吳超琛， 林浩博， 張 曉△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院風濕病科，廣東 廣州 510080)

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吡非尼酮抑制TGF-β1誘導的人肺成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化*

吳超琛1, 2， 林浩博2， 張 曉1, 2△

(1南方醫(yī)科大學，廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院風濕病科，廣東 廣州 510080)

目的： 研究吡非尼酮(PFD)是否抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導的人肺成纖維細胞(HLFs)表型轉(zhuǎn)化。方法:MTT法檢測細胞存活率；EdU法檢測細胞的增殖能力；Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，Western blot法和細胞免疫熒光檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的蛋白水平，實時熒光定量PCR檢測α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達水平。結(jié)果:不同濃度的吡非尼酮(0.1、0.2、0.3、0.5和0.8 mg/L)無明顯的細胞毒性作用，后續(xù)實驗應用0.2 mg/L為干預濃度。吡非尼酮(0.2 mg/L)預處理HLFs能明顯地抑制TGF-β1誘導的細胞增殖、遷移和侵襲能力，下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達水平(P<0.05)，并且干擾TGF-β1誘導的細胞骨架重組和表型轉(zhuǎn)化，使α-SMA的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05)。結(jié)論:吡非尼酮能有效地抑制TGF-β1所誘導的HLFs細胞功能和表型轉(zhuǎn)化。

吡非尼酮； 轉(zhuǎn)化生長因子β1； 人肺成纖維細胞

間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)是一類具有相似的影像學、病理學和臨床表現(xiàn)特點的肺臟薄壁組織炎癥性疾病，大多數(shù)原因不明，但部分病因可能與特定的環(huán)境、腫瘤、結(jié)締組織病相關(guān)。目前對于結(jié)締組織病相關(guān)的間質(zhì)性肺病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease，CTD-ILD)的治療多采用激素和免疫抑制劑治療及非藥物治療(如戒煙、氧療、機械通氣、肺康復甚至肺移植)，但無針對ILD病理改變進行特異性治療的藥物，因此總體療效不佳[1]。

吡非尼酮(pirfenidone，PFD)是一種新的具有廣譜抗纖維化作用的小分子吡啶酮類化合物，在治療特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)取得了一定的效果，在美國已獲得FDA批準[2]。有研究報道，吡非尼酮能抑制大鼠心肌成纖維細胞和大鼠肝臟星狀細胞株的細胞功能和下調(diào)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和膠原的表達，有望改善心肌重構(gòu)和治療肝臟纖維化[3-4]。Inomata等[5]采用博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，吡非尼酮能顯著降低肺臟CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)和CCL12的表達，從而降低成纖維細胞的遷移能力，影響成纖維細胞儲備池的規(guī)模。但是，吡非尼酮是否能夠影響人肺成纖維細胞的增殖、遷移、侵襲功能，是否干擾成纖維細胞的細胞骨架重組和表型轉(zhuǎn)化等更深層次地揭示其作用機制的研究國內(nèi)尚未見報道。

材 料 和 方 法

1 材料

吡非尼酮(Sigma)；抗α-SMA抗體(Abcam)；MTT試劑(華藍化學)；牛血清白蛋白(Seikagaku)；鬼筆環(huán)肽-488和Alexa Fluor 488羊抗兔熒光II抗(Invitrogen)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TFG-β1;R&D)；DMEM Basic和胎牛血清(Gibco);EdU 增殖試劑盒(廣州銳博)；多聚甲醛和抗β-actin抗體(Sigma)；Triton X-100(Amresco)；Transwell小室(Corning)；Invasion小室(BD)；羊抗兔IgG II抗(CST)；PCR聚合酶(TaKaRa)；PCR引物(上海生工生物)。

2 方法

2.1 組織塊法培養(yǎng)原代人肺成纖維細胞 在無菌條件下，選取年齡小于55歲、無感染、不吸煙患者肺部遠離腫瘤的正常肺組織(經(jīng)病理切片證實)，PBS反復漂洗后用眼科剪將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，將其種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，6 h后加入體積分數(shù)20%胎牛血清、含青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L的DMEM培養(yǎng)液4 mL。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)成纖維細胞，每隔2～3天全量換液，待細胞游離、擴增至滿瓶后用體積分數(shù)0.25%胰酶+0.02% EDTA溶液消化傳代，采用自然純化法得到純化的人肺成纖維細胞。實驗采用第4～7代細胞進行檢測。所有肺臟組織取材前均取得患者知情同意及研究所在單位醫(yī)學倫理審查批準。

2.2 實驗分組 實驗分為3組：(1) 正常對照(control, CTR)組；(2) TGF-β1刺激組：應用5 μg/L的TGF-β1處理HLFs 24 h；(3) TGF-β1+PFD治療組：0.2 mg/L PFD作用于HLFs 72 h，撤去，用PBS洗2次，接著用5 μg/L的TGF-β1作用24 h。

2.3 MTT實驗測定細胞存活率 將HLFs以107～108/L的密度接種于96孔板，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)12 h后，更換全培養(yǎng)基，加入不同濃度的PFD(0、0.1、0.2和0.3 mg/L)，每個濃度重復5次，設(shè)置空白孔及1%濃度DMSO孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的MTT工作液5 g/L繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO終止培養(yǎng)，使用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，波長設(shè)定為570 nm。按公式：細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，求出處理組細胞存活率，重復3次。

2.4 EdU細胞增殖實驗 將HLFs接種于96孔培養(yǎng)板中孵育48 h，每孔加入100 μL EdU溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，按照說明書進行固定染色，染色后立即熒光顯微鏡下觀察計數(shù)，隨機挑選5個視野計算EdU陽性細胞比例。

2.5 細胞遷移和侵襲實驗 用DMEM無血清培養(yǎng)基定細胞密度至5.0×107/L，Transwell 小室下室中加入600 μL 含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，上室中加入細胞懸液200 μL，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24 h 左右。上室移入空白孔中，PBS 洗3 次，加入適量甲醇固定15 min，然后換到其它孔中，結(jié)晶紫染色15 min。染色完畢后，PBS 洗2遍，棉簽擦拭膜內(nèi)面，去除未遷移的細胞。用手術(shù)刀片切下Transwell小室上的膜，置于載玻片上用中性樹膠封片，顯微鏡觀察計數(shù)，每孔至少計數(shù)5個隨機視野跨膜/基質(zhì)膠的細胞數(shù)，取均值，與對照組進行標準化。如果侵襲實驗，則采用包被有Matrigel的Transwell 小室，小室下用15% 胎牛血清 的培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)24～36 h。

2.6 細胞免疫熒光 將HLFs細胞消化傳代后接種至6孔板細胞爬片按前述實驗分組藥物處理后，細胞長至60%～70%，4%多聚甲醛 20 ℃固定20 min，0.2% Triton打孔10 min，5% BSA封閉30 min，加I抗(α-SMA，1∶50)4 ℃濕盒過夜，然后用PBS洗10 min 3次，加入鬼筆環(huán)肽(紅光，1∶400)和II抗(綠光，1∶10 000)，室溫孵育60 min，然后再用PBS洗10 min 3次，DAPI(藍光，1∶200)染核5 min，抗熒光衰減劑封片，熒光顯微鏡下觀察，獲取圖像。

2.7 Western blot法檢測蛋白的表達 將HLFs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長至80%時給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2次，各皿加入80 μL裂解液后置4 ℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進行測定?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉90 min，加入I抗(α-SMA，1∶50)，4 ℃過夜，然后用TBST洗10 min 3次，加入II抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗10 min 3次。ECL發(fā)光液將PVDF膜顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2.8 Real-time PCR 采用TRIzol一步法提取各組細胞總RNA，采用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書推薦的標準配制逆轉(zhuǎn)錄體系；在PCR儀中37 ℃反應 15 min，然后85 ℃反應30 s，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；逆轉(zhuǎn)錄后，使用滅菌ddH2O將cDNA 稀釋合適的倍數(shù)；采用TaKaRa的SYBR熒光定量PCR試劑盒，參照說明書配制反應體系，相應基因的引物序列見表1；采用三步法進行PCR反應，將靶基因Ct值與內(nèi)參照基因(18S rRNA)進行比較，計算各目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)定量資料用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Bonferoni檢驗， 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 吡非尼酮對HLFs活性的影響

為了解不同濃度吡非尼酮對HLFs細胞存活率的影響和尋找合適的藥物濃度，我們觀察了不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.5和0.8 mg/L)下吡非尼酮的細胞毒性作用，結(jié)果如圖1所示：不同濃度的吡非尼酮處理后HLFs的存活率分別為(85.11±9.71)%、(80.53±15.61)%、(76.27±8.90)%、(66.91±7.64)%和(55.83 ±19.63)%，空白對照組和溶劑DMSO對照組細胞存活率為(100.00±31.52)%和(64.91±36.04)%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L和0.8 mg/L吡非尼酮及1% DMSO溶劑濃度與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學顯著性，不引起細胞毒性，見圖1A。根據(jù)此結(jié)果，后續(xù)實驗應用0.2 mg/L的PFD為干預濃度。

2 吡非尼酮抑制TGF-β1對HLFs功能的影響

應用 TGF-β1刺激HLFs可明顯地增強細胞增殖能力，表現(xiàn)為增殖細胞(EdU陽性細胞)占視野下細胞總數(shù)的比例增加，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；吡非尼酮預處理組增殖細胞比例明顯下降，與TGF-β1刺激組相比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，提示吡非尼酮能明顯地抑制TGF-β1誘導的增殖,見圖1B。

對照組、TGF-β1刺激組、吡非尼酮預處理組穿過生物膜進入下室的細胞數(shù)分別為215.00±16.02、281.00±25.95和197.80±16.79，經(jīng)統(tǒng)計學分析，TGF-β1刺激組較對照組明顯升高(P<0.01)，吡非尼酮預處理組較TGF-β1刺激組明顯下降(P<0.01)，提示吡非尼酮能明顯地抑制TGF-β1誘導的遷移；對照組、TGF-β1刺激組和吡非尼酮預處理組該3組穿過基質(zhì)膠進入下室的細胞數(shù)分別為24.00±4.39、62.60±9.47和33.20±3.77，經(jīng)統(tǒng)計學分析，TGF-β1刺激組較對照組明顯升高(P<0.01)，吡非尼酮預處理組較TGF-β1刺激組明顯下降(P<0.01)，提示吡非尼酮能明顯地抑制TGF-β1誘導的侵襲，見圖2。

實時定量PCR檢測結(jié)果可見TGF-β1刺激組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；吡非尼酮預處理組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA表達下降(P<0.05)，與TGF-β1刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，說明吡非尼酮能抑制TGF-β1誘導的細胞分泌，見圖3。

Figure 1.The effect of pirfenidone (PFD) on the viability (A) and proliferation (B) of HLFs (×200). Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsCTR group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖1 吡非尼酮對人肺成纖維細胞細胞活力及增殖的影響

Figure 2.The effect of pirfenidone (PFD) on the migratory and invasive abilities of HLFs (×200). Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsCTR group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖2 吡非尼酮對人肺成纖維細胞遷移和侵襲的影響

Figure 3.The effect of pirfenidone (PFD) on the mRNA expression of type I and III collagens in TGF-β1-induced HLFs. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsCTR group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖3 吡非尼酮對TGF-β1誘導的HLFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA表達的影響

3 吡非尼酮對TGF-β1誘導的HLFs細胞骨架和表型轉(zhuǎn)化的影響

對照組的HLFs表達少量α-SMA，細胞內(nèi)纖維形肌動蛋白(F-actin)分布規(guī)則清晰、彼此連接，保持細胞的正常外形； TGF-β1刺激組的α-SMA熒光信號明顯增強，F(xiàn)-actin成粗大束狀排列；吡非尼酮預處理組的α-SMA熒光信號較TGF-β1刺激組有明顯減弱，F(xiàn)-actin熒光強度稍有減弱，部分區(qū)域收縮變短，細胞表層(纖維與質(zhì)膜平行排列，通過某些位點連接質(zhì)膜)出現(xiàn)大量斑點樣染色亮點，細胞膜發(fā)生褶皺，細胞體積縮小，提示吡非尼酮能抑制TGF-β1誘導的細胞骨架重組從而影響細胞運動功能。

實時定量PCR和Western blot實驗結(jié)果如圖4所示，TGF-β1處理組的α-SMA在mRNA水平和蛋白水平的表達均上調(diào)，與對照組相比較差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)；吡非尼酮預處理組的α-SMA表達明顯減少(P<0.01)，提示吡非尼酮能抑制TGF-β1誘導的HLFs表型轉(zhuǎn)化。

Figure 4.The effect of pirfenidone (PFD) on alterations of α-SMA expression in TGF-β1-induced HLFs (×200). Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsCTR group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖4 吡非尼酮對TGF-β1誘導的HLFs表型轉(zhuǎn)化標志物α-SMA表達的影響

討 論

吡非尼酮是一種小分子的抗纖維化藥物，已經(jīng)被證實在博來霉素誘導的小鼠纖維化模型中能從病理上降低肺臟纖維化程度[5]，但其抗纖維化作用的具體機制仍不全面，尤其在細胞功能方面的研究甚少。目前認為肌成纖維細胞的細胞功能對不同臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，其細胞功能的抑制能更為直接有效地反映抗纖維化的作用[6]。由于臨床上獲取肺臟標本難度較大，國內(nèi)外多采用動物來源的肺成纖維細胞或者成纖維細胞株進行研究[7-8]。既往研究報道顯示，吡非尼酮不僅能抑制人心肌成纖維細胞的增殖和遷移能力，還能降低大鼠肝臟星形細胞的增殖能力，但尚未全面性地評估吡非尼酮對成纖維細胞所有細胞功能的影響[3-4]。本實驗中采用人肺成纖維細胞進行原代培養(yǎng)的研究能消除種屬差別的影響，更真實地反應吡非尼酮在機體內(nèi)抗纖維化的作用及機制。本文證實吡非尼酮能明顯抑制TGF-β1對HLFs的細胞功能的影響，使其增殖、遷移、侵襲能力和細胞分泌能力均明顯下降，補充了吡非尼酮在細胞水平上抗纖維化作用的研究空缺。

肌成纖維細胞是纖維化的先驅(qū)細胞，其中原位成纖維細胞是肌成纖維細胞的主要來源，在肺臟損傷等始動因素作用下，成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，合成膠原增多并沉積在肺泡間隔，使肺順應性下降和肺臟功能受損[6]。TGF-β1是多種器官纖維化過程的中樞因子，能誘導成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，可以促進其增殖和生長，增加膠原合成，阻止細胞外基質(zhì)的降解。近年，我們[9]和其他學者[10-12]已經(jīng)證實，CTD-ILD患者和博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型中，肺臟組織TGF-β1表達增加，細胞外基質(zhì)沉積，病理顯示肺泡炎癥及間質(zhì)增厚。肌成纖維細胞高表達α-SMA，不僅能合成細胞外基質(zhì)，還能體現(xiàn)出類似平滑肌細胞的細胞骨架收縮特性[13]。本次實驗結(jié)果顯示，吡非尼酮能抑制TGF-β1誘導的人肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，下調(diào)α-SMA的表達，影響細胞骨架蛋白重組，降低細胞運動能力。上述研究提示，吡非尼酮可能通過抑制HLFs表型轉(zhuǎn)化和細胞骨架蛋白重組，以實現(xiàn)上述對細胞功能的影響，并進一步證實吡非尼酮通過干擾TGF-β1通路達到抑制膠原沉積的作用。

目前將吡非尼酮應用于CTD-ILD的治療僅有很少的病例報道，其治療效果及安全性仍需更多的研究證實[14]。本實驗初次將吡非尼酮應用于人的肺成纖維細胞，更進一步探索了其在細胞水平抗纖維化的作用。今后研究將通過動物模型的建立，深入探討肺纖維化的細胞因子及信號轉(zhuǎn)導通路，并探索吡非尼酮應用于其他病因引起的間質(zhì)性肺病的治療效果及安全性。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Pirfenidone inhibits TGF-β1-induced differentiation of myofibroblast in human lung fibroblast populations

WU Chao-chen1, 2, LIN Hao-bo2, ZHANG Xiao1, 2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofRheumatology,GuangdongAcademyofMedicalSciences,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China.E-mail: 13922255387@163.com)

AIM: To investigate the effect of pirfenidone on transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced fibroblast-to-myofibroblast transitioninvitro. METHODS: The cell viability was measured by MTT assay. The proliferation of human lung fibroblasts (HLFs) was detected by EdU incorporation. Migratory and invasive abilities were measured by Boyden chamber assay. The α-smooth muscle actin (α-SMA) protein expression was determined by Western blot and immunofluorescence. The mRNA expression of α-SMA and type Ⅰ and Ⅲ collagens was evaluated by RT-qPCR. RESULTS: Pirfenidone at different concentrations (0.1, 0.2, 0.3, 0.5 and 0.8 mg/L) had no cytotoxic effect on the HLFs, and pirfenidone at 0.2 mg/L was used for the intervention. Pretreatment of the HLFs with 0.2 mg/L pirfenidone prior to TGF-β1 not only markedly suppressed the changes of proliferation, migration, invasion and reorganization of actin cytoskeleton in the HLFs (P<0.01), but also down-regulated the expression of α-SMA and type Ⅰ and Ⅲ collagens triggered by TGF-β1 (P<0.05). CONCLUSION: Pirfenidone has an inhibitory effect on TGF-β1-induced activated cell functions and fibroblast-to-myofibroblast transition in HLFs.

Pirfenidone; Transforming growth factor-β1; Human lung fibroblasts

1000- 4718(2016)11- 2049- 07

2016- 07- 14

2016- 08- 23

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2012010008702)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.022

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