周劍

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

托吡卡胺滴眼液的抑菌效力測(cè)定

周劍

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

目的 測(cè)定托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力。方法 以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證和微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)，根據(jù)各間隔時(shí)間的菌數(shù)lg值相對(duì)于初始值減少程度評(píng)價(jià)托吡卡胺滴眼液對(duì)細(xì)菌、真菌的抑菌效力。結(jié)果 部分托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力符合2010年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定，但不符合2015年版《中國(guó)藥典》通則1121抑菌效力檢查法的規(guī)定。結(jié)論 2010年版《中國(guó)藥典》和2015年版《中國(guó)藥典》通則1121抑菌效力的判斷標(biāo)準(zhǔn)差異較大，部分已上市品種的抑菌劑效力達(dá)不到2015年版《中國(guó)藥典》的要求。

托吡卡胺滴眼液；抑菌效力；評(píng)價(jià)

眼用制劑為多劑量包裝制劑，易在貯藏和使用過程中發(fā)生微生物污染和繁殖，對(duì)藥物的質(zhì)量及療效產(chǎn)生影響[1]，需加入抑菌劑，避免微生物生長(zhǎng)與繁殖[2]。若無合理的防腐體系，環(huán)境中的微生物一旦大量侵入，則有可能破壞產(chǎn)品的品質(zhì)或損害患者健康。建立良好的防腐體系，對(duì)于滴眼液的品質(zhì)十分重要[3]。托吡卡胺滴眼劑，適應(yīng)證為滴眼散瞳和調(diào)節(jié)麻痹，在使用中需反復(fù)打開，易被淚液及空氣中的微生物污染，從而產(chǎn)生安全隱患[4－5]。對(duì)其抑菌劑的抑菌效力進(jìn)行測(cè)定，可有效保障產(chǎn)品質(zhì)量，而目前尚未見托吡卡胺滴眼液抑菌效力研究的報(bào)道，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果與2010年版《中國(guó)藥典》[6]、2015年版《中國(guó)藥典》[7]抑菌效力差異較大，故按照2個(gè)版本的《中國(guó)藥典》中的抑菌效力檢查法對(duì)托吡卡胺滴眼液的抑菌效力進(jìn)行了考察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1．1 儀器

1．2 試藥

托吡卡胺滴眼液（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司＜簡(jiǎn)稱山東博士倫＞，批號(hào)為140809；安徽雙科藥業(yè)有限公司 ＜簡(jiǎn)稱安徽雙科 ＞，批號(hào)為140703，規(guī)格均為6 mL∶15 mg）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)為130520）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為141112）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)為 1402032）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為20130710）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1．3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、銅綠假單胞菌[CMCC（F）98003]均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 菌種及菌液制備

菌種：枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]。

菌液制備：取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌肉湯培養(yǎng)物，分別用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌約108cfu的菌懸液，備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌約108cfu的菌懸液，備用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)6 d的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加入含0．05%（mL／mL）聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）置無菌試管內(nèi)，用0．9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子108cfu的孢子懸液。

2．2 試驗(yàn)方法

大豆卵磷脂稀釋液是近年稀釋液研究的熱點(diǎn)，F(xiàn)orouzanfar等[8]在冷凍保存綿羊精液試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黃，證明大豆卵磷脂可以替代卵黃。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低溫與常溫下保存綿羊精液，結(jié)果表明精子在卵黃中的運(yùn)動(dòng)性較差。本試驗(yàn)在0 ℃冰水混合物中保存綿羊精液，發(fā)現(xiàn)使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黃保存精子效果顯著高于其他濃度(P<0. 05)，與蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最優(yōu)添加量有一定偏差。所以證明為了確保精子的運(yùn)動(dòng)處于最好的狀態(tài)，大豆卵磷的添加劑量必須有一定的限度。

受試品溶液制備：直接取樣品作為受試品溶液。

供試品接種：取受試品溶液5份，轉(zhuǎn)移至5個(gè)適宜的無菌容器中，每個(gè)容器接種1種試驗(yàn)菌，供試品中接種菌量為105～106cfu，充分混勻，使供試品中的試驗(yàn)菌均勻分布。然后將接種的供試品在試驗(yàn)期間置22℃避光保存。

存活菌測(cè)定：在供試品接種0 h，6 h，1 d，7 d，14 d，28 d時(shí)，分別從上述每個(gè)容器中取供試液 1 mL，用pH＝7．0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋，采用平皿法進(jìn)行存活菌數(shù)測(cè)定，細(xì)菌測(cè)定用胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，真菌測(cè)定用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。根據(jù)菌數(shù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算1 mL供試品各試驗(yàn)菌所加菌數(shù)及各間隔時(shí)間的菌數(shù)，并換算成lg值。

2．3 試驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

結(jié)果見表1。

表1 微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2．3．2 存活菌測(cè)定結(jié)果

與初始值比較，7 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數(shù)的lg值下降均大于1．0，符合2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定；與初始值比，14 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數(shù)的lg值下降均大于3．0，符合2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定；與14 d的菌數(shù)相比，28 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數(shù)均未增加，符合2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定；樣品的真菌數(shù)與初始值比，7，14，28 d的黑曲霉和白色念珠菌菌數(shù)均未增加，符合2010年版《中國(guó)藥典》要求?？梢?，2個(gè)廠家生產(chǎn)的托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力均符合2010年版《中國(guó)藥典》中抑菌效力檢查法的判斷標(biāo)準(zhǔn)。詳見表2。

2．3．3 抑菌效力檢查結(jié)果

與接種的細(xì)菌菌數(shù)lg值相比，6 h存活的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌數(shù)lg值下降，山東博士倫6 h存活的銅綠假單胞菌下降值為2．4，滿足2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定應(yīng)達(dá)到的抑菌效力“A”標(biāo)準(zhǔn)，其余下降值均小于2．0，不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)；1 d存活的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌數(shù)lg值下降，山東博士倫下降值均大于3．0，滿足公示稿中要求的應(yīng)達(dá)到的抑菌效力“A”標(biāo)準(zhǔn)，而安徽雙科均小于3．0，不能滿足公示稿中的同一標(biāo)準(zhǔn)；7 d存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的lg值2個(gè)廠家下降均大于3．0；14 d和28 d，2個(gè)廠家的滴眼液均未檢出試驗(yàn)菌?？梢?，托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力存在不符合2015年版《中國(guó)藥典》中的抑菌效力判斷“A”標(biāo)準(zhǔn)的情況。詳見表3。

表2 7，14，28 d后與初始值相比lg值下降值

與接種的真菌菌數(shù)lg值相比，2個(gè)廠家7 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的 lg值下降值均大于 2，滿足2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定應(yīng)達(dá)到的抑菌效力“A”標(biāo)準(zhǔn)；2個(gè)廠家14 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的lg值下降值均大于1，滿足2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定應(yīng)達(dá)到的抑菌效力“B”標(biāo)準(zhǔn)（14 d lg值下降值判定，2015年版《中國(guó)藥典》“A”標(biāo)準(zhǔn)無相關(guān)規(guī)定）；與14 d的真菌菌數(shù)相比，2個(gè)廠家28 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的菌數(shù)未增加，滿足2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定應(yīng)達(dá)到的抑菌效力“A”標(biāo)準(zhǔn)。詳見表4。

表3 與接種細(xì)菌菌數(shù)lg值相比不同時(shí)間點(diǎn)下降值

表4 與接種真菌菌數(shù)lg值相比不同時(shí)間點(diǎn)下降值

3 討論

抑菌效力檢查無論是對(duì)消費(fèi)者還是生產(chǎn)企業(yè)都至關(guān)重要，防腐劑添加過少，會(huì)使微生物繁殖而引起污染，防腐劑添加過多，會(huì)引起不適或過敏等不良反應(yīng)，故適量添加防腐劑尤為重要[8]。2015年版《中國(guó)藥典》更新了抑菌效力檢查法，并根據(jù)歐美藥典的最新要求提高了抑菌效力的判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。多劑量包裝的滴眼液需在處方中適當(dāng)添加適宜的抑菌劑來保持產(chǎn)品在貯存和使用過程中具有一定的抑菌能力[10]。同時(shí)，添加的抑菌劑多少都會(huì)具有一定毒性，故必須進(jìn)行充分的試驗(yàn)研究，嚴(yán)格控制抑菌劑的種類和用量，保證用藥安全[11]。

不同廠家生產(chǎn)的滴眼液的抑菌效力存在較大差異，如何選擇抑菌劑，以及如何實(shí)現(xiàn)藥物中所含抑菌劑的量為最低有效劑量，仍為抑菌效力檢查試驗(yàn)的難點(diǎn)[12－13]。抑菌劑使用量的界限一直都很模糊，過量易導(dǎo)致人體受損，不足則增加微生物污染的可能性[1]。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的滴眼液可能存在防腐劑遠(yuǎn)超抑菌效力要求的情況。如張世磊等[2]在萘敏維滴眼液抑菌效力試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，7 d所有試驗(yàn)菌株的菌落數(shù)均下降為0；肖璜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行產(chǎn)品氯霉素滴眼液中的尼泊金乙酯處方濃度偏高。安彥[14]的研究結(jié)果顯示，抑菌劑的效力不僅與所使用的抑菌劑種類及含量相關(guān)，同時(shí)也與其他成分及制劑工藝有關(guān)，特別應(yīng)關(guān)注pH、等電點(diǎn)、表面活性劑、生物制劑的蛋白含量等因素，其協(xié)同效應(yīng)值得進(jìn)一步研究，也提示對(duì)添加抑菌劑的制劑進(jìn)行抑菌劑效力評(píng)價(jià)的必要性[15]。

四國(guó)藥典[《美國(guó)藥典》（USP)，《歐洲藥典》(EP)，《日本藥典》(JP)，《中國(guó)藥典》(ChP)]均收載有抑菌劑效力檢查法，但測(cè)定方法和標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，EP要求考察6，24 h和7，14，28 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，USP和ChP要求考察7，14，28 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，而JP僅考察14，28 d 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)[16]。本研究中結(jié)合ChP和EP的相關(guān)要求，在6 h，24 h，7 d，14 d，28 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行考察，更能比較出不同產(chǎn)品抑菌劑效力之間的差異，也更符合滴眼液實(shí)際用藥的需要。

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Bacteriostatic Effect Assay of Tropicamide Eye Drops

Zhou Jian
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China 401121）

Objective To detect the bacteriostatic effect of Tropicamide Eye Drops．M ethods Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli，Aspergillus and Candida albicans were used as test strains，the colony－count method validation was studied．According to the verified method，the microbiological method and various time－gap colony counting lg，compared with original value，were applied to evaluate bacteriostatic effects of Tropicamide Eye Drops for bacteria and fungus．Results The effect of bacteriostatic agent of pirenoxine ophthalmic solution was confoumable to the standard of Ch．P（2010），but was not confoumable to the standard of the general public draft 1121 of Ch．P（2015）．Conclusion There are great differences for the estimate standard of preservatives－effectiveness between the Ch．P（2010）and the general public 1121 of Ch．P（2015），and the preservatives－effectiveness in part of the listed varieties do not meet the requirement of the latter．

Tropicamide Eye Drops；bacteriostatic effect；evaluation

R927．11；R988．1

A

1006－4931(2016)10－0069－03

周劍（1980－），男，大學(xué)本科，工程師，研究方向?yàn)樗幬锓治鑫⑸?，（電子信箱?0257199＠qq．com。

2016－01－10；

2016－02－09)