杜雪玲，余如剛，宋運賢，張慧君

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽省資源植物學(xué)重點實驗室，安徽 淮北 235000）

植物生長物質(zhì)和水解乳蛋白對蓖麻再生體系建立的影響

杜雪玲，余如剛，宋運賢，張慧君

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽省資源植物學(xué)重點實驗室，安徽 淮北 235000）

為篩選蓖麻再生體系建立的最佳配方，本研究以云雜N-2蓖麻種子為供試材料，對蓖麻種子消毒后，取胚軸分別接種在MS（Murashige and Skoog）為基本培養(yǎng)基上，并附加不同濃度的IAA（0.1 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L）、6-BA（0.5 mg/L、0.7 mg/L和0.9 mg/L）及不同濃度水解乳蛋白（0 mg/L、250 mg/L、500 mg/L和750 mg/ L），進行愈傷組織培養(yǎng)和分化培養(yǎng).結(jié)果表明：在IAA濃度為0.3 mg/L、6-BA濃度為0.7 mg/L時蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率最高為80%；在IAA和6-BA濃度最適，水解乳蛋白的濃度為500 mg/L時，愈傷組織生長狀況最佳，呈淡黃色，褐化程度低；誘導(dǎo)芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA，芽的增殖系數(shù)達6.15.

蓖麻；植物生長物質(zhì)；水解乳蛋白；愈傷組織；芽增殖

0 引言

蓖麻耐酸堿性強，有機物質(zhì)含量豐富，排水效果好且培養(yǎng)方便，最重要的一點是蓖麻油可生產(chǎn)柴油，因此蓖麻成為許多研究的熱點.目前國內(nèi)外關(guān)于蓖麻方面的一些研究已取得一定的進展，例如嚴興初等［1］對蓖麻作為能源開發(fā)的現(xiàn)狀與前景進行研究.文獻［2-3］對蓖麻組織培養(yǎng)進行研究，張利明等［4］對蓖麻組織培養(yǎng)和植株再生進行研究.此外還有文獻［5-6］對蓖麻的用途與栽培技術(shù)及我國蓖麻良種選育研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略進行研究等.另外，文獻［7-9］分別研究植物生長物質(zhì)、水解乳蛋白對小麥花粉愈傷組織和芋芽繼代培養(yǎng)的影響，而植物生長物質(zhì)和水解乳蛋白對蓖麻愈傷組織的影響還未見報道.本實驗是以云雜N-2蓖麻種子為試材，研究不同濃度的植物生長物質(zhì)（生長素IAA、細胞分裂素6-BA）及不同濃度的水解乳蛋白對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率及生長情況的影響，旨在為獲得大量高品質(zhì)的蓖麻愈傷組織，獲得再生植株及對蓖麻品種遺傳改良奠定基礎(chǔ).

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

蓖麻種子：云雜N-2.

1.2 啟動培養(yǎng)（無菌體系的建立）

1.2.1 蓖麻種子的篩選

選取籽粒飽滿，無病蟲害感染、無機械損傷、大小相近的蓖麻種子.

1.2.2 蓖麻種子的消毒

將蓖麻種子流水下沖洗30 min，然后用75%的酒精消毒30 s，用無菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞浸泡消毒8～10 min［10］，最后用無菌水沖洗3～4次.用升汞消毒時一定要把握好浸泡時間，以免時間過短達不到消毒的效果，時間過長會殺死蓖麻種子，影響蓖麻愈傷組織的誘導(dǎo)率.種子消毒后用干燥的無菌吸水紙吸干，放入無菌操作臺上的滅菌培養(yǎng)皿中待用.

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)

分別將脫毒處理后的不去皮蓖麻種子、去皮蓖麻種子以及經(jīng)解剖得到的完整幼胚分別接種于MS+ 0.1 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，每種材料接種20瓶，每瓶4個，預(yù)培養(yǎng)一周并觀察其生長狀況，統(tǒng)計污染率，通過比較得出最佳外植體.

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo)及叢生芽的分化

取預(yù)培養(yǎng)一周的胚軸接種到添加不同濃度的6-BA和IAA（見表1）及不同濃度的水解乳蛋白（見表2）的MS培養(yǎng)基中，瓊脂6 g/L，蔗糖為30 g/L，pH為5.8，每個處理接種8瓶，每瓶接種3個.遮光培養(yǎng)，室溫25±2℃、相對濕度70%～80%.接種2～4周后分別統(tǒng)計蓖麻愈傷組織的誘導(dǎo)率，并觀察記錄各組愈傷組織的生長情況.將含有芽體的愈傷組織接種到添加不同濃度植物生長物質(zhì)6-BA（0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L）和NAA 0.02 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12 h光照培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計芽的增殖情況.

蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的材料數(shù)/總的接種材料數(shù)×100%

表1 IAA和6-BA對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)的配方

表2 水解乳蛋白對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)的配方

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織培養(yǎng)中植物生長物質(zhì)雙因子濃度試驗的結(jié)果與分析

2.1.1 不同外植體下的污染率

表3 不同外植體的污染率統(tǒng)計

由表3可知，完整的云雜N-2號蓖麻種子有外阜，若不去皮，脫毒效果最差，污染率最高；將種子脫去外殼，相同脫毒方法下，污染率明顯降低，發(fā)芽率升高；將種子縱向剖開，取其胚作為外植體污染率極低，并可快速得到幼苗或愈傷組織，大大縮短培養(yǎng)周期.

圖1 去皮種子接種一周后（A）；整胚接種一周后（B）

不去皮的種子其污染率最高，生長最緩慢，主要原因是長期進化過程中，有些品種的蓖麻種子形成外阜，及其堅硬的外殼都對種子的殺菌消毒有阻隔作用，若去皮，污染率大大降低，但生長仍緩慢；解剖后的胚在接種兩天后開始明顯生長膨脹，污染率極低（見圖1）.

2.1.2 不同濃度的6-BA和IAA對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計，在6-BA濃度分別為0.5 mg/L、0.7 mg/L和0.9 mg/L，IAA濃度不同時蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率如圖2所示.

圖2 IAA對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響A.6-BA濃度為0.5 mg/L；B.6-BA濃度為0.7 mg/L；C.6-BA濃度為0.9 mg/L

由圖2可知，在6-BA濃度分別為0.5 mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L時，相同的培養(yǎng)時間愈傷組織誘導(dǎo)率隨著IAA的濃度增加先增加后降低.不同的培養(yǎng)時間觀察并計算得到的愈傷組織誘導(dǎo)率隨IAA的濃度增加的變化趨勢相同，均在IAA濃度為0.3 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，且在6-BA濃度為0.7 mg/L最高，為80%，其余8組蓖麻愈傷組織的誘導(dǎo)率均低于80%，其中蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)率最低的一組是7組，為37.5%.最終得出蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)較適植物生長物質(zhì)濃度為IAA濃度0.3 mg/L，6-BA濃度0.7 mg/L.

2.1.3 不同濃度的植物生長物質(zhì)對蓖麻愈傷組織生長狀況的影響

培養(yǎng)4周后觀察并記錄不同濃度IAA和6-BA培養(yǎng)基上愈傷組織生長情況如表4和圖3.

表4 培養(yǎng)4周后IAA和6-BA對愈傷組織的顏色、質(zhì)地、生長情況的描述

圖3 IAA和6-BA對蓖麻愈傷組織生長的影響

由表4和圖3對比得出：在添加IAA為0.3 mg/L、6-BA為0.7 mg/L的MS培養(yǎng)基上（5組）的蓖麻愈傷組織相對于其他8組蓖麻愈傷組織的生長情況較好（如圖3），其呈淡黃色，質(zhì)地較其他組疏松，生長迅速，表面呈大的顆粒狀，且體積最大，其他幾組的蓖麻愈傷組織呈淡黃色中帶有淡綠色，質(zhì)地堅硬，生長較緩慢，長勢較差.

2.1.4 愈傷組織培養(yǎng)中水解乳蛋白單因子濃度試驗結(jié)果與分析

在基本培養(yǎng)基MS附加IAA 0.3 mg/L和6-BA 0.7 mg/L的培養(yǎng)基中，加入不同濃度的水解乳蛋白，4周后觀察愈傷組織的生長情況如表4.由表5可知，水解乳蛋白在0～500 mg/L（不包含500 mg/L）濃度范圍抑制愈傷組織的生長，使蓖麻愈傷組織發(fā)生褐化，而500～750 mg/L（包含500 mg/L）的濃度范圍內(nèi)則促進愈傷組織的生長，且有效的抑制蓖麻愈傷組織的褐化程度.其中，水解乳蛋白濃度在500 mg/L時愈傷組織生長最好.

表5 培養(yǎng)4周后水解乳蛋白對蓖麻愈傷組織顏色、質(zhì)地及生長情況的描述

2.2 不同植物生長物質(zhì)濃度配比對芽增殖的影響

表6 6-BA對蓖麻芽增殖的影響

由表6可知，不同濃度6-BA和NAA的組合均能夠促進芽的增殖，當(dāng)6-BA濃度為0.1 mg/L時，芽增殖率較低，芽較細長且發(fā)黃；隨著6-BA濃度的升高，不定芽增殖系數(shù)也逐漸增高，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，芽的增殖系數(shù)達到最高位6.15，且此時芽體粗壯；當(dāng)6-BA濃度高于0.5 mg/L時芽增殖系數(shù)又開始降低.因此，誘導(dǎo)芽增殖的6-BA濃度為0.5 mg/L（見圖4）.

圖4 愈傷組織分化培養(yǎng)（A）；芽的增殖生長（B）

3 討論

3.1 外植體的選擇

蓖麻組織培養(yǎng)中外植體的選擇一直是研究的難點也是研究的熱點.本研究初期將種子先進行脫毒處理，然后分兩組培養(yǎng)，其中一組在無菌條件下剝?nèi)シN皮.結(jié)果表明去皮接種明顯優(yōu)于帶皮接種，因為去除種皮使得種子吸收營養(yǎng)物質(zhì)和水分變得更加容易，同時減少胚芽脹破種皮的時間，進而促使種子較早萌發(fā).

3.2 試材選擇對蓖麻愈傷組織顏色、生長的影響

蓖麻愈傷組織培養(yǎng)過程中，常選用幼胚作為外植體［2］，其極易被誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但幼胚是由胚根、下胚軸、上胚軸、胚芽、子葉這幾部分組成［13］，而在丁蘭［2］、張慧英等［3］對蓖麻愈傷組織培養(yǎng)中均以胚軸、胚根、胚芽頂、子葉為試材，其中上胚軸和胚芽頂速度最快，胚根和子葉次之.本研究中選用胚進行預(yù)培養(yǎng)一周后選取上胚軸，在研究植物生長物質(zhì)和水解乳蛋白對蓖麻愈傷組織生長影響的實驗中，上胚軸出愈時間較為適合；對不同試材選擇，出愈時間過短可能造成最終現(xiàn)象不明顯，而出愈時間過長可能造成MS培養(yǎng)基成分的大量浪費.并且選擇不同的試材，出愈時愈傷組織的顏色不同.選用子葉、胚芽頂和下胚軸，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為綠色或淡綠色，胚根誘導(dǎo)的愈傷組織大部分為淡黃色，少數(shù)為淡綠色.而本研究中上胚軸的愈傷組織為黃色或淡黃色，且形成的愈傷組織較子葉長勢好.在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著細胞分裂素和生長素濃度比例的增高，愈傷組織長勢較好.

3.3 不同植物生長物質(zhì)對蓖麻愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化的影響

本課題研究不同植物生長物質(zhì)對蓖麻再生的影響，不僅可以進行蓖麻快速繁殖和保存資源，而且為蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ).我國關(guān)于蓖麻愈傷組織培養(yǎng)和植株再生的培養(yǎng)報道相對較少，在本研究結(jié)果中，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，芽的增殖系數(shù)達到最高位，與丁蘭等［2］研究中得出6-BA濃度為0.4 mg/L時適合芽增殖的結(jié)果不符，而與張利明等［4］研究結(jié)果相同.另外，本研究中再生苗的生根結(jié)果不太理想，在后期將進一步研究.

［1］嚴興初，王力軍.蓖麻作為能源開發(fā)的現(xiàn)狀與前景［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（34）：11165，11167.

［2］丁蘭，王濤，景宏偉，等.蓖麻的組織培養(yǎng)［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，46（1）：79-83.

［3］張慧英，韋家川.蓖麻組織培養(yǎng)技術(shù)探究［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2001，20（3）：233-234.

［4］張利明，侯玲玲，李文彬，等.蓖麻組織培養(yǎng)和植株再生的研究［J］.中國油料作物學(xué)報，2009，31（2）：253-255.

［5］王兆木.蓖麻的用途與栽培技術(shù)［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，12（5）：223-225.

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［7］杜希華，孫秀玲，郝崗平，等.不同外植體和激素對銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)和生長的影響［J］.山東師范大學(xué)學(xué)報，2008，23（1）：129-133.

［8］胡琳，許為剛，趙向科.三種氨基酸及水解乳蛋白對小麥花粉愈傷組織發(fā)生能力的影響［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989（6）：25-26.

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［10］陳超，王桂蘭，田立民，等.長壽花胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚狀體再生［J］.園藝學(xué)報，2004，31（2）：249-252.

［11］王震星，楊恩芹，劉貴仁，等.金絲小棗花藥離體培養(yǎng)再生植株研究［J］.河北果樹，1996（3）：9-10.

［12］丁運華，吳天靈，陳兆貴.馬鈴薯莖尖分生組織試管苗再生體系的建立［J］.惠州學(xué)院學(xué)報，2006，26（6）：51-55.

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Effects of Plant Growth Substances and Hydrolyzed Milk Protein on Establishment of Castor Regeneration System

DU Xueling，YU Rugang，SONG Yunxian，ZHANG Huijun
（School of Life Science，Huaibei Normal University，Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology,235000，Huaibei，Anhui，China）

To screen the best formula of the castor callus regeneration system，the seeds of castor（N-2）were used as explants for in vitro regeneration.After surface sterilization of seed，the hypocotyl explants were cul?tured on Murashige and Skoog（MS）basal medium，supplemented with IAA（0.1，0.3 and 0.5 mg/L），6-BA（0.5，0.7 and 0.9 mg/L）and hydrolyzed milk protein（250，500 and 750 mg/L）for induction，culture and dif?ferentiation of callus.As a result，the formula of MS+IAA 0.3 mg/L+6-BA 0.7 mg/L was the highest in cal?lus induction rate（80%）of castor.Based on this result，In hydrolyzed milk protein（500 mg/L），the growth of calli were the best，which were shown pale yellow and soft，and lower browning degree.In addition，the best formula of propagation was MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.02 mg/L，and the multiplication coefficient was 6.15.

castor；plant growth substance；hydrolyzed milk protein；callus；buds propagation

S 565.6

A

2095-0691（2016）04-0069-06

2016-07-10

2014安徽省資源植物學(xué)重點實驗室項目

杜雪玲（1976- ），女，河南扶溝人，副教授，研究方向：植物細胞工程.