趙巖，黃龍輝，李娟，孫蘭超，李燕軍,2,3，謝希賢,2,3，陳寧,2,3

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457）

谷氨酸棒桿菌代謝副產(chǎn)物對α-酮戊二酸積累的影響

趙巖1，黃龍輝1，李娟1，孫蘭超1，李燕軍1,2,3，謝希賢1,2,3，陳寧1,2,3

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津300457）

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中l(wèi)dh基因編碼乳酸脫氫酶，可以催化丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸，ackA和pqo基因編碼乙酸激酶和丙酮酸：醌氧化還原酶，可以催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸。為了研究這三個基因缺失對谷氨酸棒桿菌α-酮戊二酸積累的影響，以C. glutamicum GDK-10為出發(fā)菌株，通過重疊延伸PCR及同源重組技術(shù)分別構(gòu)建ldh，pqo，ackA，pqo和ackA基因缺失突變株GDK-14，GDK-15，GDK-16，GDK-17。對出發(fā)菌及上述重組菌株進行發(fā)酵驗證比較，發(fā)酵結(jié)果表明：ldh和pqo基因缺失菌株的α-酮戊二酸產(chǎn)量分別比出發(fā)菌降低了8.54%和27.9%，而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸產(chǎn)量比出發(fā)菌提高了8.99%。

谷氨酸棒桿菌；基因缺失；α-酮戊二酸；乳酸；乙酸

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）是TCA途徑和氨基酸代謝的中間代謝物，作為谷氨酸、琥珀酸以及雜環(huán)類化合物的前體[1-2]，在重要化合物合成中起著重要作用。同時，α-KG作為一種多功能有機酸，在食品、醫(yī)藥、化工行業(yè)以及科學(xué)研究中都有廣泛的應(yīng)用[3-5]。α-KG制備方法主要有化學(xué)法和微生物發(fā)酵法兩種。目前全球生產(chǎn)α-KG的主要方式是化學(xué)合成法，而微生物發(fā)酵法具有原料成本低、產(chǎn)品得率高、自動化程度高、勞動強度低和技術(shù)改進可能性大等優(yōu)點，有望逐步取代化學(xué)合成法[6]。

從谷氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum GDK-9出發(fā)，敲除谷氨酸脫氫酶編碼基因（gdh）構(gòu)建了菌株GDK-10。該菌株發(fā)酵結(jié)果表明：谷氨酸含量大幅降低，α-KG的積累量明顯增加，但在發(fā)酵過程中生成乙酸、乳酸等副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物對α-KG的積累和產(chǎn)品分離提純產(chǎn)生不利影響。筆者通過分子生物學(xué)手段阻斷乙酸和乳酸的合成途徑，考察對α-KG積累的影響。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）是谷氨酸棒桿菌合成乳酸的關(guān)鍵酶，由ldh基因編碼，在α-KG的生物合成過程中，使碳源流向乳酸從而削弱了流向α-KG的量。乙酸激酶（acetate kinase）和丙酮酸：醌氧化還原酶（pyruvate quinine oxidoreductase）在谷氨酸棒桿菌中催化丙酮酸向乙酸轉(zhuǎn)化。因此，敲除ldh以增加流向谷氨酸的碳源，試圖提高α-KG產(chǎn)量；敲除乙酸合成途徑的基因，以解除抑制性副產(chǎn)物乙酸對α-KG發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

菌株和質(zhì)粒信息見表1。

表1 菌株及質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。必要時加入終濃度50 μg/mL的卡那霉素。大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37℃，谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)溫度為32℃。

斜面/平皿培養(yǎng)基：牛肉膏8 g/L，NaCl 3 g/L，玉米漿150 mL，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂條20 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，玉米漿20 mL，豆粕水解液30 mL，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，K2HPO4· 3H2O 3 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，Na2HPO43 g/L， KCl 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·7H2O 10 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg，ZnSO410 mg，VB1，B3，B5，B1210 mg，VH 4 μg，豆粕水解液30 mL，谷氨酸鈉4 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.1.3 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶Hind III，EcoR I，solution I，Taq DNA Polymerase，PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計

為了克隆待敲除基因上下游同源臂片段，參考C.glutamicum ATCC13032基因組序列進行引物設(shè)計，如表2所示。

表2 引物

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△ackA和pK18mobsacB△pqo的構(gòu)建

以C.glutamicum GDK-10基因組DNA為模板，通過PCR獲得ackA，pqo基因5′端片段及3′端片段，以PCR產(chǎn)物為模板通過重疊延伸PCR[7]獲得ackA，pqo基因內(nèi)雙缺失的DNA片段dackA，dpqo。將dackA，dpqo片段分別與基因敲除載體pk18mobsacB連接。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將連接體系用CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細胞，然后將其涂布于含有50 μg/ mL卡那霉素的抗性平板中，至于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14～16 h。挑取單菌落接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB搖管中，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒進行酶切驗證。

將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化C.glutamicum GDK-10感受態(tài)細胞，質(zhì)粒經(jīng)過一次交換整合至GDK-10基因組上，在卡那霉素抗性平板中篩選整合質(zhì)粒的重組菌株，接種至含有10%蔗糖的LB搖管中，轉(zhuǎn)接兩代，再吸取適量菌液涂布至含有15%蔗糖的LB平板上，通過PCR方法鑒定篩選得到ldh，pqo，ackA，pqo和ackA基因缺失的突變株GDK-14，GDK-15，GDK-16，GDK-17。

2 結(jié)果與討論

2.1 缺失乳酸合成途徑對C.glutamicum積累α-KG的影響

以出發(fā)菌株GDK-10作為對照，通過7.5 L罐分批補料發(fā)酵，考察重組菌株GDK-14發(fā)酵產(chǎn)α-KG的情況，同時檢測了發(fā)酵過程中菌體細胞干重（DCW）、耗糖量和α-KG的質(zhì)量濃度，以及副產(chǎn)物琥珀酸、乙酸和乳酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖1及表3所示。

表3 GDK-10，GDK-14的α-KG補料分批發(fā)酵參數(shù)

由圖1和表3可知：發(fā)酵14 h時出發(fā)菌株GDK-10達到最大生物量19.5 g/L，而菌株GDK-14的最大生物量為15.4 g/L，較出發(fā)菌株下降了20.85%，這可能是ldh的缺失導(dǎo)致代謝紊亂的結(jié)果；在發(fā)酵過程中并沒有檢測到乳酸，說明經(jīng)過分子改造，已經(jīng)阻斷了副產(chǎn)物乳酸的合成途徑；發(fā)酵30 h時，GDK-14產(chǎn)酸量為40.18 g/L，與出發(fā)菌株相比下降了8.54%；而單位菌體產(chǎn)酸量為3.34 g/g，與出發(fā)菌株相比提高了12.08%。

2.2 缺失乙酸合成途徑對C.glutamicum積累α-KG的影響

以出發(fā)菌株GDK-10作為對照，通過7.5 L罐分批補料發(fā)酵，考察重組菌株GDK-15、GDK-16和GDK-17發(fā)酵產(chǎn)α-KG的情況，同時檢測了發(fā)酵過程中菌體細胞干重（DCW）、耗糖量和α-KG的質(zhì)量濃度，以及副產(chǎn)物琥珀酸、乙酸和乳酸的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖2和表4所示。

表4 GDK-10，GDK-15，GDK-16和GDK-17的α-KG補料分批發(fā)酵參數(shù)

由圖2和表4可知：菌株GDK-15的最大生物量為15.88 g/L，較出發(fā)菌株下降了18.44%，這可能是因為pqo的缺失導(dǎo)致EMP途徑代謝紊亂的結(jié)果；發(fā)酵液中乙酸質(zhì)量濃度為9.14 g/L，較出發(fā)菌株僅下降了2.04%，而菌株GDK-16的乙酸質(zhì)量濃度為4.87 g/L，較出發(fā)菌株下降了47.81%，由此說明ackA是合成乙酸的主要編碼基因；GDK-15的產(chǎn)酸量為47.88 g/L，較出發(fā)菌株提高了8.99%，單位菌體產(chǎn)酸量為4.21 g/g，較出發(fā)菌株提高了41.28%，說明pqo的缺失，可以達到截斷丙酮酸到乙酸的碳代謝流而增加α-KG產(chǎn)量的目的；而GDK-16的產(chǎn)酸量為31.94 g/L，單位菌體產(chǎn)酸量為2.29 g/g，與出發(fā)菌株相比分別下降了27.9%和23.15%，GDK-16雖然乙酸含量下降為4.87 g/L，但產(chǎn)量較出發(fā)菌株下降了14.57%，糖酸轉(zhuǎn)化率沒有明顯的變化；GDK-17的產(chǎn)酸量為37.53 g/L，較GDK-10下降了14.57%。以上結(jié)果說明：乙酸合成途徑可以產(chǎn)生菌體代謝和生長所需的還原力，缺失該途徑后由于還原力的不足導(dǎo)致TCA循環(huán)增強，從而使得α-KG下游代謝過強，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降；此外，GDK-16和GDK-17的琥珀酸含量與出發(fā)菌株相比分別較少了49.78%和58.94%，這也反映出TCA循環(huán)的增強。

3 結(jié)論

為減少支路代謝流，降低副產(chǎn)物對α-KG積累以及下游提取的影響，敲除合成乳酸和乙酸的關(guān)鍵基因。發(fā)酵結(jié)果表明：缺失ldh基因后乳酸停止積累，但菌體的生長受到明顯的抑制，同時產(chǎn)酸量有明顯的下降，并不利于α-KG的積累；pqo的缺失導(dǎo)致菌體的最大生物量較出發(fā)菌株有明顯下降，但總的產(chǎn)酸量和單位菌體產(chǎn)酸量都有明顯的提高，可以達到增強合成α-KG的目的；而GDK-16和GDK-17雖然在發(fā)酵過程中的乙酸含量大幅降低，但其產(chǎn)酸量并沒有因為支路代謝的阻斷而提高，反而較出發(fā)菌株有明顯的下降，說明ackA的缺失并不利于α-KG的積累。

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（責任編輯：朱小惠）

Effects of metabolic byproducts on accumulation of α-ketoglutarate in Corynebacterium glutamicum

ZHAO Yan1,HUANG Longhui1,LI Juan1,SUN Lanchao1,LI Yanjun1,2,3,XIE Xixian1,2,3,CHEN Ning1,2,3
(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;
2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology,Tianjin 300457,China;
3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture,Tianjin 300457,China)

The ldh gene encodes lactic dehydrogenase in Corynebacterium glutamicum,which catalyzes the transformation of pyruvic acid into lactate.The ackA and pqo genes encode acetate kinase and pyruvate quinine oxidoreductase,respectively,which convert pyruvic acid into acetate. In order to investigate the effect of gene deletion on a-ketoglutarate(α-KG)accumulation,the C. glutamicum mutants GDK-14(△ldh),GDK-15(△pqo),GDK-16(△ackA),and GDK-17(△pqo△ackA)were constructed by SOE-PCR and homologous recombination.The fermentation experiments showed that compared to the parental strain CDK-10,the α-KG yield of strain GDK-14 and GDK-16 decreased by 8.54%and 27.9%,respectively,while it reached 47.88 g/L in strain GDK-15 with an increase of 8.99%.

Corynebacterium glutamicum;gene knockout;α-ketoglutarate;lactate;acetate

TQ922

A

1674-2214（2016）04-0215-05

2016-05-16

趙巖（1990—），男，河北張家口人，碩士研究生，研究方向為谷氨酸棒桿菌葡萄糖和木糖共利用代謝工程，E-mail：495107364@qq.com.