基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測(cè)

王 晨，曾檢華，秦 珂，何祖勇，陳瑤生，劉小紅

（1．中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號(hào)食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測(cè)

王 晨1，曾檢華2，秦 珂1，何祖勇1，陳瑤生1，劉小紅1

（1．中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號(hào)食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

廣東小耳花豬是廣東省飼養(yǎng)量最大的地方豬品種，農(nóng)戶自繁自養(yǎng)過程中可能混入外來豬種血緣，實(shí)際生產(chǎn)中主要通過表型進(jìn)行評(píng)估和選育。CYB5A基因啟動(dòng)子中的突變位點(diǎn)可以鑒定中外豬種遺傳背景，因此可通過分子方法檢測(cè)廣東小耳花豬群體中是否混有外來豬種血緣。采用PCR擴(kuò)增CYB5A基因啟動(dòng)子并進(jìn)行單向直接測(cè)序，將得到的基因序列進(jìn)行對(duì)比以鑒定變異位點(diǎn)。結(jié)果顯示，32頭種豬和36頭后備母豬中均有1頭為雜合子AB型，A等位基因頻率分別為0.0152和0.0139，其余種豬和后備母豬均為中國(guó)豬種純合子BB型。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，種豬和后備母豬群體在檢測(cè)位點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），表明外來豬種該位點(diǎn)在廣東小耳花豬群體內(nèi)沒有受到人工選擇。該AB型種母豬毛色表型正常，與純種廣東小耳花豬BB型公豬配種生出6頭毛色異常仔豬，其中2頭為雜合子AB型。該種母豬與杜洛克公豬配種后生出紅毛仔豬，該雜交后代的表型也驗(yàn)證其混有外來豬血緣，表明分子鑒定的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明，廣東小耳花豬群體的血統(tǒng)基本純正，只有極少數(shù)個(gè)體混有外來豬種血緣，通過表型選擇與分子輔助育種相結(jié)合的方法可以準(zhǔn)確、快速地提純?cè)摰胤狡贩N。

廣東小耳花豬；CYB5A基因；外來豬種；檢測(cè)

我國(guó)是世界豬肉生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，擁有豐富的豬品種資源（共125個(gè)），約占世界豬品種總數(shù)的1/3，其中地方品種88個(gè)［1］。廣東小耳花豬是廣東省飼養(yǎng)量最大的地方豬種之一，主產(chǎn)于廣東西江以南及粵西一帶。該豬品種的頭型和體型均較小，具有頭短、耳短、頸短、身短、腳短和尾短的“六短”特征，被毛表現(xiàn)為黑白花，除了頭、耳、背、腰、臀部為黑色外，其余均為白色。廣東小耳花豬能適應(yīng)高溫多濕的環(huán)境、耐粗飼、早熟易肥、皮薄肉嫩、肉味鮮美、母性溫順、繁殖力強(qiáng)，屬于典型的華南型豬種。近年來，隨著生活水平的提高，人們對(duì)豬肉品質(zhì)的要求越來越高，使得地方優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源得到越來越多的重視和開發(fā)利用。

微粒體細(xì)胞色素b5A（Cytochrome b5A，CYB5A）是微粒體細(xì)胞色素b5（Cytochrome b5，CYB5）的組成成員。CYB5在動(dòng)植物中普遍存在，是一種重要的電子轉(zhuǎn)移血紅素蛋白。在豬上，CYB5A基因在雄烯酮合成上起著重要作用［2］，公豬的膻味主要是由于糞臭素和雄甾烯酮引起的，因此CYB5A基因的高表達(dá)量可能與公豬肉質(zhì)的膻味有關(guān)［3］。研究表明，由于中國(guó)地方豬易早熟的特性，使得豬體內(nèi)的膻味積累水平比歐洲豬種高［4］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，CYB5A基因的編碼區(qū)不存在遺傳變異，而在ATG起始密碼子上游8 bp處存在一個(gè)G＞T的SNP，并表明該SNP與脂肪雄甾烯酮水平相關(guān)［5］，造成雄甾烯酮積累［6］。Bai等［7］發(fā)現(xiàn)在CYB5A基因起始密碼子的上游共有3個(gè)SNP 位點(diǎn)（-660 bp、-380 bp 和-69 bp），改變了轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合的能力。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)歐洲豬種主要是單倍型A，在-660 bp、-380 bp、-69 bp 處堿基分別為G、T、C，而中國(guó)豬種主要是單倍型B，各變異位點(diǎn)分別為單堿基缺失、C、T。因此，該3個(gè)位點(diǎn)可以用來鑒定中國(guó)豬種和外來豬種不同的遺傳背景［8］。

地方豬遺傳資源是培育新品種、新品系以及保護(hù)生物多樣性的重要基礎(chǔ)，是養(yǎng)豬業(yè)今后可持續(xù)發(fā)展的重要保障。近30年來，由于大量引進(jìn)外來豬種，幾乎導(dǎo)致了每個(gè)地方豬品種的數(shù)量急劇減少甚至消失，外來豬種與地方品種雜交亂配，造成一些品種的部分群體遺傳資源混雜。地方豬保種場(chǎng)內(nèi)的種豬均來自于農(nóng)戶的自繁自養(yǎng)，毛色表型是評(píng)估廣東小耳花豬血統(tǒng)是否純正的重要指標(biāo)之一。在實(shí)際生產(chǎn)中，廣東小耳花豬群體中偶爾會(huì)出現(xiàn)毛色異常個(gè)體，通常采取表型剔除方式進(jìn)行品種提純和保護(hù)。本試驗(yàn)對(duì)廣東小耳花豬種豬CYB5A基因啟動(dòng)子的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在分子水平鑒定該品種的遺傳背景中是否混有外來豬種血緣，從而了解其群體資源的保護(hù)現(xiàn)狀，為今后該品種的保護(hù)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣東小耳花豬耳組織樣品采自廣東壹號(hào)食品股份有限公司湛江豬場(chǎng)，其中采集了成年種豬32頭、后備母豬36頭、同一窩全同胞仔豬6頭，74份耳組織樣品用剪耳鉗采集后，用PBS溶液清洗干凈，保存在75%乙醇中，放置于-80℃冰箱中備用。

試驗(yàn)主要試劑：2×Taq PCR StarMix（包含Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer）購自GenStar公司，DNA Marker DS 2000購自廣州東盛生物科技有限公司，Gelview型核酸染料購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測(cè) 采用SDS法提取基因組DNA，提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，最終稀釋成100 ng/μL，放置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 參照Bai等［7］設(shè)計(jì)的引物（CYB5-F：5'AAGGAG GAGGTAAGCAATG3'，CYB5-R：5'GAGATG AGCGGAACAGAGT3'）對(duì)CYB5A基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增（預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度為917 bp），引物由生工生物工程（廣州）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用2×Taq PCR StarMix，反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 2 min，33個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.3 序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。使用Chromas 2.22軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，再使用MAGE 5.05軟件進(jìn)行序列比對(duì)，檢測(cè)遺傳變異位點(diǎn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)廣東小耳花豬群體的基因型分布和等位基因頻率，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行各群體內(nèi)Hardy-Weinberg平衡適合性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

對(duì)74份廣東小耳花豬DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增CYB5A基因的啟動(dòng)子序列，PCR產(chǎn)物用1.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，PCR產(chǎn)物為特異性單一條帶，片段大小為917 bp，符合預(yù)期大小。

圖1 CYB5A基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 -380 bp處C＞T突變

2.2 測(cè)序結(jié)果分析

由于CYB5A啟動(dòng)子區(qū)域中的3個(gè)SNP 位點(diǎn)（-660 bp、-380 bp 和-69 bp）在同一個(gè)個(gè)體中均相同，存在明顯的連鎖情況［8］，因此本試驗(yàn)僅使用反向引物CYB5-R進(jìn)行單向測(cè)序。但-69 bp處T＞C靠近反向引物而無法檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果可以鑒定-380 bp處C＞T突變和-660 bp處單堿基缺失＞G突變。運(yùn)用軟件Chromas 2.22分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有1頭種母豬、1頭后備母豬以及2頭仔豬在380 bp（圖2）和-660 bp（圖3）處分別出現(xiàn)一個(gè)雙峰和連續(xù)雙峰，表明在380 bp處存在單堿基突變，而在-660 bp處存在插入/缺失。采用外來豬種約克夏豬的序列（GenBank登錄號(hào)：KM067157.1）作為參考序列，利用序列比對(duì)軟件Mega 5.05將參考序列與74個(gè)個(gè)體測(cè)得的序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，在32頭成年豬和36頭后備母豬中各有1頭母豬為雜合子AB型，A等位基因頻率分別為0.0152和0.0139，其余均為中國(guó)豬種純合子BB類型。6頭仔豬為雜合子AB型種母豬的全同胞后代，其中有2頭為雜合子AB型，其余均為中國(guó)豬種純合子BB類型（表1）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，種豬、后備母豬以及仔豬在這兩個(gè)位點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

圖3 -660 bp處單堿基缺失＞G突變

表1 廣東小耳花豬CYB5A基因型檢測(cè)結(jié)果

2.3 雜交結(jié)果分析

雜合子AB型的種母豬表型為正常廣東小耳花豬毛色（圖4A，封三），與BB型的廣東小耳花豬種公豬交配后，生出20頭仔豬，其中6頭仔豬毛色異常，呈現(xiàn)無規(guī)律的大小不一的黑色斑點(diǎn)（圖4B，封三），而非一整塊黑色，即非典型廣東小耳花豬毛色表型。對(duì)6頭毛色異常仔豬檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AB型有2頭，其余均為BB型。正常情況下，純種廣東小耳花豬母豬與杜洛克公豬雜交，后代均為全黑色個(gè)體或者部分白腳的毛色表型（圖4D，封三）。然而，該雜合子AB型種母豬與杜洛克公豬進(jìn)行雜交后，后代中出現(xiàn)了類似杜洛克的紅色毛發(fā)個(gè)體（圖4C，封三），兩個(gè)組合后代表型均表明該種母豬確實(shí)混有外來豬的血緣。

3 討論

廣東小耳花豬是優(yōu)良的地方豬種，肉質(zhì)鮮美，但生長(zhǎng)速度緩慢，日增重僅為260 g，瘦肉率為30.97%。實(shí)際生產(chǎn)中，通常將廣東小耳花豬作為母本，與杜洛克、長(zhǎng)白豬進(jìn)行經(jīng)濟(jì)雜交生產(chǎn)杜×長(zhǎng)×小耳花豬，商品豬既保留了母本皮薄肉嫩的特點(diǎn)，而且提高了日增重和瘦肉率［9］。因此，在利用廣東小耳花豬作為母本進(jìn)行開發(fā)利用時(shí)，部分個(gè)體可能會(huì)導(dǎo)入外來豬種血緣，使得其品種資源混雜。Bai等［7］檢測(cè)了11種國(guó)內(nèi)地方豬的CYB5A基因的啟動(dòng)子，其中屬于華南型的藍(lán)塘豬和五指山豬、屬于華中型的上高豬、屬于江海型的嘉興黑豬以及浙江和江西地區(qū)的野豬全部均為BB型。然而，屬于華北型的民豬、漢江豬、里岔黑豬，屬于江海型的金華豬，屬于高原型的藏豬，屬于西南型的黔北黑豬和內(nèi)江豬以及東北野豬均檢測(cè)出一定基因頻率的A單倍型，其中里岔黑豬A單倍型頻率最高，這與其品種形成過程中摻入外來豬種有關(guān)。外來豬種主要是歐洲豬種，其馴化與中國(guó)地方豬種是相互獨(dú)立的過程［10］。Ai等［11］通過全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)中國(guó)地方豬為適應(yīng)南北方溫度，導(dǎo)致北方豬種基因組中很多位點(diǎn)與歐洲豬種相同，而與南方豬種之間存在差異。因此，廣東小耳花豬作為華南型豬種，其CYB5A基因的啟動(dòng)子基因型應(yīng)該為BB型。本試驗(yàn)利用CYB5A基因進(jìn)行檢測(cè)廣東小耳花豬種豬群體及其部分后代，僅發(fā)現(xiàn)2頭母豬為雜合子AB型以及2頭仔豬是雜合子AB型。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，這兩個(gè)位點(diǎn)在種豬和后備母豬群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），表明外來豬種血緣沒有受到人工選擇。通過分子檢測(cè)，可以直接剔除該雜合個(gè)體進(jìn)行品種提純。

豬的毛色有多種類型，包括野豬色、全黑色、全白色、全紅色、兩頭烏、烏云蓋雪、六白和黑白花豬等。研究表明，影響豬毛色的基因主要有黑素皮質(zhì)素受體1（melanocortin receptor 1 gene，MC1R）［12］、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrosinase-related protein 1，TYRP1）［13］、v-kit貓科肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因（v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog，KIT）［14］、刺鼠信號(hào)蛋白（agouti signaling protein，ASIP）［15］和內(nèi)皮素受體B基因（endothelin receptor B gene，DNRB）［16］等。本次檢測(cè)的雜合子AB型廣東小耳花豬母豬毛色表型正常，分別與廣東小耳花豬公豬和杜洛克公豬交配后，兩次生產(chǎn)的仔豬均出現(xiàn)毛色異常的個(gè)體，同窩內(nèi)出現(xiàn)毛色分離現(xiàn)象，驗(yàn)證該母豬的血統(tǒng)不純。CYB5A基因位于1號(hào)染色體上，而很多毛色相關(guān)基因位于其他染色體上，滲入的外來豬基因在廣東小耳花豬群體中會(huì)發(fā)生染色體自由重組與分離。因此，單一對(duì)CYB5A基因啟動(dòng)子中的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，僅能鑒定出中外豬品種的遺傳背景，而無法判斷雜合AB型個(gè)體中混有外來豬種的毛色基因。探究本試驗(yàn)中仔豬出現(xiàn)了毛色分離現(xiàn)象，還需要進(jìn)一步對(duì)多個(gè)毛色基因位點(diǎn)分析，才能判斷雜種母豬中混有的外來豬種毛色基因。

本研究結(jié)果表明廣東小耳花豬群體的血統(tǒng)基本純正，只有極少數(shù)個(gè)體混有外來豬種血緣，通過表型選擇與分子輔助育種相結(jié)合的方法可以準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行品種提純，為廣東小耳花豬群體以及其他地方豬種保護(hù)提供科學(xué)的理論依據(jù)，防止地方品種中潛在優(yōu)良基因資源的流失。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Detection of genetic background of Guangdong Small-ear Spotted pig population by CYB5A gene

WANG Chen1，ZENG Jian-hua2，QIN-Ke1，HE Zu-yong1，CHEN Yao-sheng1，LIU Xiao-hong1
（1. School of Life Sciences，Sun Yat-sen University/State Key Laboratory of Biocontrol and Resources Utlization，Guangzhou 510006，China；2. Guangdong YIHAO Food Co.，Ltd.，Guangzhou 510620，China）

Guangdong Small-ear Spotted pig is the largest local pig breed raised in Guangdong province. This pig breed can be mixed with genes from exotic pigs during the rearing process by famers，and it is usually evaluated and bred through phenotype in actual production. Mutations in CYB5A gene promoter region could be applied in identifing different genetic backgrounds of Chinese and exotic pig breeds，so we detected Guangdong Small-ear Spotted pig population by molecular method to identify whether this breed was mixed with exotic pig breeds. CYB5A gene was amplified by PCR method and sequenced only by one direction，then the DNA sequences were analyzed to identify the mutations. The results showed that both 32 breeding pigs and 36 gilts had one heterozygotes of ABgenotype respectively and A allele frequency was 0.0152 and 0.0139，the remaining pigs were Chinese pig breed type of BB genotype. The 32 breeding pigs and 36 gilts were under Hardy-Weinberg equilibrium（P＞0.05） by Chi-Square tests，it indicated that the mutations from exotic pig breeds were not under human selection in Guangdong Small-ear Spotted pig population. The heterozygous sow had normal phenotype，it was mated with a pure Guangdong Small-ear Spotted boar and produced six abnormal colour pattern piglets，and two of them were heterozygotes of AB genotype by the detection. The heterozygous sows were also mated with a pure duroc boar and produced red coat piglets，which also validated that the sow was heterozygous and the molecular method was accurate. The results demonstrated that most of the Guangdong Small-ear Spotted pigs were purebreed，only a few individuals had been introgressed from exotic pig breeds. Combined phenotype selection with molecular-assisted selection methods，the local pig breed could be purified quickly and accurately.

Guangdong Small-ear Spotted pig；CYB5A gene；exotic pig breed；detection

S813；Q346+.5

A

1004-874X（2016）11-0122-05

2016-08-17

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2014FY120800）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B020202001）；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃（2014YT02H042）

王晨（1988-），男，在讀博士生，E-mail: chenwangias@gmail.com

劉小紅（1970-），男，博士，研究員，E-mail：liuxh8@mail.sysu.edu.cn

王晨，曾檢華，秦珂，等. 基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測(cè)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：122-126.