陳燕瓊 周韶璋

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

ALK-TKIs耐藥的研究進(jìn)展

陳燕瓊1，2周韶璋1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療科；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑（anaplastic lymphoma tyrosine kinase inhibitors，ALK-TKIs）的問(wèn)世改變了棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治療策略，使此類患者得到了明顯的生存獲益。然而，幾乎所有酪氨酸激酶抑制劑治療后一年內(nèi)不可避免地出現(xiàn)耐藥，制約臨床效益發(fā)揮，本文就ALK-TKIs的常見(jiàn)耐藥機(jī)制及耐藥后的應(yīng)對(duì)策略作一綜述。

肺腫瘤；ALK-TKIs；EML4-ALK；耐藥機(jī)制；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見(jiàn)的類型，占肺癌的 80%～85%，突變基因 EGFR、ALK、ROS1、KRAS的發(fā)現(xiàn)及靶向制劑的應(yīng)用使這類患者從有效性差、毒副反應(yīng)大的化療中解脫。ALK基因陽(yáng)性的NSCLC患者應(yīng)用間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制劑（anaplastic lymphoma tyrosine inhibitors，ALK-TKIs）治療較常規(guī)化療可顯著獲益，臨床研究證實(shí)，克唑替尼治療的有效率＞70%，無(wú)進(jìn)展生存期（progression-freesurvival，PFS）近11個(gè)月［1］。但和其他靶向藥一樣，ALK-TKIs也不可避免地出現(xiàn)耐藥，成為治療的瓶頸，限制藥物發(fā)揮更大的療效。本文就ALK-TKIs的耐藥機(jī)制及耐藥后的應(yīng)對(duì)策略作一綜述。

1 EML4-ALK融合基因

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）融合基因2007年由日本學(xué)者Soda等［2］發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)為肺癌驅(qū)動(dòng)基因，EML4和ALK兩個(gè)基因分別位于人類2號(hào)染色體的p21和p23上，細(xì)胞內(nèi)ALK基因與帶有N端的EML4倒位融合，通過(guò)刺激PI3K/AKT/MAPK信號(hào)通路誘發(fā)酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖分化并抑制凋亡。EML4-ALK融合基因占NSCLC的3%～7%，多發(fā)生于非吸煙、年輕的女性腺癌患者。針對(duì)EML4-ALK融合基因，臨床上涌現(xiàn)出許多高效的ALK-TKIs，包括一代克唑替尼、二代艾樂(lè)替尼、色瑞替尼、Brigatinib和三代Loratinib等。

2 克唑替尼

克唑替尼（PF-02341066，xalkori）是第一個(gè)被 FDA批準(zhǔn)的ALK-TKIs，用于ALK陽(yáng)性的NSCLC的一線治療，克唑替尼是MET、ALK、ROS1基因改變都有活性的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑［3-4］。PROFILE1014隨機(jī)Ⅲ期臨床研究表明，克唑替尼能顯著提高ALK陽(yáng)性NSCLC患者一線治療的無(wú)進(jìn)展生存期和客觀緩解率，且安全性良好［1］，客觀緩解率達(dá)60%，無(wú)進(jìn)展生存期達(dá)8～10個(gè)月，總生存期顯著延長(zhǎng)［5-7］，但往往在初始治療后一年內(nèi)出現(xiàn)克唑替尼耐藥，其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)［8］。

2.1 ALK激酶區(qū)域的二次突變

ALK激酶區(qū)域的二次突變是最早明確的耐藥機(jī)制［9-10］，占克唑替尼耐藥的28%。2008年Choi等［11］首次在對(duì)克唑替尼耐藥患者的胸腔積液中檢測(cè)到序列4374G→A和4493C→A兩種突變基因，相應(yīng)序列C1156和L1196表達(dá)的氨基酸發(fā)生了改變。2010年Sasaki等［12］證實(shí)L1196突變可能創(chuàng)建了一個(gè)空間位阻阻止克唑替尼結(jié)合，F(xiàn)1174L突變可能促進(jìn)ALK活化構(gòu)象的產(chǎn)生，從而不利于克唑替尼的結(jié)合，使其優(yōu)先結(jié)合無(wú)效構(gòu)象ALK。2011年在ALK和活化的EGFR信號(hào)中的一個(gè)二次突變（L1152R），導(dǎo)致1152位置上的亮氨酸被精氨酸取代［13］。Zhang等［14］在激酶活性部位周圍檢測(cè)到5個(gè)區(qū)域的殘基突變，除已知的C1156、F1174、L1196和L1152等突變外，還檢測(cè)到另外兩種新的二次突變S1206和I1171。Doebele等［15］證實(shí)位于ALK的ATP結(jié)合區(qū)末端的二次突變G1269A，體外實(shí)驗(yàn)也印證了G1269A能夠促進(jìn)ALK永久性磷酸化，激活下游效應(yīng)器，使克唑替尼耐藥。Katayama等［10］在18例克唑替尼耐藥患者中發(fā)現(xiàn)4種耐藥突變：3種錯(cuò)義突變（L1196M、G1202R和S1206Y）和 1種氨基酸（蘇氨酸）插入突變（1151Tins）。這些激酶域的突變通過(guò)增加空間位阻、活化ALK的構(gòu)象、使ALK永久磷酸化等途徑影響藥物與活性位點(diǎn)的結(jié)合，最終導(dǎo)致克唑替尼耐藥。

2.2 ALK融合基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增

ALK融合基因拷貝數(shù)的擴(kuò)增是克唑替尼耐藥的可能機(jī)制之一。Katayama等［10］在對(duì)克唑替尼耐藥的18例肺腺癌患者及在H3122（含EML4-ALK突變體1）獲得性耐藥細(xì)胞系中檢測(cè)到ALK融合基因大量擴(kuò)增。當(dāng)ALK融合基因激酶區(qū)域發(fā)生二次突變或拷貝數(shù)增加時(shí)，ALK信號(hào)通路往往被保留，并在腫瘤的生存和耐藥過(guò)程中發(fā)揮作用。因此，使用更加有效的第二代、第三代ALK抑制劑也許能夠克服這些機(jī)制引起的繼發(fā)性耐藥問(wèn)題。

2.3 信號(hào)旁路的激活

ALK屬于酪氨酸激酶，其下游的信號(hào)通路主要包括PI3K/AKT/mTOR、Ras/MEK/ERK 和JAK3-STAT3，這些信號(hào)與細(xì)胞存活和增殖有關(guān)，克唑替尼通過(guò)與其靶點(diǎn)的特異性結(jié)合抑制EML4-ALK下游信號(hào)的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)信號(hào)旁路激活時(shí)，信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)繞過(guò)抑制劑作用的原始靶點(diǎn)，通過(guò)信號(hào)旁路激活下游信號(hào)，使克唑替尼不能充分抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。這些不依賴于ALK的耐藥機(jī)制包括激活EGFR、KIT、IGF-1R等信號(hào)通路。Sasaki等［13］在DFCI076細(xì)胞株（來(lái)源于對(duì)克唑替尼耐藥的患者）中發(fā)現(xiàn)EGFR的配體——雙調(diào)蛋白EGF的自分泌，在DFCI076細(xì)胞系中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ALK的二次突變，而是EGFR的激活增加，且證實(shí)在H3122細(xì)胞中加入EGF因子刺激可導(dǎo)致對(duì)克唑替尼耐藥，提示EGFR配體的增加可誘導(dǎo)EGFR激活，而克唑替尼聯(lián)合EGFR-TKI能克服這種耐藥，提示在靶向藥物治療耐藥后，了解其耐藥的分子機(jī)制，再針對(duì)性地選擇另一種靶向藥物可能有效。這為克唑替尼耐藥但未發(fā)生二次突變的患者提供一種可能的治療策略。Katayama等［10］在2例克唑替尼耐藥的患者中發(fā)現(xiàn)了cKIT擴(kuò)增，這種耐藥需要同時(shí)激活cKIT及其配體干細(xì)胞因子（SCF），而使用KIT抑制劑伊馬替尼能逆轉(zhuǎn)這種耐藥。IGF-1R是一個(gè)四聚體酪氨酸受體，與其配體IGF-1、IGF-2結(jié)合后，通過(guò)激活 下 游 PI3K/AKT/mTOR、MAPK/RAF/ERK和 JAK3-STAT3，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，減少細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究表明，IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在多種臨床有效的抗腫瘤藥物耐藥中發(fā)揮重要作用，IGF-1R及其配體過(guò)表達(dá)能使患者對(duì)放化療產(chǎn)生抵抗，在體內(nèi)沉默IGF-1R表達(dá)及抑制其信號(hào)傳導(dǎo)能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性［16］。Li等［17］通過(guò)在肺腺癌細(xì)胞株 H2228（EML4-ALK突變體3b E6；A20）中加入IGF-1因子，使H2228細(xì)胞株對(duì)克唑替尼耐藥，且加入二甲雙胍后能使耐藥細(xì)胞對(duì)克唑替尼再次敏感，考慮二甲雙胍可能通過(guò)IGF-1R信號(hào)通路發(fā)揮了作用。

2.4 其他耐藥機(jī)制

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）是指細(xì)胞由上皮特性轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞特性。通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)能力等間質(zhì)表型。EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，多項(xiàng)研究結(jié)果提示EMT與腫瘤干細(xì)胞形成、耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在NSCLC中，Zhou等［18］報(bào)道EMT與酪氨酸激酶抑制劑的耐藥相關(guān)。Kim等［19］在誘導(dǎo)的克唑替尼耐藥細(xì)胞H2228CR中，發(fā)現(xiàn)EMT的標(biāo)志蛋白E-Cadherin、Vimentin表達(dá)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移力有關(guān)，表明EMT與克唑替尼的耐藥相關(guān)。

3 艾樂(lè)替尼

艾樂(lè)替尼是第二代的ALK-TKI，具有高度的選擇性，其效力比克唑替尼強(qiáng)10倍。體外研究發(fā)現(xiàn)艾樂(lè)替尼對(duì)ALK激酶的半抑制濃度（IC50）僅為1.9 nmol/L，能夠抑制大多數(shù)ALK激酶區(qū)的繼發(fā)性耐藥，主要有L1196M、C1156Y及G1269A［20］，從而克服克唑替尼耐藥，且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移瘤有良好的滲透性，總有效率（overall response rate，ORR）達(dá)93.5%。日本癌癥國(guó)立中心醫(yī)院一項(xiàng)隨機(jī)、開(kāi)放Ⅲ期研究J-ALEX顯示，艾樂(lè)替尼一線治療ALK陽(yáng)性患者的中位PFS為20.3個(gè)月，顯著優(yōu)于克唑替尼（10.2個(gè)月），且耐受性良好，不良反應(yīng)更輕。但和其他ALK-TKIs一樣，艾樂(lè)替尼單藥治療的最初1年內(nèi)，患者出現(xiàn)明顯的獲得性耐藥。

3.1 ALK激酶區(qū)域的二次突變

Katayama等［21］通過(guò)藥物濃度遞增的方式構(gòu)建了艾樂(lè)替尼的耐藥細(xì)胞株，在耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)兩種新的ALK突變：V1180L和I1171T，且另一個(gè)二代ALK抑制劑ceritinb及熱休克蛋白抑制劑能克服這種耐藥。其他與艾樂(lè)替尼耐藥相關(guān)的突變有L1196M、G1202R。

3.2 旁路的激活

Tanimoto 等［22］揭露了 EGFR 配體 EGF、TGF-α、HBEGF的旁分泌通過(guò)激活EGFR信號(hào)通路引起了克唑替尼耐藥。Isozaki等［23］構(gòu)建了2株艾樂(lè)替尼耐藥細(xì)胞株：H2228/CHR和ABC-11/CHR（含EML4-ALK突變體3b E6；A20），2株耐藥細(xì)胞株均未檢測(cè)到ALK的二次突變。但在H2228/150nM細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ALK表達(dá)逐漸減少，同時(shí)對(duì)艾樂(lè)替尼的敏感性也逐漸降低，最終在H2228/CHR細(xì)胞株中，出現(xiàn)了EML4-ALK的丟失并激活了IGF-1R、NRG1/HER3信號(hào)通路，下游AKT、ERK磷酸化增加，聯(lián)合應(yīng)用OSI-906（IGF-1R抑制劑）和厄洛替尼（EGFR抑制劑）能顯著抑制AKT存活通路，從而克服耐藥。有趣的是，ABC-11/CHR細(xì)胞系中沒(méi)有出現(xiàn)ALK丟失而出現(xiàn)了MET的活化，并發(fā)現(xiàn)MET的配體HGF表達(dá)顯著增加，加入外來(lái)的HGF刺激能使親本細(xì)胞系H2228和ABC-11對(duì)艾樂(lè)替尼耐藥，在加入抗-HGF抗體治療后，能降低MET的磷酸化水平及下游信號(hào)通路，增加艾樂(lè)替尼的敏感性。更令人驚喜的是，在加入0.1 μmol/L的克唑替尼后，MET和ALK的磷酸化和下游的AKT、ERK磷酸化都受到了明顯抑制，對(duì)艾樂(lè)替尼耐藥的ABC-11/CHR細(xì)胞株對(duì)克唑替尼表現(xiàn)出敏感性。

4 色瑞替尼

色瑞替尼是ATP競(jìng)爭(zhēng)性小分子ALK抑制劑，其靶點(diǎn)包括ALK、IGF-1R、InsR，其臨床效價(jià)比克唑替尼高20倍，對(duì)ALK激酶區(qū)的二次突變C1156Y、L1196M、G1269A、S1206Y、I1171T引起的克唑替尼耐藥具有顯著活性，且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移有效，對(duì)ALK激酶的IC50僅為0.15 nmol/L，2014年4月FDA批準(zhǔn)用于治療克唑替尼治療不耐受或疾病進(jìn)展的ALK+NSCLC。Friboulet等［24］在11例色瑞替尼耐藥的患者活檢標(biāo)本中檢測(cè)到5例患者激酶區(qū)域出現(xiàn)了二次突變：F1174C/V和G1202R。值得注意的是，G1202R是克唑替尼、艾樂(lè)替尼和色瑞替尼共同的耐藥突變，由于精氨酸空間效應(yīng)的影響，使ALK抑制劑與其靶點(diǎn)之間產(chǎn)生了空間位阻，影響了ALK抑制劑與ALK結(jié)合，從而導(dǎo)致耐藥。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)C1156Y、1151Tins和L1152R也介導(dǎo)了色瑞替尼的耐藥。Ryohei Katayama等［25］在色瑞替尼和克唑替尼耐藥的患者中發(fā)現(xiàn) P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）過(guò)表達(dá)，且在細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)P-gp/ABCB1能介導(dǎo)色瑞替尼和克唑替尼耐藥，沉默ABCB1基因或使用P-gp抑制劑能使細(xì)胞對(duì)藥物再次敏感。P-gp是一種能量依賴性藥物排出泵，可以與抗腫瘤藥物結(jié)合，也有ATP結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合藥物后利用釋放ATP的能量將藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷降低，從而引起耐藥。

5 二代Brigatinib

Brigatinib是一個(gè)強(qiáng)效的選擇性ALK、EGFR雙重抑制劑，對(duì)ALK激酶的IC50僅為0.62 nmol/L，對(duì)已知的ALK-TKIs耐藥的ALK二次突變有效，能對(duì)抗難治性耐藥突變G1202R［26］，已被FDA授予治療克唑替尼耐藥的ALK+NSCLC患者的突破性藥物資格和孤兒藥物資格，有望在2017年上市。在Ⅰ～Ⅱ期臨床研究中與Brigatinib相關(guān)的耐藥突變未見(jiàn)報(bào)道。頭對(duì)頭比較Brigatinib和克唑替尼用于既往未接受ALK-TKIs治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性ALK+NSCLC患者的安全性和療效的Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。

6 Lorlatinib

Lorlatinib是第三代ALK-TKI，是一種可逆、強(qiáng)效ATP競(jìng)爭(zhēng)性小分子ALK和ROS1抑制劑，相比現(xiàn)有的ALKTKIs，其潛在的優(yōu)勢(shì)在于有更高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性，且對(duì)ALK已知的耐藥突變具有較強(qiáng)的抑制作用［27］。Lorlatinib目前還處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，其耐藥信息僅在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上報(bào)道了1例［28］。該研究報(bào)道一名52歲的轉(zhuǎn)移性ALK+NSCLC女性患者，一線使用克唑替尼維持了18個(gè)月后出現(xiàn)了腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，活檢提示ALK激酶區(qū)域C1156Y突變，改用二代色瑞替尼，5周后肝臟發(fā)生轉(zhuǎn)移，再使用熱休克蛋白抑制劑無(wú)效，換用培美曲塞+卡鉑緩解了6個(gè)月，化療進(jìn)展后再次接受克唑替尼治療，結(jié)果無(wú)效；患者隨即加入LorlatinibⅠ期臨床試驗(yàn)，8個(gè)月后肝臟病灶惡化，再次活檢提示C1156Y+L1198F雙突變，兩者突變頻率相似，且發(fā)生在同一等位基因上，而克唑替尼可能抑制這種復(fù)雜突變，患者再次使用克唑替尼治療，腫瘤迅速緩解，并持續(xù)6個(gè)月，疾病再次進(jìn)展時(shí)，活檢已無(wú)L1198F突變，患者最終因嚴(yán)重的肝衰竭死亡。進(jìn)一步對(duì)ALK突變進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和生化特征分析，驗(yàn)證了C1156Y能引起克唑替尼和色瑞替尼耐藥；而L1198靠近ATP結(jié)合位點(diǎn)，亮氨酸被苯丙氨酸替換后產(chǎn)生的空間位阻干擾了腈類Lorlatinib結(jié)合?？诉蛱婺釋?duì)L1198F的敏感，及L1198F與克唑替尼親和力的增加，抵消了C1156Y激酶活性的增加，使雙突變對(duì)克唑替尼恢復(fù)敏感?；颊咴谡麄€(gè)治療過(guò)程中，反復(fù)進(jìn)行活檢，提示重復(fù)活檢對(duì)復(fù)發(fā)性患者十分重要，活檢樣本的分子分析，有助于更好地了解耐藥機(jī)制，從而進(jìn)一步選擇最優(yōu)的治療藥物。

7 小結(jié)

隨著EML4-ALK的發(fā)現(xiàn)及ALK-TKIs的快速發(fā)展，ALK陽(yáng)性患者的個(gè)體化治療精準(zhǔn)有效，但由于長(zhǎng)期治療最終導(dǎo)致獲得性耐藥，嚴(yán)重限制了藥物的臨床應(yīng)用。ALK-TKIs的耐藥機(jī)制復(fù)雜，在同一個(gè)體可能會(huì)有幾種耐藥機(jī)制共存，比如在ALK激酶區(qū)域出現(xiàn)雙突變，或是既存在ALK突變又存在旁路的激活，且不同的靶向藥物可能存在共同的耐藥機(jī)制，區(qū)分不同的耐藥模式對(duì)后續(xù)治療至關(guān)重要。隨著研究的深入，越來(lái)越多的耐藥機(jī)制被認(rèn)識(shí)，包括ALK激酶區(qū)域的二次突變、融合基因擴(kuò)增、旁路激活、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，了解藥物治療失敗的內(nèi)在原因能夠更合理地應(yīng)用TKIs，并使其臨床受益最大化。在臨床工作中，當(dāng)患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)，需要進(jìn)行重復(fù)的活檢采樣，通過(guò)組織活檢明確獲得性耐藥的分子機(jī)制，進(jìn)而確定更換TKIs的精確順序，或者聯(lián)合其他TKIs、熱休克蛋白 90（HSP90）抑制劑、新突變靶標(biāo)抑制劑、化療等。未來(lái)需找到一種最優(yōu)的方法，更好地篩選出優(yōu)勢(shì)人群，并監(jiān)測(cè)耐藥發(fā)生，進(jìn)而指導(dǎo)繼發(fā)耐藥后的靶向治療策略及使用合理的聯(lián)合治療方案。新興的液體活檢能解決組織活檢實(shí)施困難的問(wèn)題，但仍需要不斷提高液體活檢技術(shù)降低假陰性的發(fā)生，進(jìn)而更好地為ALKTKIs耐藥群體服務(wù)。隨著ALK-TKIs耐藥分子機(jī)制的日漸明朗，更多針對(duì)耐藥機(jī)制的抑制劑正在被研發(fā)，相信不久的將來(lái)，ALK陽(yáng)性的NSCLC患者能實(shí)現(xiàn)真正意義上的個(gè)體化治療，獲得更大的生存受益。

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［2017-03-14收稿］［2017-05-11修回］［編輯 江德吉］

R734.2

A

1674-5671（2017）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260357）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015GXNSFAA139162）

周韶璋。E-mail：zhoushaozhang@qq.com