016-07-14）